Le IgG naturali cross-reattive che riconoscono L. Major promuovono l'internalizzazione del parassita da parte delle cellule dendritiche e promuovono l'immunità protettiva

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Messaggi chiave

• Usando diversi topi geneticamente modificati, abbiamo scoperto che questi anticorpi possono essere IgG, non solo IgM.

Parole chiave

Leishmania major · Cellule dendritiche · Cellule B · IgG naturali

introduzione

Infezioni da Leishmania spp. rappresentano un onere importante nei paesi endemici. La manifestazione della malattia varia dalla leishmaniosi cutanea autolimitante alla malattia disseminata, ricorrente, mucocutanea e viscerale. La leishmaniosi viscerale non trattata rappresenta una grave minaccia per la vita dell'ospite. Non esiste ancora un vaccino. Guarigione e per tutta la vitaimmunitàcontro questo importante patogeno intracellulare dipendono dallo sviluppo di cellule Th1/Tc1 produttrici di IFN, mentre la persistenza del parassita e la progressione della malattia sono associate alla dominanza delle cellule Th2, alle cellule T regolatorie e/o alle risposte Th17. Il rilascio di IFN porta alla produzione di NO che elimina i parassiti.Immunità protettivaè indotta da cellule dendritiche (DC) infette. Dopo l'inoculazione di Leishmania major nella pelle da parte del flebotomo, le forme di vita del parassita promastigote vengono ingerite dai macrofagi residenti nella pelle (MΦ) e dai neutrofili. All'interno di MΦ, i parassiti si trasformano in forme di vita amastigote non flagellate e si replicano. Successivamente, gli amastigoti rilasciati vengono assorbiti da altre cellule ospiti, come DC. Le DC infette processano gli antigeni del parassita e migrano verso i linfonodi drenanti e le cellule T primarie. Il rilascio di IL-12, così come di altre citochine da DC infette, dirige l'educazione Th1/Tc1 delle cellule T specifiche del parassita.

Mentre MΦ utilizza il recettore del complemento (CR)3 per l'assorbimento del parassita, in DC, Fc RI/III è responsabile diparassitainteriorizzazione. È interessante notare che, all'inizio, l'assorbimento del parassita associato a CR3- porta al silenziamento del MΦ infetto, mentre nelle infezioni accertate, l'assorbimento di amastigoti mediato da Fc R da parte di MΦ induce la produzione di IL-10 antinfiammatoria promuovendo lo sviluppo di Th2/Treg e persistenza del parassita. L'assorbimento del parassita mediato da Fc R nelle DC, al contrario, induce l'attivazione cellulare, l'innesco delle cellule T CD4 e anche la presentazione incrociata dell'antigene. Pertanto, l'assorbimento del parassita mediato da anticorpi da parte delle DC è importante per lo sviluppo della protezione contro il parassita. La produzione di IgG anti-Leishmania è quindi un prerequisito per un efficiente (cross-) priming di cellule Th1/Tc1 specifiche per Leishmania. In linea, in assenza di cellule B, lo sviluppo della malattia era più grave con volumi di lesione maggiori, carichi parassitari più elevati, innesco ritardato delle cellule T e ridotta produzione di IFNΓ. In precedenza, abbiamo dimostrato che le IgG specifiche per Leishmania erano presenti nei sieri al momento dell'accumulo di DC nelle lesioni.

Rimane una questione aperta come si sviluppi la risposta iniziale delle cellule B al parassita stesso in assenza di innesco delle cellule B da parte delle DC infette. I cosiddetti anticorpi naturali che riconoscono Leishmania spp. può facilitare prestointernalizzazione del parassitada DC. Inoltre, poiché le membrane dei parassiti contengono fosfatidilserina simile ai corpi apoptotici,cross-reattivogli anticorpi possono svolgere un ruolo. Nel presente studio, abbiamo valutato se gli anticorpi anti-fosfolipidi generati, ad esempio, durante l'eccessiva morte cellulare o le IgG naturali che riconoscono la Leishmania presente negli animali non immuni contribuiscano all'assunzione di DC da parte del parassita per promuovere l'innesco delle cellule B e T. Abbiamo scoperto che gli anticorpi anti-fosfolipidi del siero murino o umano così come le "IgG naturali" nel normale siero di topo (NMS) si legano ai parassiti della Leishmania, il che è sufficiente per promuovereparassitainteriorizzazioneda DC e promuove migliori esiti della malattia in vivo.

materiale e metodi

Animali

Topi C57BL/6 di sei-otto settimane sono stati acquistati da Janvier. I topi µMT carenti di cellule B sono stati generosamente forniti da Hansjörg Schild, Istituto di immunologia, Centro medico universitario di Magonza. I topi IgGi e IgMi (entrambi su sfondo C57BL/6) sono stati descritti in precedenza. Tutti gli animali sono stati alloggiati in condizioni specifiche prive di agenti patogeni (SPF) nel Translational Animal Research Center (TARC) dell'Università Johannes Gutenberg, Mainz. Tutti gli esperimenti sono stati condotti con una licenza approvata dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della regione Renania-Palatinato.

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Parassiti e infezioni 

Amastigoti o promastigoti metaciclici di L. major clone VI (MHOM/IL/Friedlin) sono stati preparati come precedentemente descritto. Gli amastigoti sono stati isolati da orecchie infette di topi µMT carenti di cellule BALB/c o B come descritto in precedenza. I parassiti isolati sono stati opsonizzati con il 5% di NMS, IMS o anti-PL per 10 minuti a 37 gradi e lavati prima delle infezioni in vitro o in vivo.

Sieri, arricchimento di IgG e analisi del legame del parassita

Il siero di topo normale (NMS) è stato generato da topi C57BL/6 naïve, mentre il siero immunitario (IS) è stato prelevato da topi guariti che erano stati infettati con promastigoti metaciclici 2 × 10E5 di L. major per maggiore o uguale a 6 settimane. I sieri di anticorpi antifosfolipidi (PL) sono stati generati mediante immunizzazione ripetuta con timociti apoptotici. Prima della raccolta del siero, il successo dell'immunizzazione è stato verificato valutando il legame specifico delle IgG alle cellule apoptotiche mediante citometria a flusso o in un ELISA specifico per glicoproteina. Gruppi di topi C57BL/6 sono stati immunizzati con 2-glicoproteina ricombinante ( 2G) in presenza dell'adiuvante di Freud (FA); il siero contenente anti- 2G è stato raccolto dopo 4 settimane. Topi BALB/c con infezione da L. major di 5-6-settimane di IgG anti-Leishmania, IgG specifiche per PL o b2G, sono stati preparati da sieri raggruppati utilizzando colonne di proteina G (Pierce Chemical Co.) seguendo il protocollo del produttore. I sieri sono stati conservati a -20 gradi prima della purificazione delle IgG. Le IgG purificate sono state conservate a 4 gradi (0,8 mg/mL) in PBS prima dell'uso.

Il siero umano normale (NHS) proveniva da soggetti sani di controllo e il siero contenente anticorpi anti-Leishmania è stato ottenuto da pazienti con leishmaniosi cutanea (LM) del Marocco. È stato utilizzato anche il siero di pazienti con sindrome da anticorpi antifosfolipidi (PL).

I parassiti (promastigoti o amastigoti) sono stati colorati per Ig associate alla superficie utilizzando anticorpi secondari isotipo-specifici reattivi con Ig di topo: anti-IgM (Serotec), anti-IgG1 (A85-1) e anti-IgG2a/b ( R2-40, tutti di BD Biosciences). Dopo la colorazione, i parassiti sono stati lavati con PBS/2% BSA, fissati e analizzati mediante citometria a flusso.

Stimolazione in vitro

La DC derivata dal midollo osseo è stata generata in terreni RPMI/5% FCS integrati con IL-4 (10 µg/ml) e GM-CSF (10 µg/ml) per 6 giorni come descritto in precedenza. Le cellule sono state raccolte il giorno 6 come DC immature. 2 × 105 DC sono stati co-coltivati ​​con amastigoti opsonizzati da topi BALB/c o µMT infetti o coltivati ​​con promastigoti metaciclici opsonizzati (MOI 1:5) per 18 ore. Successivamente, le cellule sono state raccolte e i cytospin sono stati generati come descritto in precedenza. Le cellule colorate con DifQuick sono state analizzate per la presenza di parassiti intracellulari ed extracellulari. Sono state contate almeno 200 cellule per campione.

Infezioni in vivo

I volumi delle lesioni sono stati misurati settimanalmente in tre dimensioni e sono riportati come ellissoidi [(a/2×b/2×c/2)×4/3×π]. I parassiti presenti nel tessuto lesionale sono stati enumerati utilizzando un saggio di diluizione limitante come descritto in precedenza.

Per la misurazione della produzione di citochine antigene-specifiche, sono state recuperate cellule LN drenanti di topi C57BL/6 infetti e sono state preparate sospensioni unicellulari. Un milione di cellule LN/200 μL di RPMI 1640 completo (Biochrome) sono state aggiunte a 96-pozzetti in presenza di 25 ug/mL di SLA. I surnatanti sono stati raccolti 48 ore dopo la stimolazione e analizzati utilizzando ELISA specifici per IFNΓ (R&D Systems), nonché IL-4 e IL-10 (BD).

DC umana mieloide infettata da parassiti opsonizzati

Il CD1c umano mieloide più DC (hDC) è stato isolato dal sangue periferico secondo le istruzioni del produttore utilizzando un sistema di isolamento cellulare magnetico e il kit di isolamento DC umano BDCA-1 (Miltenyi, Germania). 1,5 × 107 cellule sono state placcate in 2,5 mL di plasma autologo RPMI 1640/2%. Per arricchire la purezza, le cellule sono state lavate con PBS caldo e infine coltivate con X-VIVO 15/plasma (1%) integrato con IL-4 umano ricombinante (150 U/mL) e GM-CSF (400 U/mL) . Le hDC immature sono state raccolte il giorno 6. 2 × 105 hDC sono state co-coltivate con amastigoti opsonizzati da topi µMT infetti o coltivate con promastigoti metaciclici opsonizzati (MOI 1:5) per 18 ore. Successivamente, le cellule sono state raccolte e i cytospin sono stati generati come descritto in precedenza. Le cellule colorate con DifQuick sono state analizzate per la presenza di parassiti intracellulari ed extracellulari. Sono state contate almeno 200 cellule per campione.

analisi statistica

L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software StatView e il test t di Student non accoppiato.

Risultati

Il siero contenente anticorpi antifosfolipidi si lega a L. major

Poiché i parassiti possono entrare nelle cellule ospiti attraverso un processo chiamato "mimetismo apoptotico" e poiché le principali forme di vita di L. esprimono fosfolipidi sulla loro superficie, abbiamo generato siero contenente anticorpi antifosfolipidi (PL) utilizzando protocolli stabiliti. A questo scopo gruppi di topi C57BL/6 sono stati infettati con L. major, immunizzati con timociti apoptotici in presenza di adiuvante di Freud (FA). Poiché la 2-glicoproteina ( 2G) è l'antigene primario nella sindrome antifosfolipidica (APS), abbiamo anche immunizzato i topi con 2G in presenza di FA per ottenere siero contenente anticorpi anti- 2G. Come controlli, sono stati utilizzati siero di topo normale (NMS) da topi C57BL/6 non infetti e siero immunitario (IS) da topi infetti da L. major.

Per testare se questi diversi sieri di topo da topi naïve o immunizzati contengano anticorpi che si legano a L. major, abbiamo prima valutato il legame dell'anticorpo all'antigene del parassita mediante ELISA, usando il lisato di congelamento-scongelamento di L. major promastigote (antigene solubile di Leishmania, SLA) come substrato (Fig. 1A, colonne nere). Come standard, abbiamo usato IgG isolate dai sieri di topi infetti da L. major. È interessante notare che il siero IS e PL conteneva livelli comparabili di legame anticorpale al lisato di Leishmania, che era 3-4 volte superiore rispetto al legame osservato con NMS o sieri di topi immunizzati con il solo adiuvante. Inoltre, anche il siero contenente anticorpi 2G è legato allo SLA. Utilizzando un ELISA specifico per 2G (colonne bianche), abbiamo identificato alti livelli di 2G-IgG nel siero, mentre i livelli di 2G IgG in tutti gli altri sieri erano al di sotto del limite di rilevamento.

Fico. 1 Detection of L. major cross-reactive antibodies in serum of mice containing antiphospholipid antibodies. Serum was obtained from groups of C57BL/6 mice that were left untreated (normal mouse serum, NMS) or which were infected for>6 settimane con 2× 105 L. major (siero immunitario, IS). Un altro gruppo è stato ripetutamente immunizzato con timociti apoptotici (Ab anti-fosfolipidi, a-PL) o 2-glicoproteina ricombinante (a- 2G) in presenza di adiuvante Freuds (FA) incompleto, FA è stato utilizzato come controllo. Un siero è stato testato per la reattività in un ELISA utilizzando il lisato di L. major come substrato o 2-glicoproteina. L'ELISA è stato sviluppato utilizzando IgG anti-murine. I dati sono espressi come media (±SEM, n maggiore o uguale a 1). B I promastigoti metaciclici di L. major sono stati ottenuti da colture in fase stazionaria (n{{10}}). Gli amastigoti C sono stati preparati da lesioni di topi µMT carenti di cellule B (n=3). Le preparazioni del parassita B e C sono state opsonizzate con sieri diversi (5 percento, 1 0 min, 37 gradi). Il legame anticorpale è stato valutato mediante FACS con anticorpi secondari anti-topo. Il legame di Ig è stato calcolato sui livelli basali di parassiti non opsonizzati (*p Inferiore o uguale a 0,05,**p Inferiore o uguale a 0,005 e ***p Inferiore o uguale a 0,002)

Successivamente, abbiamo incubato promastigoti metaciclici in fase infettiva di L. major con diverse concentrazioni di IgG arricchite da sieri IS, PL o 2G. Abbiamo osservato un legame dose-dipendente di IgG derivate da IS e 2G con un massimo di 100 ng/mL (Fig. 1B). Non è stato rilevato il legame delle IgG derivate da PL ai promastigoti di L. major.

Inoltre, abbiamo incubato L. major amastigoti isolati da lesioni di topi μMT carenti di cellule B con i diversi sieri per 10 minuti. I parassiti sono stati quindi ampiamente lavati e, successivamente, l'anticorpo legato alla superficie è stato rilevato mediante citometria a flusso dopo l'etichettatura con anti-IgG1 coniugato con PE, antiIgG2a / b o anti-IgM (Fig. 1C). Come previsto, IS conteneva IgM, IgG1 e IgG2a/b specifiche per Leishmania. Confermiamo anche il lavoro precedente, poiché abbiamo rilevato IgM specifiche per Leishmania nel pool dei cosiddetti "Ab naturali". È interessante notare che abbiamo anche trovato IgG e IgM nel siero PL così fortementeha avuto una reazione incrociatacon la superficie di L. major amastigotes. Gli anticorpi IgG contenenti anti- 2G non si legavano alla Leishmania, ma il siero 2G conteneva IgMreazione incrociatacon superficie amastigotica.

Gli anticorpi cross-reattivi mediano l'internalizzazione del parassita da parte delle DC

Abbiamo poi inteso valutare se i diversi anticorpi IgG in grado di legarsi alla superficie degli amastigoti di L. major sono funzionalmente attivi. Pertanto, abbiamo generato DC utilizzando colture di cellule di midollo osseo (BM) integrate con GMCSF e IL-4. Le BM-DC sono state raccolte come cellule immature il giorno 6 e placcate a 2 × 105 cellule/mL. Amastigoti parassita derivati ​​da zampe infette di topi μMT wild-type BALB/c o B carenti di cellule sono stati opsonizzati con sieri diversi (5% in volume), lavati estensivamente e quindi aggiunti a DC in un rapporto parassita/cellula di 5:1. Dopo 18 ore, le cellule sono state raccolte, lavate e cytospin.

Parassitainteriorizzazioneè stato determinato su vetrini DifQuickstained a 100 × (Fig. 2). Come descritto, l'assorbimento dei parassiti isolati dai topi µMT era significativamente compromesso. La pre-incubazione con NMS ha leggermente migliorato l'assorbimento del parassita, mentre l'incubazione con IS ha portato alla "normalizzazione" dei tassi di infezione DC ai livelli osservati con amastigoti derivati ​​da BALB/c. Da notare che l'opsonizzazione del parassita con PL ha anche migliorato significativamente e chiaramente i tassi di infezione da DC di circa il 100%. In linea con i livelli più bassi di opsonizzazione IgG degli amastigoti con siero contenente b2G (confronta Fig. 1C), questo ha anche aumentato i tassi di infezione di DC, ma in misura minore.

Figura 2L'opsonizzazione di L. major con anticorpi cross-reattivi porta a un maggiore assorbimento del parassita da parte delle DC. I BMDC C57BL/6 immaturi (2 × 1 0 5) sono stati co-coltivati ​​con amastigoti da topi µMT BALB/c o con deficit di cellule B (1:3). Prima della co-incubazione, gli amastigoti sono stati opsonizzati con siero di topo normale (NMS), siero immunitario (IS), siero contenente anticorpi anti-fosfolipidi ottenuti mediante immunizzazione ripetuta con timociti apoptotici (aPL) o siero contenente anti- 2 glicoproteina anticorpi (2G). Dopo 18 ore, i tassi di infezione sono stati determinati su cytospin mediante microscopia ottica (n=3, *p minore o uguale a 0.05,**p minore o uguale a 0,005, e ***p minore o uguale a 0,002 rispetto ai controlli non opsonizzati)

Gli anticorpi antifosfolipidi cross-reattivi migliorano gli esiti della malattia nella leishmaniosi cutanea

In esperimenti successivi, abbiamo voluto valutare se l'opsonizzazione del parassita concross-reattivogli anticorpi alterano gli esiti della malattia in vivo. A tal fine, i promastigoti metaciclici isolati e arricchiti da colture di parassiti sono stati opsonizzati con sieri diversi come descritto sopra. Il parassita opsonizzato con NMS fungeva da controllo negativo. Dopo un ampio lavaggio del parassita, gruppi di cinque topi C57BL/6 sono stati infettati per via intradermica con 103 L. major. Lo sviluppo della lesione è stato monitorato per circa 4 mesi. In linea con i risultati precedenti, i parassiti opsonizzati con IS hanno indotto lesioni dell'orecchio più piccole in linea con una maggiore frequenza di DC cutanee infette nei primi momenti (Fig. 3). Sorprendentemente, i parassiti opsonizzati con PL o 2G hanno promosso in modo simile esiti della malattia migliorati in modo simile, come determinato dal volume delle lesioni ridotto del 50% tra la settimana 5 e 8 dopo l'infezione.

Gli anticorpi antifosfolipidi cross-reattivi migliorano gli esiti della malattia nella leishmaniosi cutanea

In esperimenti successivi, abbiamo voluto valutare se l'opsonizzazione del parassita concross-reattivogli anticorpi alterano gli esiti della malattia in vivo. A tal fine, i promastigoti metaciclici isolati e arricchiti da colture di parassiti sono stati opsonizzati con sieri diversi come descritto sopra. Il parassita opsonizzato con NMS fungeva da controllo negativo. Dopo un ampio lavaggio del parassita, gruppi di cinque topi C57BL/6 sono stati infettati per via intradermica con 103 L. major. Lo sviluppo della lesione è stato monitorato per circa 4 mesi. In linea con i risultati precedenti, i parassiti opsonizzati con IS hanno indotto lesioni dell'orecchio più piccole in linea con una maggiore frequenza di DC cutanee infette nei primi momenti (Fig. 3). Sorprendentemente, i parassiti opsonizzati con PL o 2G hanno promosso in modo simile esiti della malattia migliorati in modo simile, come determinato dal volume delle lesioni ridotto del 50% tra la settimana 5 e 8 dopo l'infezione.

Successivamente, abbiamo utilizzato amastigoti µMT incubati con 100 µg di IgG arricchiti da NMS, IS o PL (Fig. 4). Ancora una volta, abbiamo osservato che entrambe le IgG di IS o PL hanno provocato una malattia più lieve con lesioni più piccole, rispetto ai parassiti non opsonizzati (Fig. 4A). In linea, i carichi parassitari del tessuto lesionale determinati nella settimana 6 post-infezione hanno rivelato (significativamente) carichi parassitari più piccoli nelle infezioni iniziate in presenza di anticorpi che legano il parassita (Fig. 4B). La restimolazione antigene-specifica delle cellule linfonodali drenanti con SLA ha rivelato livelli inalterati di IFN, mentre livelli più bassi di IL-4 e IL-10 sono stati trovati in quei topi infettati da parassiti IgG-opsonizzati (Fig. 4C) . Ciò è in linea con la riduzione delle dimensioni delle lesioni poiché il lavoro precedente ha dimostrato che l'eliminazione del parassita nei topi dipende dall'attivazione di MΦ infetto da parte dell'IFN lesionale, che è contrastato da IL-4 e, cosa molto importante, IL-10 . Pertanto, gli effetti di IL-10 su MΦ infetto hanno portato alla persistenza del parassita. Pertanto, il rapporto tra IFN da un lato e citochine associate a Th2/Treg come IL-4 e IL-10 sembra essere il più rilevante per l'esito della malattia.

È interessante notare, tuttavia, che in questo contesto sono stati osservati anche volumi di lesione più piccoli, quando l'IgG da NMS è stata utilizzata per l'opsonizzazione indicando la presenza dicross-reattivoanticorpi naturali anche nel siero di topi naïve.

Sia gli anticorpi specifici per la Leishmania che quelli cross-reattivi possono sostituire la mancanza genetica di IgG

Per analizzare meglio il contributo specifico dei sottotipi di immunoglobuline nella risposta alla Leishmania, abbiamo fatto uso di topi IgMi e IgG1i che abbiamo precedentemente generato. I topi IgMi sono topi in cui tutte le cellule B esprimono IgM, ma non possono cambiare classe né secernere anticorpi. Nei topi IgG1i, tutte le cellule B si sviluppano utilizzando IgG1 come recettore delle cellule B, ma anche queste cellule non possono cambiare classe ma sono in grado di secernere anticorpi IgG1. Abbiamo infettato topi IgMi e IgG1i su background genetico C57BL/6 con 103 L. major. Abbiamo scoperto che la presenza di IgG1 nei sieri era sufficiente affinché i topi montassero una risposta completa al parassita, simile agli animali selvatici (Fig. 5A). Al contrario, l'assenza di anticorpi secreti osservati nei topi IgMi era sufficiente a ritardare il recupero dei topi (Fig. 5A).

Successivamente, abbiamo ricostituito i topi IgMi oi controlli wild-type con NMS o IS e poi li abbiamo infettati con L. major promastigotes. Come previsto, in entrambi i ceppi di topo, la ricostituzione di IS ha indotto lesioni significativamente più piccole in vivo, confermando che l'assorbimento accelerato del parassita mediato da IgG da parte di DC promuove un miglioramento anti-Leishmaniaimmunità(figura 5B). Infine, abbiamo valutato l'esito della malattia dopo l'utilizzo di parassiti opsonizzati. Prima dell'infezione dei topi IgMi, i parassiti erano opsonizzati con IgG arricchiti da siero NMS, IS o PL (Fig. 5C). In linea con l'esperimento mostrato in Fig. 5B, i parassiti opsonizzati da IS hanno facilitato una migliore difesa del parassita. Ancora una volta, gli anticorpi antifosfolipidi sono stati in grado di sostituire le IgG specifiche per Leishmania da IS in quanto entrambi gli anticorpi IgG legati a L. major promastigotes prima dell'infezione hanno promosso migliori esiti della malattia dei topi IgMi. I parassiti IS- e PL-opsonizzati hanno indotto volumi di lesione significativamente più piccoli e una guarigione più precoce rispetto ai parassiti non opsonizzati.

È importante sottolineare che la somministrazione di NMS ai topi IgMi ha "normalizzato" il loro fenotipo all'esito della malattia osservato nei topi C57BL/6 (Fig. 5B). Questi risultati sono in linea con i nostri dati mostrati sopra, suggerendo che NMS contiene anche across-reattivoisotipo di anticorpo IgG in grado di legarsi ai parassiti con conseguenti conseguenze funzionali in vitro e in vivo. Un'ulteriore conferma viene dai topi IgMi infettati da parassiti rivestiti di NMS, che sono stati anche in grado di controllare meglio l'infezione (Fig. 5C).

Fico. 4I parassiti opsonizzati da anticorpi inducono un'immunità efficiente in µMT carente di cellule B. I parassiti sono stati opsonizzati con siero di topo normale (NMS), siero immunitario (IS), siero contenente anticorpi antifosfolipidi (a-PL) o — solo topi C57BL/6 — siero contenente anticorpi anti- 2 glicoproteina ( 2G) nel presenza dell'adiuvante di Freud (FA). Gruppi di topi maggiori o uguali a 5 µMT sono stati infettati con 103 promastigoti metaciclici opsonizzati di L. major. Lo sviluppo della lesione è stato valutato settimanalmente. B Nella settimana 6, i carichi parassitari lesionali di topi µMT infetti sono stati determinati limitando il test di diluizione. Vengono mostrati i numeri dei singoli parassiti; mezzi espressi bar. C I profili delle citochine delle cellule drenanti µMT LN sono stati determinati mediante restimolazione con antigene Leishmania solubile (SLA). Il rilascio di IFNΓ, IL{{10}} e IL-10 in 48-h surnatanti è stato valutato mediante ELISA (media ± SEM, n=15 topi/gruppo da individui indipendenti 3 esperimenti, *p minore o uguale a 0.05, **p minore o uguale a 0,005 e ***p minore o uguale a 0,002 rispetto a topi infettati da parassiti non opsonizzati)

Il siero umano contiene gli anticorpi cross-reattivi del parassita funzionalmente attivi

Per testare la rilevanza dei nostri risultati per l'uomo, i promastigoti o gli amastigoti isolati da topi µMT carenti di cellule B sono stati opsonizzati con siero umano normale (NHS), siero di pazienti con infezione da L. major (LM) o siero di pazienti con APS (APS ). Le IgG legate alla superficie sui parassiti sono state determinate mediante citometria a flusso. È interessante notare che il siero LM si lega debolmente alle superfici dei promastigoti, ma fortemente agli amastigoti. È interessante notare che il siero APS conteneva livelli simili di IgGcross-reattivocon superfici parassite (Fig. 6A).

Le IgG sono state successivamente arricchite dai sieri LM usando colonne di proteina A (Fig. 6B). Questa e diverse concentrazioni di immunoglobuline per via endovenosa (IVIG) utilizzate per il trattamento di vari disturbi (immunitari) dei pazienti sono state successivamente utilizzate per l'opsonizzazione del parassita prima della citometria a flusso. Leishmania IgG è significativamente legata ai promastigoti e agli amastigoti di L. major. È interessante notare che le IVIG disponibili in commercio contenevano IgGha avuto una reazione incrociatasia con promastigote che con preparazioni parassitarie amastigote.

Infine, CD1c plus CD umano mieloide primario da buffy coat sono stati incubati con amastigoti µMT di L. major incubati con siero LM o siero da pazienti APS o IVIG (MOI 3; Fig. 7). Confermando i nostri dati murini utilizzando cellule umane abbiamo osservato che la presenza di IgG (cross-reattivoo specifico per Leishmania) sulle superfici di Leishmania è sufficiente per promuoverne il potenziamentoparassitainteriorizzazioneda DC. Il siero APS ha aumentato la percentuale di DC infette di quasi il 100%, mentre il siero LM e IVIG hanno migliorato l'assorbimento del parassita del 30% rispetto ai parassiti non opsonizzati. È interessante notare che il siero NMS conteneva anche la promozione delle IgG reattive al parassitaparassitainteriorizzazione.

Fico. 5 I topi C57BL/6, IgMi e IgGi ricostituiti con sieri diversi o infettati con diverse IgG purificate opsonizzate da L. major presentano esiti migliorati della malattia. Un gruppo di topi C57BL/6, C57BL/6 IgMi o IgGi maggiore o uguale a 5 è stato infettato con inoculi fisiologici a basso dosaggio di L. major (103 promastigoti metaciclici). B Una settimana prima dell'infezione, i topi IgMi C57BL/6 e B6 sono stati ricostituiti ip due volte con 100 µL di siero di topo normale (NMS) o di siero immunitario (IS). C Prima dell'infezione di topi IgMi, i parassiti sono stati opsonizzati con IgG arricchiti da sieri legandosi alle colonne di proteina A [siero di topo normale (NMS), siero immunitario (IS) o siero contenente anticorpi anti-fosfolipidi (a-PL)]. Lo sviluppo della lesione AC è stato valutato settimanalmente (media ± SEM, n=10 topi/gruppo da 2 esperimenti indipendenti, *p inferiore o uguale a 0,05, **p inferiore o uguale a 0,005 e *** p Inferiore o uguale a 0,002 rispetto a C57BL/6 [A], C57BL/6 o IgMi [B] o nessuno [C])

Fico. 6Gli anticorpi antifosfolipidi nei sieri umani reagiscono in modo incrociato con le molecole di superficie di L. major. Promastigoti metaciclici da colture in fase stazionaria o amastigoti lesionali di L. major isolati da topi µMT sono stati opsonizzati con diversi tipi di sieri umani (5%) o IgG purificate. Sieri umani normali (NHS) sono stati ottenuti da soggetti sani di controllo. Sono stati utilizzati anche sieri di pazienti con comprovata leishmaniosi cutanea (LM, acquisita in Marocco, n=4) e di pazienti con sindrome da antifosfolipidi (PL, n=3). B IgG è stato arricchito da sieri LM utilizzando colonne di proteina A (n=3). Sono state utilizzate diverse concentrazioni di immunoglobuline per via endovenosa (IVIG, n=2) (µg/mL). I parassiti A e B sono stati analizzati per il legame superficiale delle Ig umane totali mediante citometria a flusso. Il legame di Ig è stato calcolato in relazione ai livelli basali di parassiti non opsonizzati (media±SEM, *p minore o uguale a 0.05, **p minore o uguale a {{10 }}.005 e ***p Minore o uguale a 0.002)

Discussione

La guarigione dalla leishmaniosi cutanea richiede un efficiente innesco delle cellule T e il rilascio di IFN, entrambi i quali dipendono dalle DC infette per presentare gli antigeni alle cellule T naïve. A differenza della fagocitosi CR3-dipendente da MΦ, lo abbiamo dimostratoparassitainteriorizzazioneda DC avviene tramite Fc RI e Fc RIII, che possono sostituirsi a vicenda. Pertanto, topi con deficit di Fc-, Fc RI/Fc RIII e topi µMT con deficit di cellule B (tutti su sfondo C57BL/6) hanno sviluppato lesioni più grandi e ritardato la guarigione, rispetto ai topi wild-type, a causa di DC- priming delle cellule T dipendenti. Il nostro studio attuale conferma questa osservazione precedente, ma inoltre, i nostri dati che utilizzano topi IgMi e IgGi suggeriscono anche che gli anticorpi effettivamente secreti, e non la semplice presenza di cellule B, sono fondamentali per montare una risposta efficace al parassita. In quanto tali, simili ai topi carenti di cellule B, i topi IgMi con cellule B incapaci di produrre IgG hanno mostrato dimensioni delle lesioni maggiori rispetto ai topi IgGi o ai topi wild-type.

Poiché entrambi gli amastigoti NMS e IS-opsonizzati sono stati assorbiti in misura simile e i promastigoti NMS-opsonizzati non sono stati fagocitati dalle DC (con un legame efficiente delle IgM alla loro superficie), abbiamo concluso in precedenza che le IgM non sono necessarie per l'assorbimento del parassita. Nel presente studio, siamo stati in grado di confermare questi risultati utilizzando normali sieri di topo in topi che mancano del tutto di cellule B o che secernono solo anticorpi. Inoltre, siamo stati in grado di dimostrare che i sieri contenenti IgG1- erano in grado di migliorare l'ingresso degli amastigoti nelle DC umane e murine.

È rimasto irrisolto il modo in cui si sviluppa la risposta iniziale delle cellule B in assenza di DC infette. Una possibilità era che nel pool di IgG "naturali",cross-reattivogli anticorpi possono essere in grado di riconoscere i parassiti e fungere da sostituti degli anticorpi specifici per la Leishmania che si sviluppano successivamente (aumentando tra la settimana 4 e la settimana 6 dopo l'infezione). Oltre agli anticorpi antigene-specifici, i cosiddetti anticorpi naturali vengono prodotti dalle cellule B-1 sia nei topi che negli esseri umani dopo la nascita. Alcuni hanno la capacità di riconoscere gli autoantigeni; per molto tempo si è creduto che mancassero di specificità per gli antigeni estranei. Successivamente, i dati hanno fornito prove del fatto che le IgM naturali riconoscono diversi antigeni microbici e contribuiscono all'eliminazione dei patogeni. Recentemente, tuttavia, diversi studi hanno rivelato che le IgG naturali hanno un ruolo nellainnato immunitàanche. È stato dimostrato che interagisce con le lectine associate ai patogeni (ad es. MBL) e forma immunocomplessi per eliminare i patogeni. Si prevede inoltre che le IgG naturali legate ai patogeni interagiscano con altri PRR, come C1q, per attivare la via classica del complemento. È stato dimostrato che le IgG naturali collaborano specificamente con le lectine associate ai patogeni per suscitare un'efficace azione antimicrobica contro l'infezione opportunistica da Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus.

Durante la morte delle cellule apoptotiche, si osserva l'esposizione alla fosfatidilserina (PS) sui corpi apoptotici. Il riconoscimento dell'ospite di PS sulla superficie delle cellule morenti o morte tramite anticorpi è un passo importante nella loro eliminazione. In un processo chiamato "mimetismo apoptotico", è noto che i parassiti della Leishmania espongono anche PS sulla propria superficie che funge da segnale "mangiami" per le cellule fagocitiche, simile a quanto visto dalle cellule apoptotiche. Inoltre, alcuni dei promastigoti in fase infettiva muoiono (senza il coinvolgimento delle caspasi) ed espongono la PS stessa. Le forme di vita obbligate degli amastigoti intracellulari, tuttavia, espongono tutte la PS sulla loro superficie consentendo loro di entrare nelle cellule ospiti in modo efficiente. Abbiamo ora valutato se gli anticorpi PL indotti artificialmente sono in grado di riconoscere i parassiti della Leishmania e se questi sono funzionalmente attivi per facilitare l'ingresso del parassita nelle cellule ospiti pertinenti. Abbiamo osservato che gli anticorpi anti-fosfolipidi murini e umani legano le forme di vita di Leishmania. Utilizzando diversi approcci, abbiamo identificatocross-reattivoanticorpi nel siero PL che sembra legarsi preferenzialmente ai fosfolipidi di superficie di L. major. È interessante notare che, anche se i parassiti promastigoti esprimono anche questi fosfolipidi, come dimostrato utilizzando l'antigene parassita solubile di questa forma di vita del parassita in un ELISA, i fosfolipidi di superficie sembrano essere più fortemente esposti sugli amastigoti. Inoltre, abbiamo dimostrato che questa opsonizzazione IgG era sufficiente per promuovere l'assorbimento del parassita da parte di DC. È importante sottolineare che, in vivo, i parassiti opsonizzati con PL hanno indotto un migliore esito della malattia con volumi di lesione più piccoli e una risoluzione delle lesioni precedente. Pertanto, in linea con le precedenti osservazioni del nostro gruppo, a causa di una maggiore infezione da DC in presenza di(cross-reattivo)IgG sui parassiti, è stata indotta un'induzione preferenziale di cellule Th1/Tc1 associata a un numero ridotto di cellule Th2 e Treg e quindi a un migliore esito della malattia.

Figura 7Le DC mieloidi primarie da sangue umano interiorizzano preferenzialmente i parassiti concross-reattivoIgG antifosfolipidi legate alla loro superficie. Il CD1a più DC umano mieloide è stato isolato dai buffy coat utilizzando microsfere MACS e placcato a 2 × 1 0 5 cellule/mL. Amastigoti isolati da topi µMT sono stati incubati con siero al 5% o 10 µg/mL di IVIG prima della coincubazione con DC (1:3). Dopo 18 ore, i tassi di infezione sono stati determinati su cytospin mediante microscopia ottica (n=3, *p inferiore o uguale a 0,05 e ***p inferiore o uguale a 0,002 rispetto ai controlli non opsonizzati)

È interessante notare che abbiamo scoperto che i parassiti opsonizzati con NMS hanno promosso esiti di malattia migliori rispetto ai parassiti non opsonizzati che indicano la presenza di IgG naturali in NMS in grado di riconoscere la Leishmania. Questo era meglio visibile nelle IgMi (prive di cellule B in grado di produrre qualsiasi IgG) sostituite con NMS. Qui, le dimensioni delle lesioni chiaramente più grandi dei topi IgMi sono state ridotte a quelle dei topi C57BL/6 wild-type (Fig. 5). Tuttavia, la presenza di naturale, Leishmaniacross-reattivoL'IgG è stata osservata anche nei topi wild-type infettati da parassiti NMS-opsonizzati rispetto ai parassiti non opsonizzati. La specificità di queste IgG naturali nel siero umano e murino non è ancora chiara. Si è tentati di ipotizzare che questi siano anche anticorpi che riconoscono la PS sulle superfici del parassita poiché si legano preferenzialmente agli amastigoti con nota maggiore esposizione di PS rispetto ai promastigoti.

Abbiamo scoperto che il siero di soggetti umani sani di controllo (provenienti da una regione in cui la leishmaniosi è segnalata solo come malattia da viaggio e nessuna storia di precedente infezione) conteneva anche IgG in grado di legarsi a L. major amastigotes e promuovere un maggiore assorbimento del parassita da parte di DC. È importante notare che l'IVIG utilizzato per il nostro studio è preparato in Germania (non endemico per la leishmaniosi). È interessante notare che le IgG umane arricchite da IVIG di individui negativi alla Leishmania contenevano quindi IgG in grado di legare sia i promastigoti che (probabilmente a causa della maggiore esposizione a PS) L. major amastigotes. In linea, il siero di pazienti con APS con alti livelli di anticorpi antifosfolipidi conteneva IgG che si legavano preferenzialmente agli amastigoti, meno ai promastigoti. Sia le IgG dei sieri APS che le IgG delle IVIG hanno promosso l'assorbimento potenziato del parassita da parte delle DC umane primarie a un livello paragonabile (o anche migliore nel caso dei sieri APS contenenti PL) alle IgG derivate dal siero immunitario dei pazienti affetti da leishmaniosi.

In sintesi, i nostri dati mostrano che i normali sieri murini così come quelli umani, anche prelevati da individui mai esposti a Leishmania, contengono anticorpi IgG che sono in grado di legarsi a questo parassita, facilitandone l'assorbimento da parte delle DC e potenziando una risposta immunitaria protettiva del ospite. Anche se l'antigene o gli antigeni di Leishmania riconosciuti non sono del tutto chiari, parte della reattività può essere diretta contro i fosfolipidi più abbondanti sull'amastigote, rispetto alle superfici del promastigote. I nostri risultati possono aprire la strada alla progettazione di una migliore terapia per questo parassita e possono anche servire come precauzione di prima linea per le persone che si recano in aree infette da Leishmania.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano sinceramente Mark C. Udey e Philipp von Landenberg per le utili discussioni e per aver fornito campioni di pazienti.

Contributo dell'autore 

FD, SLK e ST hanno eseguito gli esperimenti descritti in questo manoscritto. ST, AW e EvS si sono assicurati i finanziamenti per il progetto e hanno supervisionato il lavoro. AW e EvS hanno scritto il manoscritto.

Finanziamento

Finanziamenti ad accesso aperto abilitati e organizzati da Projekt DEAL. Lo studio è stato sostenuto dai fondi del DFG (SFB 490 per EvS e AW e SFB 1292 per EvS, AW e ST) e del Centro di medicina molecolare (CMMC) di Colonia per EvS.

Disponibilità di dati e materiali 

Non applicabile.

Dichiarazioni

Approvazione etica e consenso alla partecipazione

Tutti gli esperimenti con i topi sono stati condotti secondo la guida dello stato della Renania Pfalz.

Consenso alla pubblicazione

Tutti gli autori acconsentono alla pubblicazione.

Interessi conflittuali

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

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