Ottimizzazione del processo di estrazione dei flavonoidi nella foglia staminale di Panax notoginseng e studio dell'attività antiossidante e dei suoi effetti sulle cellule di melanoma B16 del topo
Mar 22, 2022
Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Chun-Yan Dai 1,2,3,4,†, Peng-Fei Liu 1,2,3,4,†, Pei-Ran Liao 1,2,3,4, Yuan Qu 1,2,3,4 ID ,Cheng-Xiao Wang 1,2,3,4, Ye Yang 1,2,3,4,* e Xiu-Ming Cui 1,2,3,4,*
Astratto:IlPanax notoginseng(P. notoginseng) la foglia del gambo è ricca diflavonoidi. Tuttavia, a causa della mancanza di ricerca sul processo di estrazione dei flavonoidi e sullo sviluppo funzionale della foglia di P. notoginsengstem, queste parti vengono scartate come rifiuti agricoli. Pertanto, in questo studio, intendiamo ottimizzare il processo di estrazione e sviluppare le funzioni di sbiancamento cutaneo degli estratti di foglie staminali di P. notoginseng. Il processo di estrazione dello stelo e della foglia del flavonoide di P. notoginseng (SLPF) è ottimizzato in base al design Box–Behnken (BBD) e alla metodologia della superficie di risposta (RSM). Le condizioni ottimali di estrazione dell'SLPF sono le seguenti: il tempo di estrazione, la concentrazione di etanolo, il contenuto di sodio dodecil solfato (SDS) e il rapporto del materiale liquido (v/p, che sono 52 min, 48,7 percento, 1,9 percento e 20 rispettivamente: 1. In condizioni di estrazione ottimali, il contenuto medio totale di SLPF è del 2,10 percento.antiossidanteattività e anti-deposizione di melanina di cellule B16 di topo diP. notoginsengvengono studiati gli estratti di foglie di stelo. I risultati indicano che i valori EC50 di attività riducente, 2,{2}}difenil-1-picrylidrazyl (DPPH) attività di scavenging dei radicali liberi, la capacità di rimozione del superossidoanione e il 2,{{5} La capacità di rimozione dei radicali liberi dell'acido }azino-bis-3-etilbenztiazolfonico-6-acido (ABTS) è rispettivamente di 7,212, 2,893, 2,949 e 0,855 mg/mL. I valori degli estratti IC50 della sintesi di tirosinasi e melanina sono rispettivamente 0,045 e 0,046 mg/mL. Pertanto, la tecnologia di elaborazione ottimale per l'SLPF ottenuta in questo studio non solo ne aumenta il tasso di utilizzo, ma riduce anche i costi dei materiali. Gli estratti della foglia del gambo di P. notoginseng possono essere sviluppati come prodotti alimentari o di bellezza.
Parole chiave: antiossidante; flavonoidi; cellule di melanoma B16 di topo; Panax notoginseng; tensioattivo
1. Introduzione
Panax notoginseng(P. notoginseng) (Burk.) FH Chen è una pianta perenne appartenente alle Araliaceae. Ha radici sotterranee che vengono essiccate per l'uso come medicinale e sono state incluse nella farmacopea cinese. La foglia del gambo di P. notoginseng ha un valore medicinale simile alla radice. È riportato nel Pents'ao Kang Mu che la foglia del gambo è adatta per il trattamento di fratture, lividi e sanguinamento. Studi moderni hanno anche confermato che la foglia del gambo di P. notoginseng ha un valore medicinale simile a quello della radice per il sistema sanguigno, il sistema cardiovascolare, il sistema nervoso e il sistema metabolico [1]. I prodotti comuni a base di foglie di stelo di P. notoginseng includono QiyeShen'an Pian, capsule di Jiang Zhi Ling e capsule di Qiye Shen'an.
Sebbene la foglia del gambo di P. notoginseng sia stata ufficialmente certificata come alimento a causa dei suoi elevati valori nutrizionali e medicinali (DBS 53/024-2017) [2], poca attenzione si è concentrata sulla promozione di queste parti vegetali per il cibo. Le statistiche preliminari hanno mostrato che la produzione annua della foglia del gambo di P. notoginseng è di 1500 tonnellate e solo il 5 per cento di questa quantità viene utilizzata [3]. Pertanto, incoraggiare lo sviluppo delle risorse fogliari del gambo di P. notoginseng può aumentare notevolmente il reddito diP. notoginsengproduttori e ridurre l'inquinamento ambientale, aumentando così i benefici socio-economici.
I principi attivi più efficaci estratti dalla foglia del gambo di P. notoginseng sono le saponine totali e i glicosidi flavonoidi, che rappresentano rispettivamente il 4–6% e il 0,54–2,49% [4]. I flavonoidi sono importanti a causa di loro attività farmacologiche ben definite, che includonoantiossidante, attività di protezione del fegato e antitumorale [5]. I solventi organici più comunemente usati per l'estrazione dei flavonoidi sono l'etanolo e il metanolo [6]. Ad esempio, Uysal et al. [7] componenti contenenti flavonoidi estratti con successo da Cotoneaster integerrimus usando metanolo. Wang et al. [8] hanno utilizzato il 70 percento di etanolo per estrarreflavonoididalle foglie di acer truncatum. Il tasso di estrazione era più alto e l'estratto era più facile da concentrare e asciugare. Si ritiene che l'estrazione con etanolo sia un metodo di estrazione migliore. Al momento, solo Zhang et al. [4,9] estratto SLPF mediante un metodo con acqua alcalina a microonde e un metodo di immersione a caldo. Tuttavia, il metodo ad ultrasuoni può far sì che l'estratto continui a scioccare, contribuire alla diffusione del soluto, ridurre notevolmente il tempo di estrazione e migliorare la velocità di estrazione dei flavonoidi totali e l'uso di materie prime, che è un metodo relativamente nuovo per l'estrazione dei flavonoidi [6]. Pertanto, l'estrazione efficiente dell'SLPF e la ricerca sull'uso del prodotto per la cosmesi e la cura della salute sono di grande importanza per l'ulteriore sviluppo di questo settore.
I tensioattivi sono ampiamente utilizzati come ausiliari nell'estrazione di componenti attivi; aumentano l'efficienza di estrazione, riducono il tempo di estrazione e aumentano la solubilità degli ingredienti attivi insolubili in acqua in acqua. Inoltre, l'applicazione di tensioattivi riduce l'uso di solventi organici e il loro costo, ottimizza i componenti target durante il processo di estrazione e migliora la purezza dei principi attivi. La maggior parte dei tensioattivi utilizzati per l'estrazione non sono tossici. Sodio dodecilsolfato (SDS), Triton X-100, Tween-20, Tween-80 e Span-20 sono tensioattivi comunemente usati che possono aumentare significativamente la velocità di estrazione diflavonoidi[10-13]. La metodologia della superficie di risposta (RSM) è stata ampiamente utilizzata per l'ottimizzazione del processo e il design Box-Behnken (BBD) è un modello statistico dei metodi di progettazione della superficie di risposta. Il BBD rappresenta un disegno quadratico indipendente che non contiene un disegno fattoriale o frazionario incorporato. Rispetto ad altri metodi di progettazione, il BBD è facile da progettare e analizzare statisticamente; pertanto, è ampiamente utilizzato nell'ottimizzazione del processo di estrazione dei flavonoidi [14]. Ad esempio, le variabili di estrazione assistita da microonde sono state ottimizzate utilizzando l'RSM per recuperi ottimali del contenuto totale di flavonoidi [15]. Inoltre, alcuni ricercatori hanno ottenuto una migliore condizione tecnologica per estrarre i flavoni totali dai semi di Flos Populi [16] e Coriandrum sativum [17] utilizzando aBBD dell'RSM.
In precedenza, sono stati riportati i metodi di estrazione dei flavonoidi [18], ma finora il processo di estrazione di SLPF non è stato ancora formato. In questo studio, il processo di estrazione assistita da ultrasuoni di SLPF è stato ottimizzato utilizzando il BBD per determinare il contenuto diflavonoidicome indice per la prima volta. Le variabili indipendenti, ovvero tipo di tensioattivo, dosaggio, rapporto di materiale liquido (v/w, tempo di estrazione e concentrazione di etanolo, sono fissate come fattori singoli. Pertanto, gli obiettivi del presente lavoro sono stati (i) ottimizzare gli ultrasuoni- processo di estrazione assistita dei flavonoidi totali; (ii) valutare ilantiossidanteattività degli estratti; (iii) valutare l'effetto degli estratti sull'attività delle cellule B16; (iv) esplorare la fattibilità dell'applicazione dell'SLPF nei cosmetici, nei prodotti sanitari e nell'industria farmaceutica; (v) fornire un riferimento per lo sviluppo diP. notoginsengestratti di foglie di gambo e ridurre lo scarico di rifiuti agricoli nell'ambiente.
cistanche antiossidante
2. Risultati e discussione
2.1. Effetto dei tipi di tensioattivo sull'efficienza di estrazione di SLPF
Oltre al gruppo di controllo (CK) (acqua invece di tensioattivi), diversi tipi di tensioattivi (1,5 percento) sono stati utilizzati in altri gruppi mantenendo un rapporto di materiale liquido (v/p di 15:1 e utilizzando una concentrazione di etanolo del 40 percento. Il contenuto totale di flavonoidi è stato determinato dopo l'estrazione ad ultrasuoni a 80 ◦C per 40 minuti; i risultati sono mostrati nella Figura 1. Si può vedere che i tensioattivi hanno migliorato l'efficienza di estrazione dell'SLPF e il contenuto più alto è stato estratto dall'SDS. L'SLPF contenuto utilizzando SDS è stato aumentato del 12,8 per cento rispetto al CK. Pertanto, SDS è stato utilizzato negli esperimenti successivi.
2.2. Esperimenti a fattore singolo
Il risultato ha mostrato che l'efficienza di estrazione di SLPF è aumentata con l'aumento del tempo di estrazione; con un rapporto di materiale liquido (v/p) di 15:1, la concentrazione di etanolo era del 40 percento e il contenuto di SDS era dell'1,5 percento (Figura 2A). La resa del contenuto SLPF è diminuita quando il tempo di estrazione è stato superiore a 40 min. Il contenuto di SLPF aumentava quando la concentrazione di etanolo aumentava dal 30% al 50%, ma diminuiva gradualmente quando la concentrazione di etanolo era superiore al 50%. La resa più alta del contenuto di SLPF era del 23,1 percento per un tempo di estrazione di 40 minuti, un rapporto di materiale liquido (v/p) di 15:1 e un contenuto di SDS dell'1,5 percento (Figura 2B). Quando il tempo di estrazione era di 40 minuti, il rapporto materiale liquido (v/p) era 15:1 e la concentrazione di etanolo era del 40 percento, il contenuto di SLPF continuava ad aumentare con il contenuto di SDS dallo 0,5 percento al 2 percento. Quando il contenuto SDS è stato aumentato dallo 0,5% al 2%, il contenuto SLPF è stato aumentato del 10% (Figura 2C). Il contenuto totale di flavonoidi era più alto quando il rapporto del materiale liquido (v/p) era 20:1, il tempo di estrazione era di 40 minuti, la concentrazione di etanolo era del 40 percento e il contenuto di SDS era dell'1,5 percento (Figura 2D). Il contenuto di SLPF era 1,5 volte superiore a quello quando è stato utilizzato il rapporto di materiale liquido (v/w) di 5:1 e diminuiva quando il rapporto di materiale liquido era maggiore di 20:1. Pertanto, per i successivi esperimenti BBD, il tempo di estrazione varia da 40 a 60 min, le concentrazioni di etanolo variano dal 40 percento al 60 percento, i contenuti di SDS vanno dall'1,5 percento al 2,5 percento e il rapporto del materiale liquido (v/p) varia da 15: Sono stati utilizzati da 1 a 25:1.
2.3. Adattamento del modello e ottimizzazione dell'SLPF
2.3.1. Montaggio del modello
La matrice progettata, i risultati dell'analisi della varianza, l'adeguatezza e l'idoneità dei modelli sono riportati nella Tabella 1. È stata condotta un'analisi di regressione multipla utilizzando il software Design-Expert. La relazione tra la variabile di risposta (il contenuto di SLPF) e le variabili indipendenti è stata espressa dalla seguente equazione polinomiale del secondo ordine:
Y {{0}} -30.678 più 0.487A più 0.304B più 4.596C più 0 .853D − 0.001AB − 0.020AC − 0.005AD più 0.010BC − 0.001BD − 0.076CD − 0.003A2 − 0.002B2 − 0.683C2 − 0.010D2(1)
dove Y è il contenuto SLPF; A, B, C e D rappresentano rispettivamente il tempo di estrazione, la concentrazione di etanolo, il contenuto di SDS e il rapporto del materiale liquido.
2.3.2. Analisi della superficie di risposta
L'analisi residua del modello di ottimizzazione della superficie di risposta è stata condotta utilizzando uno strumento di analisi grafica. È importante verificare l'uniformità della varianza dell'errore del modello. Se i risultati mostrano un buon adattamento con i valori previsti, la curva adattata dei valori sperimentali e previsti è lineare. Inoltre, è importante valutare se la distribuzione dei residui è normale quando si determina l'accuratezza del modello. Quando i residui hanno una distribuzione normale, la curva adattata dei residui è lineare [19]. Inoltre, se i valori predittivi dei residui hanno una distribuzione casuale, l'omogeneità della varianza residua è coerente con i requisiti di ottimizzazione [20]. In questo studio, il modello quadratico si è adattato meglio ai dati (Valore R2 di 0,9818) (Figura 3A) [21]. Inoltre, il grafico di probabilità normale dei residui (Figura 3B) e il grafico del residuo rispetto alla risposta prevista (Figura 3C) sono stati utilizzati per convalidare l'adeguatezza del modello . I dati hanno mostrato che i punti nella trama normale formavano una linea retta (Figura 3B). Ciò indicava che i dati non mostravano deviazioni dalla normalità. Inoltre, il grafico dei residui rispetto alla risposta prevista ha mostrato una distribuzione casuale, che indicava che il modello era adeguato e non violava il presupposto di indipendenza o varianza costante (Figura 3C) [22].
I risultati hanno mostrato che un'elevata percentuale della varianza totale è stata spiegata dal modello di regressione quadratica (R2 di 0.982), indicando che il modello è adatto per l'ottimizzazione dei parametri di estrazione [23]. L'R2Adj di 0.964 era relativamente vicino all'R2Pred di 0.902, a conferma del fatto che il modello è significativo [14]. Il valore del rapporto segnale/rumore (RSN) era 24,553, che era ben al di sopra4. Il risultato ha indicato che questo modello potrebbe essere utilizzato per lo spazio di progettazione. Inoltre, il coefficiente di variazione (CV) era basso (2,657 percento), indicando che il modello si adattava in modo soddisfacente ai dati sperimentali e può essere utilizzato per prevedere il risultato all'interno dell'intervallo dei dati. I coefficienti di regressione sono elencati nella Tabella 2. Nel modello SLPF, A, B, C, AB, AC, AD, BC, CD, A2, B2, C2 e D2 erano significativamente differenti (p < 0.05)="" ,="" ma="" d="" e="" bd="" non="" erano="" significativamente="" differenti="" (p=""> 0,05).
Dal modello finale sono stati generati un grafico di superficie 3D (Figura 4A1–D1) del contenuto totale di flavonoidi e la curva di contorno (Figura 4A2–D2) delle due variabili testate per descrivere le interazioni tra le variabili indipendenti e i parametri di processo ottimali. Ogni grafico è stato completato a condizione che gli altri fattori fossero mantenuti ogni volta ai rispettivi livelli zero [24]. Se il diagramma di contorno ha una forma circolare, le interazioni tra i fattori corrispondenti sono trascurabili. La forma ellittica del diagramma di contorno indica che le interazioni tra le variabili contribuiscono al contenuto del totaleflavonoidia livello significativo [25]. Sulla base dei dati mostrati in Tabella 2 e Figura 4, nel modello SLPF, la classifica dell'effetto di interazione tra le variabili indipendenti dall'alto al basso era CD–AD–AB–AC. Gli effetti di C (il contenuto di SDS) e D (il rapporto di materiale liquido (v/w)) sul contenuto di SLPF sono stati mostrati come un diagramma 3D e un diagramma di contorno associato. La forma ellittica del diagramma di contorno ha illustrato una correlazione significativa (p < 0.0001)="" tra="" c="" e="" d,="" che="" ha="" contribuito="" ai="" diversi="" contenuti="" di="" slpf="" (tabella="" 2;="" figura="" 4d1,="" d2).="" il="" contenuto="" di="" slpf="" è="" aumentato="" (2,13%)="" quando="" il="" contenuto="" di="" sds="" è="" stato="" aumentato="" dall'1,5%="" al="" 2,0%="" e="" il="" rapporto="" di="" materiale="" liquido="" (v/w)="" è="" stato="" aumentato="" da="" 15:1="" a="" 20:1="" (figura="" 4d1,="" d2).="" è="" importante="" che="" il="" processo="" di="" estrazione="" sia="" economico="" e="" fattibile="" e="" l'approccio="" di="" modellazione="" facilita="" la="" riduzione="" dei="" costi="" e="" dei="" tempi="" durante="" la="" futura="" produzione="" di="">
estratto di cistanche antiossidante
2.3.3. Validazione del Modello
Per validare il modello proposto, sono state selezionate varie condizioni di reazione all'interno dell'intervallo delle variabili (Tabella 3). I parametri di processo ottimali per ottenere un contenuto flavonoide totale elevato ottenuto dall'equazione (1) erano il tempo di estrazione di 51,84 min, una concentrazione di etanolo del 48,68 percento, un contenuto di SDS dell'1,88 percento e un rapporto di materiale liquido (v/p) di 19,81:1; ciò ha comportato un contenuto totale di flavonoidi del 2,13%. L'accuratezza del modello è stata confermata sulla base di tre test in condizioni ottimali. Il contenuto medio totale di flavonoidi era del 2,10%, che non ha mostrato differenze significative dal valore previsto. Ciò indicava che il valore sperimentale era molto vicino al valore previsto, il che ha dimostrato che i risultati erano ragionevoli e affidabili; il modello dell'equazione (1) è stato considerato soddisfacente e accurato per prevedere il contenuto di SLPF. Questo approccio non solo migliora l'efficienza di estrazione, ma aumenta anche il tasso di utilizzo del P.notoginsengfoglia del gambo.
2.4. Attività antiossidanti degli estratti di foglie di stelo di P. notoginseng
La ridotta capacità degli estratti di foglie di stelo di P. notoginseng è positivamente correlata alla suaattività antiossidante; pertanto, può essere utilizzato come un importante indice di valutazione dell'attività antiossidante [26]. Le capacità di riduzione degli estratti e dell'acido ascorbico aumentavano con la concentrazione e mostravano una correlazione positiva significativa con la concentrazione (Figura 5A). L'EC50 degli estratti e dell'acido ascorbico era rispettivamente di 7,212 e 0,0287 mg/mL. Questi risultati lo suggerivanoP. notoginsenggli estratti sono un efficace donatore di elettroni in grado di reagire con i radicali liberi per convertirli in prodotti più stabili. Il radicale DPPH è un radicale libero relativamente stabile e può accettare elettroni o atomi di idrogeno per formare molecole stabili. I radicali idrossilici possiedono la più alta capacità di ossidazione e possono danneggiare le molecole biologiche. Pertanto, DPPH e radicali idrossilici sono stati ampiamente utilizzati come un importante indice di valutazione dell'attività antiossidante [27]. L'attività di scavenging dei radicali DPPH è aumentata con la concentrazione degli estratti e dell'acido ascorbico, e tutti hanno mostrato una correlazione positiva significativa con la concentrazione. I valori EC50 degli estratti e dell'acido ascorbico erano rispettivamente 2,893 e 0,0938 mg/mL (Figura 5B). Le attività di scavenging dei radicali idrossilici hanno avuto un andamento simile a quello del DPPHradical per i trattamenti degli estratti o dell'acido ascorbico e i valori EC50 degli estratti e dell'acido ascorbico erano rispettivamente 1,514 e 0,0902 mg/mL (Figura 5C). Questi risultati hanno indicato che il P. gli estratti di notoginseng hanno un'elevata capacità di rimuovere DPPH o radicali idrossilici.
Gli anioni superossido possono portare alla presenza di perossidi nella membrana plasmatica [28]. Pertanto, la capacità di rimuovere gli anioni superossido è estremamente importante per un antiossidante. In questo studio, il tasso di scavenging dell'anione superossido è aumentato con la concentrazione degli estratti e dell'acido ascorbico e anche il tasso di rimozione è stato correlato alla concentrazione (Figura 5D). I valori di EC50 degli estratti e dell'acido ascorbico erano rispettivamente di 2,949 e 0,140 mg/mL e i tassi di rimozione più elevati erano rispettivamente del 94,90% e del 93,73%.antiossidantel'attività degli estratti si riflette generalmente nella capacità di rimuovere l'ABTS più i radicali liberi [29]. L'effetto di scavenging degli estratti e dell'acido ascorbico sull'ABTS più i radicali liberi aumentava con la concentrazione (Figura 5E) e c'era una correlazione positiva tra il tasso di scavenging e la concentrazione degli estratti o dell'acido ascorbico. I valori EC50 di P. gli estratti di notoginseng e l'acido ascorbico erano rispettivamente di 0,855 e 0,205 mg/mL.
Molti studi lo hanno scopertoflavonoidipossedere il beneantiossidanteproprietà. I risultati di Farombi et al. [30] ha mostrato che un estratto di semi di Garcinia kola mostrava un effetto scavenging del 57% sul superossido a una concentrazione di 1 mg/mL, un effetto scavenging dell'85% sul perossido di idrogeno a una concentrazione di 1,5 mg/mL e un 89 percento di effetto scavenging su DPPH a una concentrazione di 2 mg/mL.Srisawat et al. [31] hanno dimostrato le attività di scavenging dei radicali anionici superossido degli estratti di riso con valori di EC50 nell'intervallo 0,6-5 mg/mL, che era simile ai risultati di questo studio. Nel complesso, questa ricerca ha anche indicato che ilP. notoginsenggli estratti di foglie di stelo possiedono una forte attività antiossidante.
2.5. Effetto degli estratti sull'attività cellulare B16
La sicurezza delP. notoginsenggli estratti di foglie staminali sono estremamente importanti nello studio della vitalità cellulare, dell'attività della tirosinasi cellulare e dei livelli di melanina nelle cellule di melanoma B16. I risultati hanno mostrato che la vitalità cellulare era di circa l'85% a una concentrazione di 0.032 mg/mL e che il valore IC50 della vitalità cellulare era {{2{{22} }}}.405 mg/mL (Figura 6A). Gli estratti di foglie staminali di P. notoginseng non erano particolarmente citotossici per le cellule B16. Pertanto, per eseguire gli esperimenti successivi sono state utilizzate concentrazioni di estratto inferiori a 0,032 mg/mL. La tirosinasi è un enzima melanogenico regolatorio e limitante la velocità che è coinvolto nella via di sintesi della melanina [32]. I risultati hanno indicato che gli estratti hanno ridotto significativamente l'attività della tirosinasi e la produzione di melanina nelle cellule murine in modo dose-dipendente (Figura 6B). C'erano correlazioni positive tra il contenuto estratto e il rapporto di inibizione della sintesi della tirosinasi o della melanina (R2=0.9162 e R2=0.9118). I valori IC50 del rapporto di inibizione della sintesi di tetirosinasi e melanina erano rispettivamente di 0,045 mg/mL e 0,046 mg/mL (Figura 6B). La melanina gioca un ruolo decisivo nel colore della pelle. La formazione di melanina è regolata dalla tirosinasi, che è un importante enzima limitante la velocità regolato dai radicali liberi. Studi dettagliati lo hanno dimostratoflavonoidisono inibitori piuttosto potenti e possono inibire direttamente la tirosinasi e agire sulla parte distale della via ossidativa della melanogenesi [33]. I nostri risultati hanno indicato che gli estratti di foglie dello stelo di P. notoginseng hanno mostrato buone prestazioni nel ridurre l'attività della tirosinasi e la produzione di melanina. È evidente che gli estratti di foglie di stelo di P. notoginseng possono avere grandi prospettive come alimento salutare e come prodotto cosmetico a causa delle sue eccellenti prestazioni in una deposizione anti-pigmento.
3. Materiali e metodi
3.1. Materiali vegetali
Foglia di stelo fresca diP. notoginsengè stato acquistato dal centro commerciale internazionale di P. notoginseng, Wenshang, provincia dello Yunnan, nell'ottobre 2017, quindi lavato in acqua distillata e l'acqua superficiale è stata rimossa. La foglia fresca dello stelo di P. notoginseng venne essiccata fino a peso costante a 60°C, e quindi polverizzata per un ulteriore uso.
Beneficio dell'estratto di cistanche:deposizione anti-pigmento
3.2. Sostanze chimiche e reagenti
Na2HPO4, NaH2PO4, TCA (acido tricloroacetico), FeCl3, FeSO4, acido ascorbico, pirogallolo, H2O2 sono stati ottenuti da Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, Cina) DPPH (2,2-difenile 1- picrylhydrazyl), ABTS, -MSH, L-DOPA e MTT sono stati acquistati da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), PBS (Biological Industries, Beit-Haemek, Israele), cultura Modifed EagleMedium (DMEM) di Dulbecco e siero bovino fetale (FBS; Gibco, NY, USA) e tripsina sono stati ottenuti da Biological Industries, Israele. DMSO e Triton X-100 sono stati ottenuti rispettivamente da MP Biomedicals e Amresco negli Stati Uniti. Tutti gli altri reagenti erano di grado analitico. L'acqua ultrapura è stata ottenuta dal sistema Millipore (Bedford, MA, USA).
3.3. Ottimizzazione della selezione delle condizioni di estrazione
Estrazione eco-assistita del totaleflavonoididalP. notoginsengla foglia dello stelo è stata ottimizzata dall'RSM. Il contenuto di SLPF è stato impostato come indice per giudicare la condizione di estrazione. Secondo la tecnologia di estrazione, i tensioattivi, il tempo di estrazione, la concentrazione di etanolo, il contenuto di SDS e il rapporto del materiale liquido sono fattori chiave. I valori più alti negli esperimenti erano i valori centrali ottimali per il contenuto SLPF. Quindi, sono stati utilizzati per studiare il miglior processo di estrazionetecnologia di SLPF con il metodo di RSM. Il trattamento a fattore singolo è stato il seguente: la foglia dello stelo di P. notoginseng è stata (1) estratta utilizzando diversi tensioattivi (Tabella 4), estrazione con ultrasuoni per 40 min mantenendo il rapporto materiale liquido (15:1, v/w) e una concentrazione di etanolo al 40 percento; (2) estratto mediante ultrasuoni per 10, 20, 30, 40, 50 e 60 minuti quando il rapporto del materiale liquido era 15:1 (v/p), la concentrazione di etanolo era del 40 percento e il contenuto di SDS era dell'1,5 percento; (3) estratto del 30, 40, 50, 60, 70, 80 e 90 percento di etanolo per 40 minuti quando il rapporto del materiale liquido era a 15:1 (v/p) e il contenuto di SDS era dell'1,5 percento; (4) estratto da 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 e 3 percento di SDS per 40 minuti quando il rapporto di materiale liquido era 15:1 e il contenuto di etanolo era del 40 percento; (5) estratto con diversi rapporti di materiale liquido (5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1 e 30:1; v/w) per 40 minuti mantenendo la concentrazione di etanolo del 40 percento, e il contenuto di SDS era dell'1,5%. Quindi, è stato determinato il contenuto degli inestratti SLPF.
3.4. Progettazione sperimentale di RSM
Sulla base dell'analisi dei risultati di esperimenti a fattore singolo, la condizione di estrazione SLPF daP. notoginsengstem leaf è stato sviluppato e ottimizzato utilizzando BBD a tre livelli e quattro fattori, combinato con RSM (Design-Expert Software, versione di prova 8.1.0; Stat-Ease Inc., Minneapolis, MN, USA).Ogni variabile indipendente è stato codificato a tre livelli tra -1 e più 1, dove il tempo (A); la concentrazione di etanolo (B); il contenuto della SDS (C); e il rapporto del materiale liquido (D) sono stati modificati negli intervalli mostrati nella Tabella 5. Il contenuto di SLPF era la variabile di risposta. Per i calcoli statistici, è stata utilizzata un'equazione quadratica del secondo ordine come segue: [34].
Y= 0 più 4∑i=1 iXi più 4∑i=1 iiX2i più 3∑i=1.4∑j=i più 1 ijXiXj più 4 ∑i=1 iiiX3i(2)
dove Y è la risposta prevista, 0 è un coefficiente di intercetta, i è i termini lineari, ii è i termini quadrati, ij è i termini di interazione e Xi e Xj rappresentano i livelli codificati di variabili indipendenti
3.5. Saggio di flavonoidi totali
Il contenuto del totaleflavonoidiè stato determinato sulla base di un metodo consolidato con alcune modifiche e la rutina è stata scelta come standard di riferimento [35]. La rutina essiccata è stata pesata con precisione 10 mg, sciolta con 20 ml di etanolo e trasferita in un matraccio tarato da 100 ml aggiungendo acqua alla bilancia. Una serie di soluzioni standard di rutina nell'intervallo 0.0–6,0 ml sono state trasferite con precisione in matracci tarati da 25 ml. Quindi, è stato aggiunto 1 ml di NaNO2 al 5%; dopo 6 minuti, si aggiungono 1,0 mL di Al(NO3)3 al 10 percento e la soluzione viene mantenuta per 6 minuti a temperatura ambiente; 10 mL di NaOH al 4 percento sono stati aggiunti ai matracci tarati. Questa soluzione è stata quindi diluita con una soluzione acquosa a 25 ml e mantenuta per 15 minuti a temperatura ambiente. L'assorbanza rispetto a un campione bianco senza rutina (A) è stata misurata alla lunghezza d'onda di 510 nm utilizzando uno spettrofotometro UV-2600 (ShanghaiYuanxi Instruments Co. Ltd., Shanghai, Cina) per ottenere la risposta lineare (A {{25} }.6971B − 0.0072,R2=0.9992). B era il contenuto totale di flavonoidi (mg) alla lunghezza d'onda di 510 nm. Un'aliquota di 0,1 mL dei campioni è stata diluita con metanolo a 50 mL ed è stata quindi determinata la concentrazione di flavonoidi totali allo spettrofotometro. Il contenuto totale di flavonoidi è stato calcolato secondo la seguente equazione:y =m × VM × 100 percento (3)
3.6. Analisi statistica
Tutti i dati degli esperimenti sono stati elaborati con il software Microsoft Excel 2010 e le curve sono state adattate con Origin 8.0. L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando SPSS 19.0.
4. Conclusioni
L'estrazione assistita da ultrasuoni ha migliorato l'efficienza di estrazione totaleflavonoidi.Le condizioni ottimali di estrazione di SLPF erano: tempo di estrazione assistita da ultrasuoni di 52 min, una concentrazione di etanolo del 48,7 percento, un contenuto di SDS tensioattivo dell'1,9 percento e rapporto materiale liquido (v/wof 20:1; ciò ha comportato un 2,10 percentuale di contenuto di SLPF È stato raccomandato ai produttori di adattare questi dati per l'estrazione di SLPF in base alle condizioni specifiche per ottenere una produzione efficiente su larga scala.P. notoginsengestratti di foglie di stelo hanno mostrato un forteantiossidanteattività e ha indotto una diminuzione della sintesi di melanina inibendo l'attività della tirosinasi. I nostri risultati promuovono l'uso di P. notoginseng estratti di foglie di stelo per preparazioni cosmetiche e alimenti è un agente sbiancante per la pelle.
antiossidante: estratto di cistanche