Attuali applicazioni cliniche della terapia genica in vivo con AAV Parte 5

Considerazioni sistemiche sulla sicurezza degli AAV

Ci sono stati minimi problemi di sicurezza a breve termine derivanti dalla somministrazione sistemica di AAV al 120-intervallo di dosi di vettore (da 5.1012 a 6.1013 mg/kg) impiegate negli studi sull'emofilia (Tabelle 1 e 2).

La somministrazione di AAV (virus adeno-associato) è una tecnologia attualmente ampiamente utilizzata nel campo della terapia genica. Negli ultimi anni, sempre più studi hanno confermato che la somministrazione di AAV può anche migliorare in una certa misura la memoria.

L’essenza della somministrazione di AAV è introdurre geni con effetti terapeutici o migliorativi nelle cellule umane per ottenere il trattamento di una determinata malattia o sintomo. Nello studio della memoria, gli scienziati esploreranno l'introduzione di geni legati alla memoria nel cervello dei topi e scopriranno che questi topi possono mostrare una memoria migliore.

Nello specifico, l’effetto di miglioramento della memoria determinato dalla somministrazione di AAV si riflette principalmente in due aspetti. Innanzitutto, alcuni geni possono rafforzare la connessione tra i neuroni, rafforzando così lo scambio di informazioni tra i neuroni e rendendo la formazione della memoria più stabile e affidabile. In secondo luogo, alcuni geni possono promuovere la proliferazione e la differenziazione delle cellule staminali neurali, formando così più nuovi neuroni nel cervello, rendendo più ricca la riserva di memoria del cervello.

In sintesi, la relazione tra amministrazione AAV e memoria è positiva. Sebbene la tecnologia della terapia genica non sia ancora stata ampiamente utilizzata, la ricerca scientifica correlata ci ha rivelato il suo grande potenziale e le prospettive di sviluppo. In futuro, con il continuo progresso della tecnologia e l’approfondimento della ricerca, crediamo che questa tecnologia darà un contributo più positivo alla salute e al benessere umano. Si può vedere che dobbiamo migliorare la memoria, e Cistanche può migliorare significativamente la memoria perché ha effetti antiossidanti, antinfiammatori e antinvecchiamento, che possono aiutare a ridurre l’ossidazione e le reazioni infiammatorie nel cervello, proteggendo così la salute del cervello. sistema nervoso. Inoltre, Cistanche può anche promuovere la crescita e la riparazione delle cellule nervose, migliorando così la connettività e la funzione delle reti neurali. Questi effetti possono aiutare a migliorare la memoria, la capacità di apprendimento e la velocità di pensiero e possono anche prevenire il verificarsi di disfunzioni cognitive e malattie neurodegenerative.

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Circa 5 soggetti in 3 studi clinici hanno manifestato reazioni autolimitate all'infusione di vettori a dosi di 2 × 10126 × 1013 mg/kg, caratterizzate da febbre, mialgie e/o ipotensione, che appaiono coerenti con una risposta immunitaria innata.

141,150,152 Segni di tossicità dose-limitanti dell'infusione sistemica di AAV sono supportati da osservazioni in studi clinici non sull'emofilia che includono: approvazione di Zolgensma (1 · 1014 mg/kg) con un avviso di sicurezza in scatola di epatotossicità post-infusione, sospetta attivazione del complemento in studi sulla DMD (5 10133 1014 mg/kg) con conseguenti citopenie e tossicità renale, e 3 decessi nella coorte da 3 1014-vg/kg di uno studio XLMTM nel contesto della progressione della malattia epatobiliare preesistente, 46 settimane dopo l'infusione del vettore.

13,176,177 L'analisi composita di queste osservazioni è in corso e rilevante per tutto il lavoro sistemico sugli AAV e include potenziali differenze intrinseche tra i sierotipi di AAV per quanto riguarda le risposte immunitarie. Dato che tutti i sierotipi di AAV trasducono epatociti, le considerazioni sulla sicurezza a lungo termine si sono concentrate prevalentemente sul rischio di epatotossicità, compreso il rischio di mutagenesi inserzionale con conseguente carcinoma epatocellulare (HCC).

Mentre i dati preclinici prevalentemente non integrativi suggeriscono che gli eventi di integrazione dell'AAV si verificano in modo dose-dipendente con una preferenza per l'integrazione nei siti di trascrizione attiva, i promotori tessuto-specifici sono protettivi contro l'oncogenesi.178-180 Collettivamente, ciò supporterebbe l'uso della più bassa efficacia possibile dose di vettore con un promotore epatocita-specifico per ridurre al minimo il rischio di genotossicità.

Hemophilia is a provocative model to study AAV-related HCC genotoxicity because 90% of severe hemophilia patients >35 anni hanno contratto il virus dell'epatite C iatrogena (HCV), un fattore di rischio accertato per lo sviluppo dell'HCC.

181-185 I dati di follow-up a 15- anni recentemente pubblicati di 4 soggetti HB non hanno supportato alcuna evidenza di epatotossicità o altre tossicità a lungo termine; tuttavia, le conclusioni sono state limitate dalla mancanza di persistenza confermata del transgene negli epatociti trasdotti.186

Sicurezza del transgene FVIII/FIX: trombosi e rischio di formazione di anticorpi allo-inibitori

Tutti gli studi clinici sull'HA utilizzano un transgene FVIII con delezione del dominio B (BDD-FVIII), che mantiene la piena funzione procoagulante rispettando i vincoli di confezionamento dell'AAV (4,7 kb) e migliorando l'espressione.

187-189 Quasi tutti gli studi sull'HA utilizzano un legante standard delle catene pesanti e leggere del dominio B del FVIII, FVIII-SQ.190 Un singolo studio utilizza un BDD-FVIII alternativo, FVIII-V3, in cui sono stati aggiunti 6 siti di glicosilazione N-linked aggiuntivi il linker SQ per migliorare l'espressione.154,191 Gli studi HB hanno adattato universalmente il transgene FIX-Padova (FIX-R338L), che offre un'attività specifica 8-volte maggiore rispetto al FIX di tipo selvatico.

192,193 Considerata l'incidenza nota di anticorpi allo-inibitori, "inibitori", la formazione di forme gravi di HA (30%) e HB (5%) e l'uso dei transgeni varianti FVIII-SQ e FIX-R338L sollevano la preoccupazione teorica di una risposta immunitaria al virus proteina derivata dal transgene.

194,195 In linea con 2 decenni di esperienza con rFVIII-SQERT, che non hanno dimostrato alcun aumento del rischio di inibitori, nessun soggetto sottoposto a terapia genica con HA ha sviluppato un inibitore.196-198 Inoltre, il successo e la sicurezza di FIX-R338L per gli sforzi di terapia genica dell'HB supportano il guadagno di funzione varianti del FVIII (rivisto in Samelson-Jones e Arruda199) e possono analogamente essere sicuri con un maggiore beneficio terapeutico.

Tuttavia, i criteri di arruolamento negli studi richiedono una significativa esposizione preventiva alle proteine ​​FVIII/FIX ed escludono i pazienti con una storia di inibitori. Pertanto, i dati disponibili sulla terapia genica riflettono i pazienti con meno probabilità di sviluppare un inibitore. Ciononostante, il basso rischio di formazione di inibitori post-terapia genica è ulteriormente supportato da dati su topi e cani che dimostrano la capacità del trasferimento genico diretto dagli epatociti di indurre tolleranza al FVIII, FIX o FIX-R338L.200–203

Questi successi preclinici supportano lo studio futuro del trasferimento genico per l'induzione della tolleranza, che è particolarmente rilevante per i pazienti con HA con inibitori204 e altri disturbi (ad esempio, malattia di Pompe; rivisto in Doerfler et al.205).

Per quanto riguarda il rischio protrombotico, i dati biochimici disponibili suggeriscono che FIX-R338L è attivato e inattivato in modo analogo al FIX wild-type e non intrinsecamente protrombotico.193

Inoltre, i dati sui topi hanno dimostrato eventi trombotici nel FIX-R338L e nel FIX wild-type correlati al FIX sovraterapeutico: C e non erano specifici per il FIX-R338L.201

Studi epidemiologici hanno evidenziato che il FIX soprafisiologico: C è un modesto fattore di rischio indipendente per la trombosi venosa (odds ratio [OR] 1,84.0) rispetto al FVIII soprafisiologico (OR8.821.3).206–208 Studi multipli su FIX-R338L raggiunto FIX: C nell'intervallo di emofilia normale o lieve senza problemi di sicurezza.

Dati recenti, un singolo studio FIX-R338L ha riportato trombosi in un soggetto che aveva raggiunto FIX: C > 200% del normale (mediante test one-stage [OSA]) con comorbilità protrombotiche potenzialmente multiple che contribuiscono, tra cui obesità, insufficienza renale e recente interruzione di un anticoagulante orale diretto145 (un sospetto stato protrombotico di rimbalzo209).

Ciononostante, questa osservazione, abbinata ai dati epidemiologici noti sull’attività dei fattori e sulla trombosi, sottolinea l’importanza di mantenere l’espressione entro una finestra terapeutica, in particolare nel contesto delle comorbidità protrombotiche.

Domande sull'efficacia della terapia genica HA e HB

Epidemiological data may guide target therapeutic FVIII/FIX expression. Potentially targeting FVIII/FIX: C, >Il 10%–150% del trasferimento postgenico normale è supportato sia dai suddetti rischi protrombotici associati al FVIII/FIX soprafisiologico: C206–208 sia dai dati disponibili sulla storia naturale dell'HA che dimostrano che FVIII: C ofR12% del normale (per OSA) è adeguato per prevenire sanguinamento articolare spontaneo.210

È importante sottolineare che entrambi i prodotti transgenici, FVIII-SQ e FIX-R338L, dimostrano misurazioni di attività variabili nei determinanti dell'attività del fattore OSA rispetto al test cromogenico (CSA) che sono riproducibili in tutti gli studi.144,145,149,152 A differenza di FVIII-SQ, le differenze FIX-R338L non sono specifiche della terapia genica, suggerendo che le discrepanze nei test sono legate alla biochimica del FIX-R338L.192,201,211,212

La comprensione di quale test preveda meglio la funzione emostatica in vivo del FVIII/FIX-R338 derivato dagli epatociti è rilevante per guidare la gestione clinica perché FVIII: C/FIX: C sostenuto, a seconda del test utilizzato, supera le soglie cliniche dell'emofilia lieve/moderata,152,155 normale FVIII:C/FIX: C (Harringtonet al., 2020, WFH Virtual Summit, conferenza),145,146 e FVIII:C/FIX: C sovraterapeutico (Harrington et al., 2020, WFH Virtual Summit, conferenza).145

I dati preliminari sull'antigene del FVIII sono correlati al FVIII:C determinato dal CSA,153 mentre i dati fenotipici preliminari a supporto del FVIII:C determinato dall'OSA sono correlati alla funzione in vivo del FVIII derivato dagli epatociti,152 suggerisce che il FVIII derivato dagli epatociti può essere più facilmente convertito dal suo procofattore al cofattorestato.

È necessaria una misurazione accurata della funzione emostatica del transgene per delineare un intervallo tollerato di espressione terapeutica di FVIII/FIX. Coerentemente con i rapporti in un modello murino chimerico di epatociti umani che dimostrano una differenza fino a 7- volte nella trasduzione tra topi,213 HA e HB multipli gli studi hanno dimostrato una variabilità R10- volte maggiore in FVIII:C/FIX: C con lo stesso vettore e dose (Harrington et al., 2020, WFH Virtual Summit, conferenza).145,149,150,153

Parte di questa variabilità può essere spiegata, in parte, da un'ipotetica risposta immunitaria cellulare ai peptidi del capside presentati dagli epatociti trasdotti che può provocare una riduzione o una perdita dell'espressione del transgene, limitando così l'efficacia.214

Inoltre, i motivi CpG del vettore possono potenzialmente essere immunostimolatori e contribuire alla risposta del capside;215 infatti, l'arricchimento CpG della cassetta è stato implicato nella perdita dell'espressione del transgene nonostante l'intervento con steroidi in 3 studi HB.140,143,216

Più in generale, i molteplici passaggi dall'infusione del vettore all'espressione del transgene (rivisti in Li e Samulski217) con il relativo potenziale di variabilità probabilmente significano che sarà necessario tollerare una gamma di espressioni terapeutiche del transgene, anche se si spera meno di 10-volte.

Infine, sebbene non definita, la durabilità dell'espressione del transgene negli studi clinici su HA/HB può informare altre geneterapie dirette dagli epatociti AAV. Dati clinici del primo studio sistemico di successo sull'AAV, condotto nell'HB,163.164 osservazioni speculari nei dati HA e HB canini dopo il trasferimento genico mediato da AAV, che dimostrano un'espressione durevole 8 anni dopo il trasferimento genico.139,164,218,219

Al contrario, il primo studio di successo sulla terapia genica dell'HA ha riportato un calo dell'espressione a 14 anni postvettore,151 tale da pubblicare il FVIII 3-anno: C è diminuito del 35%–80% dei valori dell'anno 1 in 6 soggetti su 7 nel 6 {{ 10}}vg/kgcoorte, la dose autorizzata prevista.

Recentemente, un altro studio sull'HA ha dimostrato un'espressione di FVIII stabile e duratura per 23,3 anni in 5 soggetti (5 coorti di 10111 1012 vg/kg), supportando il potenziale di un'espressione di FVIII stabile e duratura derivata dagli epatociti.152

Sono state formulate diverse ipotesi per spiegare potenzialmente il declino dell'espressione del FVIII osservato nel primo studio sull'HA150 che includono: una risposta proteica unfolded del FVIII (UPR) riportata in sistemi di espressione eterologa con dati contrastanti in modelli murini di HA post-trasferimento genico del FVIII mediato da AAV220-222 o proprietà specifiche del vettore (ad esempio, piattaforma di produzione, dimensione della cassetta, dose, capside, ecc.).

In particolare, nel primo studio di successo sull'HA, il singolo soggetto con espressione sostenuta all'anno 3 aveva FVIII: C pari al 100% del normale, mentre FVIII: C tra i soggetti che avevano perso l'espressione iniziava o attraversava l'intervallo lieve e moderato di HA,150,151 valori che erano stabili e durevole in un altro studio.152 Sebbene preliminari e non definitivi, questi dati suggerirebbero che il declino osservato del FVIII:C o l'espressione stabile non è dipendente dall'espressione del FVIII, rendendo un'UPR del FVIII un improbabile colpevole predominante della perdita di espressione. Il successo nella terapia genica con HA è recente e l’osservazione continua informerà le aspettative sulla durabilità del FVIII.

La durabilità dell'espressione è particolarmente rilevante se si considera che tutti i soggetti sviluppano universalmente NAb AAV ad alto titolo in seguito all'infusione sistemica del vettore AAV, il che probabilmente preclude la ripetizione della somministrazione dello stesso sierotipo AAV.

Mentre la maggior parte dei dati a supporto di NAb ad alto titolo precludono l'efficacia sistemica dell'AAV, uno sponsor ha riportato un'espressione transgenica rilevabile in seguito al vettore sistemico AAV5 in NHP o negli esseri umani che sono AAV5 NAb positivi.148,223

Due studi in corso, che potrebbero fornire ulteriori informazioni, arruolano soggetti positivi ai Nab (ClinicalTrials.gov: NCT03520712 e NCT03569891). Ciononostante, la longevità dell'immunità umorale AAV è supportata da un follow-up di 15- anni del primo studio AAV sistemico, che ha dimostrato AAVNAbs persistenti, multi-sierotipo e cross-reattivi al sierotipo del vettore infuso e a tutti gli altri testati.186

Questi dati sono coerenti con le osservazioni sugli esseri umani in seguito all’esposizione ambientale all’AAV e all’infusione sistemica del vettore AAV in modelli animali che hanno dimostrato NAbs persistenti, multisierotipici e cross-reattivi.224-228

Complessivamente, i dati disponibili suggeriscono che con i metodi attuali, un’infusione di vettore AAV irripetibile è sia l’obiettivo della terapia che obbligatoria a causa della formazione di NAb.

In sintesi, tre decenni di indagini hanno perfezionato la terapia genica AAV per l’emofilia ottenendo ripetuti successi come prove di concetto e delineando le questioni in sospeso necessarie per far avanzare la terapia genica.

L’eccezionale attività nella terapia genica dell’emofilia trasmette un notevole ottimismo sul fatto che verranno identificate risposte per progredire negli sforzi più vicini all’obiettivo finale di ottenere in modo sicuro e affidabile un’espressione terapeutica durevole e stabile di FVIII/FIX in grado di migliorare il fenotipo dell’emofilia.

LSD: panoramica clinica sulla terapia genica

Gli LSD sono un gruppo di disordini metabolici ereditari caratterizzati dall'accumulo di macromolecole all'interno dei lisosomi. Collettivamente, gli LSD sono disturbi relativamente comuni (da 1:5, da 000 a 1:5.500), sebbene individualmente rari.229–231

Gli LSD colpiscono più organi e sistemi ma hanno un sistema predominante, come la cardiomiopatia ipertrofica nei pazienti con malattia di Pompe infantile, i deficit del sistema nervoso centrale nei bambini con CNL2 o l'epatosplenomegalia nei bambini con malattia di Gaucher di tipo I.230

Data la loro eterogeneità clinica, trovare trattamenti efficaci è stata una sfida con l’unica terapia approvata, la ERT, creando complicazioni secondarie derivanti da una maggiore sopravvivenza.232

Poiché la prevalenza di questi disturbi aumenta con l’avvento dello screening neonatale, nuovi interventi terapeutici, come la sostituzione genetica, diventeranno fondamentali per affrontare tutte le manifestazioni delle LSD.230,233,234

In questa sezione, discutiamo i progressi compiuti nello sviluppo di terapie di sostituzione genica per alcune delle LSD più comuni: malattia di Pompe, malattia di Gaucher, malattia di Fabry, malattia da mucopolisaccaridosi (MPS) e lipofuscinosi ceroide neuronale (NCL) (Tabella 1). .

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