Rilevazione e caratterizzazione di nanoparticelle minerali organiche nei reni umani

Tsui Yin Wong^1,2,*, Cheng-Yeu Wu^1,2,3,* et al

La calcificazione ectopica è associata a varie malattie umane, tra cui aterosclerosi, cancro,cronicorenepatologia, ediabetemellito. Sebbene le nanoparticelle minerali siano state rilevate nei vasi sanguigni calcificati, la natura e il ruolo di queste particelle nel corpo umano rimangono poco chiari. Qui mostriamo per la prima volta quell'umanorenetessuti ottenuti dallo stadio terminalecronicorenepatologiao pazienti con cancro renale contengono particelle minerali rotonde multilamellari da 50 a 1.500 nm, mentre non si osservano particelle nei controlli sani. Le particelle minerali si trovano principalmente nella matrice extracellulare che circonda i tubuli contorti, raccogliendo i dotti e le anse di Henle, nonché all'interno del citoplasma delle cellule che delineano i tubuli e sono costituite da fosfato di calcio policristallino simile al minerale che si trova nelle ossa e nelle calcificazioni ectopiche. Ilrenele nanoparticelle minerali contengono diverse proteine ​​sieriche che inibiscono la calcificazione ectopica nei fluidi corporei, tra cui albumina, fetuina-A e apolipoproteina A1. Poiché le nanoparticelle minerali-organiche si trovano non solo all'interno di depositi calcificati ma anche in aree prive di calcificazioni microscopiche, le nostre osservazioni indicano che le nanoparticelle possono rappresentare precursori della calcificazione e dei calcoli renali nell'uomo.

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La calcificazione ectopica è associata ad aterosclerosi, cancro,cronicorenepatologiae diabete mellito1–3. Studi recenti indicano che l'aterosclerosi ecronicorenepatologiai pazienti con segni di calcificazione vascolare mostrano un aumento dei rischi di morbilità e mortalità, suggerendo che la calcificazione ectopica è dannosa per la salute umana1,3. La calcificazione indesiderata si osserva anche negli individui che invecchiano e la maggior parte delle persone di età superiore ai 60 anni mostra segni di calcificazione vascolare4. Per questi motivi, la decifrazione dei fattori che inducono la calcificazione ectopica e lo sviluppo di un trattamento efficace rappresentano obiettivi importanti.

La calcificazione ectopica può essere definita come uno squilibrio tra inibitori e induttori della calcificazione nel corpo. Gli inibitori della calcificazione includono proteine ​​sieriche come albumina, fetuina-A, osteopontina e proteina GLA della matrice, nonché piccoli composti come il pirofosfato, mentre l'iperfosfatemia e l'infiammazione rappresentano i principali induttori di calcificazione5-7. Studi recenti indicano che gli induttori della calcificazione attivano un processo cellulare simile alla formazione ossea durante la calcificazione vascolare7,8. Vescicole della matrice simili a quelle che inducono la mineralizzazione nelle ossa in via di sviluppo sono state rilevate anche nei tessuti molli calcificati7–9. Queste vescicole della matrice sono probabilmente rilasciate dalle cellule muscolari lisce vascolari che si differenziano in cellule simili agli osteoblasti, che inducono la calcificazione7.

Sono state rilevate nanoparticelle minerali (NP) nei tessuti molli che mostrano segni di calcificazione ectopica. Prezzo et al. hanno scoperto che il siero di ratti trattati con il bisfosfonato etidronato o con la vitamina D ospita complessi minerali-proteine ​​contenenti gli inibitori della calcificazione fetuina-A e la proteina GLA della matrice10,11. Allo stesso modo, Jahnen-Dechent et al. ha osservato che i complessi minerali contenenti fetuina-A, chiamati particelle di calciproteina (CPP), potevano essere rilevati nel liquido ascitico di pazienti con peritonite calcificante12. Un recente studio di Bertazzo et al. hanno dimostrato la presenza di NP minerali nelle valvole aortiche e nelle arterie coronarie di pazienti con febbre sia aterosclerotica che reumatica13. Mentre gli studi sulla formazione di particelle minerali si sono generalmente concentrati sul sistema cardiovascolare umano, non è chiaro se le particelle possano essere trovate in altri tessuti e se queste entità svolgano un ruolo nella salute o nella malattia.

Abbiamo osservato in precedenza che le NPS minerali organiche si formano spontaneamente nei fluidi corporei umani e animali14-28. Queste NP minerali furono inizialmente descritte come nanobatteri (NB) e si riteneva non solo le cellule più piccole sulla terra29, ma anche una possibile causa trasmissibile di numerose malattie, tra cui il morbo di Alzheimer, l'aterosclerosi, il cancro,renecalcoloformazione, policisticorenepatologiae prostatite30–32. Tuttavia, i nostri risultati hanno mostrato che NB è in realtà NP minerali non viventi che imitano i batteri comuni in termini di morfologia, crescita, proliferazione e sub-coltura15,18,22. Resta da esaminare la possibilità che particelle minerali simili alla cosiddetta NB possano essere trovate nei tessuti umani e se queste particelle giochino un ruolo nella malattia.

Nel presente studio, abbiamo sviluppato un approccio nanomateriale per rilevare e analizzare le NP minerali-organiche nell'uomo malatorenetessuti. Mostriamo che i tessuti renali da malattia renale cronica allo stadio terminale e pazienti con cancro renale contengono NP minerali multilamellari simili alle particelle minerali biomimetiche che precipitano spontaneamente nei fluidi corporei in vitro. I nostri risultati rivelano intuizioni critiche riguardanti la composizione biochimica, il meccanismo di formazione e la funzione biologica di queste particelle minerali-organiche e fanno luce sui meccanismi di calcificazione ectopica e inizio di malattie nel corpo umano.

Risultati

Abbiamo esaminato i tessuti renali rimossi chirurgicamente da pazienti umani con malattia renale cronica allo stadio terminale (n=2) o cancro renale (n=18; vedere la tabella 1; per i campioni di cancro renale, ci siamo concentrati sul non -parte cancerosa del tessuto). Come controlli sani, abbiamo studiato le biopsie renali ottenute da pazienti con trauma o ematoma ma che non avevano una precedente funzione renale anormale (n=2; Tabella 1).

I tessuti renali di individui sani hanno mostrato caratteristiche istologiche normali e non è stata osservata calcificazione ectopica dopo la colorazione di von Kossa (Fig. 1A, B). D'altra parte, i tessuti renali ottenuti da individui malati e colorati con ematossilina ed eosina (H&E) hanno mostrato evidenza di danno tissutale (Fig. 2A-C, indicato dalle frecce) e l'80% dei tessuti malati esaminati ha mostrato depositi mineralizzati come rivelato mediante colorazione di von Kossa (Fig. 1C-T, Fig. 2E, F, la calcificazione è visibile come materiale nero indicato da frecce nere; vedere anche la Tabella 1). Sono stati osservati depositi calcificati nella corteccia e nel midollo, compreso lo spazio extracellulare che circonda i tubuli contorti distali, i tubuli contorti prossimali, i dotti di raccolta e le anse di Henle, nonché il citoplasma delle cellule che delineano i tubuli e i dotti (Fig. 1C-T e Fig. 2E, F). Nessuna calcificazione è stata rilevata nel corpuscolo renale (Fig. 2D).

Per esaminare la natura dei precipitati minerali, abbiamo preparato sezioni renali ultrasottili per l'osservazione mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM). In campioni contenenti depositi minerali microscopici, particelle minerali o granuli sono stati rilevati nel citoplasma delle cellule epiteliali renali, nella matrice extracellulare sotto la membrana basale e all'interno del lume dei tubuli contorti prossimali e distali (Fig. 3A, B, le particelle sono ingrandite nei pannelli A1–A4 e B1–B4). Sono state osservate anche NP minerali all'interno delle cellule che rivestono le anse di Henle e i dotti di raccolta (Fig. 3C, D, ingrandite nei pannelli C1, C2 e D1). Alcune particelle sono state trovate all'interno delle vescicole intracellulari nelle cellule renali (Fig. 3A, pannelli A1 e A2). L'approccio della microscopia elettronica qui utilizzato ci ha anche permesso di visualizzare l'interno delle particelle minerali; alcune particelle ospitavano anelli densi di elettroni alternati a strati leggeri di elettroni-lucenti (Fig. 3A, pannelli A3 e A4, Fig. 3C, pannello C1). Diversi vasi sanguigni, come i vasa recta rents (le arterie diritte del rene), sono circondati da un gran numero di NP minerali (Fig. 3D, pannello D1). Sono state quindi trovate NP minerali in varie posizioni in tutti i tessuti renali umani che mostravano segni di calcificazione ectopica, mentre non sono state trovate particelle nei controlli sani esaminati.

Le particelle minerali trovate nei tessuti renali sembrano essere molto simili alle NP mineralo-organiche descritte che si formano spontaneamente nei fluidi corporei nei nostri studi precedenti15,17 (e che abbiamo chiamato bioni24). Per verificare questa possibilità, abbiamo preparato NP minerali organici (o bioni) utilizzando un metodo di precipitazione come descritto in precedenza15. Questo metodo consiste nell'aggiungere ioni precipitanti come calcio e fosfato in un mezzo di coltura cellulare (mezzo dell'Aquila modificato di Dulbecco o DMEM) contenente un fluido corporeo come un siero umano (HS), seguito da incubazione in condizioni di coltura cellulare (vedi Metodi). Le particelle prodotte in questo modo (HS-NPS) erano sferiche o ellissoidi e mostravano una superficie minerale liscia o cristallina (Fig. 4A-E), simile alle particelle descritte in precedenza nei fluidi corporei22,23 così come nell'ascite umana12 e arterie calcificate13. Le particelle minerali erano molto simili alle NP minerali o ai granuli osservati nei tessuti renali in termini di morfologia complessiva, struttura multistrato e caratteristiche della superficie (Fig. 4F-J). Anche le dimensioni delle particelle derivate da HS e dei granuli renali erano comparabili, con un diametro compreso tra 50 e 1.500 nm (Fig. 4A–E,F–J). Come notato sopra, alcuni granuli renali erano circondati da una membrana lipidica, che probabilmente rappresentava vescicole di carico intracellulari o vescicole di membrana extracellulare (Fig. 4H, I, le membrane sono indicate da frecce); tali strutture membranose erano assenti nei campioni HS-NP preparati in vitro (Fig. 4A-E). Queste osservazioni suggeriscono che i granuli renali sono simili alle NP mineralo-organiche assemblate nel siero.

Utilizzando l'analisi di diffrazione elettronica dell'area selezionata, abbiamo osservato che la fase minerale di HS-NP preparata in vitro consisteva in un nanomateriale policristallino (Fig. 4E, riquadro; notare i deboli anelli concentrici). Risultati simili sono stati ottenuti per i granuli renali (Fig. 4J, riquadro) e per le ossa e le calcificazioni ectopiche come descritto in studi precedenti33,35.

Abbiamo studiato la composizione chimica di HS-NPs e granuli renali utilizzando la spettroscopia a raggi X a dispersione di energia (EDX). Gli HS-NP hanno mostrato picchi importanti di carbonio (C), calcio (Ca), ossigeno (O) e fosforo (P) (Fig. 4K), coerenti con la presenza di un minerale di fosfato di calcio. Un basso picco di silicio (Si) è stato notato anche in HS-NPs (Fig. 4K), forse rappresentando un costituente particellare minore. I granuli renali hanno anche mostrato picchi di carbonio, calcio, ossigeno e fosforo, indicativi di un minerale di fosfato di calcio, insieme a picchi aggiuntivi di silicio e ferro (Fe) (Fig. 4L). I picchi di uranio (U) sono stati attribuiti all'acetato di uranile utilizzato come reagente di contrasto durante la preparazione del campione (la presenza di uranio in alcuni campioni di particelle minerali come i granuli renali e la sua assenza nel tessuto di controllo in Fig. 4M può essere attribuita all'elevata affinità dell'uranio per il fosfato, come riportato in precedenza35). Gli spettri EDX di controllo del tessuto renale che circondano le particelle hanno mostrato picchi di carbonio e ossigeno (Fig. 4M), suggerendo che calcio e fosforo si trovavano principalmente nelle particelle minerali.

Calcio: i rapporti di fosforo (Ca:P) di HS-NP e granuli renali variavano da 0,65 a 1,18. Questi rapporti differiscono dal valore teorico di 1,67 osservato per l'idrossiapatite stechiometrica, ma sono ancora all'interno dell'intervallo visto in precedenza per i cristalli di fosfato di calcio e apatite osservati a vari gradi di cristallizzazione15. Insieme, questi risultati confermano che i granuli renali sono costituiti da NP di fosfato di calcio.

È stato scoperto che varie proteine ​​inibiscono la calcificazione ectopica in modo sistemico nel corpo36,37. Inoltre, si ritiene che la corona proteica che si trova sulla superficie delle NP sintetiche determini la biodistribuzione e gli effetti delle particelle sulle cellule in vivo38,39. D'altra parte, la composizione proteica delle NP mineralo-organiche presenti nei tessuti renali umani rimane incompleta. Abbiamo scoperto in precedenza che l'albumina, la fetuina-A e l'apolipoproteina-A1 (apo-A1) rappresentano le principali proteine ​​che interagiscono con le NP mineralo-organiche formate nei fluidi corporei17,20. Qui abbiamo utilizzato l'etichettatura immunogold per esaminare la presenza e la posizione ultrastrutturale di queste proteine ​​all'interno dei granuli renali.

Abbiamo utilizzato anticorpi policlonali contro l'albumina sierica umana (HSA), la fetuina-A sierica umana (HSF), l'apo-1A umana e l'intera HS per esaminare la presenza di proteine ​​sieriche nelle HS-NP e nei granuli renali. La specificità degli anticorpi policlonali (preparati come descritto in precedenza25) è stata verificata mediante Western blotting (Fig. 5). Ciascuno degli anticorpi policlonali ha reagito positivamente con gli HS-NP preparati in vitro e con i granuli minerali trovati nei tessuti renali umani (Fig. 6A, B, pannelli A1–A3 e B1–B3; punti neri). Gli anticorpi hanno reagito principalmente con gli strati densi di elettroni o il nucleo scuro di HS-NP e granuli renali (Fig. 6A, B), indicando che queste aree scure possono contenere livelli più elevati di proteine ​​​​rispetto alle aree elettrone-lucenti. I controlli negativi eseguiti senza l'anticorpo primario non hanno prodotto alcuna reazione (Fig. 6A, B, pannelli A4 e B4, controllo). Abbiamo concluso che i granuli renali rappresentano NP mineralo-organiche simili alle HS-NP in base non solo alla loro morfologia e composizione minerale, ma anche al loro legame con i principali inibitori della calcificazione presenti nel siero.

Successivamente è stata utilizzata la microscopia a immunofluorescenza per confermare la presenza di granuli minerali contenenti HSA e HSF nei reni umani malati. Usando questa tecnica, i tessuti renali umani hanno mostrato

colorazione positiva per le due proteine ​​​​in varie aree, incluso l'interstizio che circonda i tubuli renali e il citoplasma delle cellule che delineano i tubuli (Fig. 7A, pannelli A1 e A2). In queste aree sono stati osservati anche aggregati proteici contenenti sia albumina che fetuina-A, sebbene in quantità inferiori rispetto alla colorazione delle singole proteine ​​(Fig. 7A e pannello A3, colorazione fusa in giallo). In particolare, abbiamo notato che la colorazione proteica rilevata dall'immunofluorescenza si sovrapponeva strettamente al pattern di calcificazione ectopica osservata usando la colorazione di von Kossa (Fig. 7A, B, la calcificazione è visibile come materiale nero indicato dalle frecce in B). Questi risultati forniscono un ulteriore supporto per la presenza di particelle mineralo-organiche nei tessuti renali umani esaminati.

Discussione

Sebbene siano stati compiuti progressi nella nostra comprensione delle interazioni tra NP sintetiche e cellule umane, sappiamo molto meno degli effetti delle NP mineralo-organiche che si formano spontaneamente nei fluidi corporei. I nostri studi precedenti hanno dimostrato che queste particelle si formano nei fluidi biologici quando le concentrazioni di calcio e fosfato superano la saturazione15,16. Abbiamo anche osservato che queste particelle sono interiorizzate dalle cellule immunitarie ma che solo le particelle di grandi dimensioni inducono reazioni immunitarie pro-infiammatorie23. Tuttavia, la distribuzione di queste particelle nei tessuti umani e se svolgono ruoli fisiologici o patologici nel corpo non è stata finora esaminata.

Nel presente studio, abbiamo rilevato per la prima volta NP mineralo-organiche nei reni di pazienti umani affetti da malattia renale allo stadio terminale o cancro renale. Le NP mineralo-organiche rilevate contengono fosfato di calcio scarsamente cristallizzato simile al minerale osseo, nonché albumina, fetuina-A e apo-A1 che agiscono come inibitori sistemici della calcificazione nei fluidi corporei. I nostri risultati sono in accordo con i precedenti rapporti che descrivevano la presenza di complessi minerali-proteine ​​nei tessuti vascolari e nei fluidi corporei12,13,34,40. Poiché le particelle che abbiamo osservato sono state trovate in aree che non contengono calcificazioni microscopiche, le nostre osservazioni suggeriscono che le particelle possono rappresentare precursori della calcificazione ectopica nei tessuti umani. Data la possibilità che le NP mineralo-organiche possano crescere gradualmente di dimensioni e subire una conversione da particella a film in condizioni favorevoli come descritto nei nostri studi precedenti15,18, le osservazioni qui presentate suggeriscono che i precursori minerali possono portare alla formazione di depositi minerali in vivo, come placca di Randall e calcoli renali.

Le nostre osservazioni che le calcificazioni ectopiche minerali e le NP mineralo-organiche si trovano in varie strutture anatomiche dei reni sono coerenti con i precedenti risultati di calcificazioni ectopiche in questo organo41. Le osservazioni di Evan et al. hanno indicato che la mineralizzazione nei reni di pazienti con nefrolitiasi può iniziare e verificarsi prevalentemente nel tessuto interstiziale delle anse di Henle40,42. Questi autori hanno osservato che i depositi minerali che si formano in quest'area possono sporgere dal lato basale dell'urotelio e portare alla formazione di calcoli renali. Le nostre osservazioni suggeriscono che, oltre alle anse di Henle, altre aree renali possono contenere NP minerali che possono eventualmente evolversi per formare grandi depositi minerali nei reni umani. Stiamo anche studiando la possibilità che le NP minerali che si formano nella circolazione sanguigna possano traslocare nei tessuti renali e indurre calcificazione ectopica e formazione di calcoli nei reni.

Diversi granuli renali rilevati nel presente studio si trovano all'interno di vescicole intracellulari o extracellulari (Fig. 4H, I) e sono simili alle vescicole della matrice che hanno dimostrato di indurre calcificazione nelle ossa e nei denti7,8. Abbiamo recentemente osservato che le vescicole isolate dal siero umano e animale inducono la formazione di NP minerali e precipitati microscopici in vitro25. Schlieper et al.34 hanno anche osservato che le particelle minerali presenti nelle arterie sono associate alle strutture della membrana e hanno proposto che le vescicole della matrice oi corpi apoptotici possano rappresentare nucleatori di particelle minerali in questi tessuti. Allo stesso modo, Khan et al. hanno riferito che i depositi di fosfato di calcio trovati nei reni di pazienti umani con calcoli renali idiopatici sono associati alle fibre di collagene e alle vescicole della matrice9. Questi risultati suggeriscono che le NP mineralo-organiche rilevate nei tessuti renali possono formarsi attraverso un meccanismo che coinvolge le vescicole di membrana, una situazione analoga a quella che si osserva nelle arterie aterosclerotiche7,8. D'altra parte, uno studio recente ha mostrato che la calcificazione ectopica riscontrata nelle arterie mammarie delle donne non era associata a marcatori cellulari osteogenici o apoptotici43, suggerendo che il meccanismo della calcificazione potrebbe essere specifico dell'organo o del contesto biologico coinvolti. Inoltre, NP mineralo-organiche come quelle qui descritte possono anche formarsi tessuti renali umani a causa del mancato mantenimento delle concentrazioni fisiologiche di ioni (es. calcio e fosfato) e inibitori della calcificazione (es. albumina, fetuina-A e apo -A1) nei fluidi corporei dell'uomo.

I nostri risultati suggeriscono che lo strato denso di elettroni e il nucleo delle NP minerali-organiche possono contenere livelli più elevati di proteine ​​​​e molecole organiche rispetto alle aree elettrone-lucente delle particelle (Fig. 6A, B). Questi strati densi di elettroni sembrano essere mineralizzati come si vede dalla natura cristallina di questo materiale sotto TEM (vedi Fig. 4A–J). Altri autori, tra cui Ryall41 e Evan et al.44, hanno proposto che lo strato elettrone-lucente possa rappresentare minerali mentre gli strati elettroni-densi possono corrispondere a molecole organiche. Queste interpretazioni possono essere dovute almeno in parte al modo in cui i campioni sono stati elaborati ed esaminati in ciascuno studio, nonché alla natura dei tessuti di partenza utilizzati.

Oltre a svolgere un ruolo nella calcificazione ectopica, le particelle minerali-organiche possono indurre infiammazione nei tessuti renali. Abbiamo dimostrato di recente che mentre le NP mineralo-organiche non riescono a indurre la secrezione di interleuchina pro-infiammatoria-1 da parte dei macrofagi umani, gli aggregati minerali più grandi di 1 μm sono in grado di farlo23. È stato dimostrato che il rilascio di interleuchina-1 in risposta a materiali cristallini si basa sull'attivazione di complessi molecolari intracellulari chiamati inflammasomi45-47. Inoltre, le particelle minerali sono state rilevate nei reni che ospitano tumori e l'associazione tra cancro e infiammazione è ora ben riconosciuta48. Resta da studiare la possibilità che particelle minerali aggregate possano attivare un inflammasoma e contribuire allo sviluppo di infiammazione e cancro nei reni o in altri tessuti.

Oltre alla calcificazione ectopica, i granuli minerali qui descritti possono partecipare ad altri processi patologici. Ad esempio, abbiamo proposto in precedenza che le NP minerali possono legarsi a varie proteine ​​nei fluidi corporei e impoverire queste molecole organiche dai fluidi corporei20,26. D'altra parte, il corpo umano può prevenire la formazione e l'accumulo di NP minerali in circostanze normali facendo affidamento sulla presenza di inibitori della calcificazione e del sistema reticoloendoteliale (cioè i macrofagi). Le NP minerali possono quindi accumularsi solo una volta che l'omeostasi sistemica o locale del calcio è perturbata e quando i meccanismi protettivi nel corpo umano hanno fallito.

Proponiamo che l'approccio nanomateriale sviluppato qui possa essere utilizzato per studiare la formazione di NP mineralo-organiche nei tessuti animali e umani. Ad esempio, gli anticorpi generati contro le proteine ​​inibitorie della calcificazione come albumina, fetuina-A e apo-A1 possono essere utilizzati in combinazione con l'analisi minerale per rilevare e caratterizzare la formazione di NP mineralo-organiche nei tessuti di modelli animali. I risultati ottenuti utilizzando questo approccio possono essere applicati a misurazioni cliniche effettuate sui fluidi corporei umani al fine di identificare parametri biologici che riflettono lo stato di formazione di particelle minerali e calcificazione ectopica nel corpo. Ci aspettiamo che questa conoscenza possa portare allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per prevenire e curare le malattie e le condizioni umane associate alla calcificazione ectopica.

Metodi

Tessuti renali.L'uso di tessuti umani e gli esperimenti eseguiti in questo studio sono stati approvati dall'Institutional Review Board del Chang Gung Memorial Hospital; i metodi e le sperimentazioni sono stati effettuati secondo le linee guida approvate. Il consenso informato scritto è stato ottenuto dai pazienti. I tessuti renali sani di controllo sono stati ottenuti da biopsie di pazienti con trauma ed ematoma senza storia di malattia renale (n=2); i tessuti renali sono stati ottenuti anche da pazienti con carcinoma renale (n=20) e da pazienti con malattia renale allo stadio terminale (n=2) i cui reni sono stati rimossi o sottoposti a biopsia durante un intervento chirurgico di trapianto (Tabella 1). Per i tessuti del cancro renale, la parte non cancerosa del tessuto è stata sezionata e analizzata nel presente studio.

Analisi istologica.I tessuti renali sono stati montati su blocchi di paraffina. I blocchi sono stati sezionati e le fette di tessuto sono state riscaldate su una piastra calda a 70 gradi per 30 minuti per rimuovere la paraffina. Le sezioni sono state immerse in una soluzione fresca di xilene tre volte per 15 minuti per rimuovere completamente la paraffina rimanente. Le sezioni sono state reidratate con il 95 percento, l'80 percento e il 70 percento di etanolo per 5 minuti ogni volta. I campioni reidratati sono stati lavati con acqua bidistillata (ddH2O) per 5 minuti. I nuclei cellulari sono stati colorati con ematossilina per 8 minuti. Il colorante è stato rimosso dai campioni con acqua tiepida per 10 minuti. I campioni di rene sono stati risciacquati in ddH2O e sono stati immersi 10 volte in etanolo al 95%. I campioni trattati con etanolo sono stati controcolorati con eosina Y per 1 minuto. I campioni sono stati disidratati con il 95% e il 100% di etanolo per 10 minuti ogni volta, seguiti da una fase di disidratazione in xilene per 10 minuti. I campioni finali di rene disidratato sono stati montati su vetrini con il 50 percento di glicerolo e osservati al microscopio ottico dotato di una fotocamera digitale.

I campioni deparaffinati e reidratati sono stati preparati come descritto per la colorazione H&E. Le sezioni reidratate sono state colorate con nitrato d'argento (5 percento), seguito da esposizione alla luce UV per 20 minuti. La soluzione è stata lavata con ddH2O per 15 minuti. Le sezioni sono state colorate con tiosolfato di sodio (5%) per 5 minuti, seguite da un lavaggio con ddH2O per 15 minuti. Le sezioni sono state colorate con rosso nucleare veloce (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI) per 5 minuti. I campioni colorati sono stati disidratati successivamente con 95% e 100% di etanolo per 10 minuti ciascuno, prima della disidratazione in xilene per 10 minuti. I campioni di rene sono stati montati su vetrini ed esaminati come descritto sopra.

Microscopia elettronica e analisi EDX.I campioni di rene sono stati tagliati in piccoli pezzi di meno di 1 mm di spessore utilizzando un microscopio da dissezione LGPS (Olympus, Tokyo, Giappone). I tessuti sono stati fissati con glutaraldeide al 2,5% e paraformaldeide all'1% in tampone cacodilato 0.1 M a 4 gradi durante la notte. I campioni fissati sono stati lavati tre volte con tampone cacodilato 0.1 M in saccarosio all'8% (pH 7,2) in ghiaccio per 10 minuti. I tessuti lavati sono stati incubati in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4) contenente l'1% di tetrossido di osmio e l'1,5% di ferrocianuro di potassio per 2 ore su ghiaccio. I tessuti sono stati lavati con ddH2O su ghiaccio per 10 minuti tre volte. I tessuti lavati sono stati colorati su ghiaccio con acetato di uranile all'1% in ddH2O per 1 ora, prima di lavarli tre volte con ddH2O su ghiaccio. I tessuti renali sono stati disidratati con 30, 50, 70, 80 e 90 percento di etanolo per 10 minuti ogni volta, tranne quando l'etanolo ha raggiunto il 70 percento, nel qual caso i campioni sono stati conservati a 4 gradi durante la notte. I tessuti sono stati colorati con acido fosfotungstico all'1% in etanolo al 95% per 15 minuti, prima della disidratazione con etanolo al 95% per 5 minuti. I campioni sono stati immersi in ossido di propilene al 40, 57, 67 e 100 percento in etanolo per 10 minuti ogni volta, seguiti da un'altra immersione in ossido di propilene al 100 percento per 5 minuti. I tessuti renali sono stati infiltrati con 50, 70 e 100 percento di Eponate 812 (Ted Pella, Redding, CA) per 1 ora ogni volta. Sono stati preparati campioni renali incorporati in eponato 812-incubando due volte in eponato al 100%. I campioni incorporati sono stati incubati in un forno a 60 gradi durante la notte per consentire la polimerizzazione della resina.

I pellet HS-NP lavati ottenuti come sopra sono stati fissati con glutaraldeide (2,5 percento) e paraformaldeide (1 percento) in ddH2O per 4 ore a 4 gradi. I pellet fissi sono stati lavati con ddH2O tre volte per 10 minuti ogni volta. I pellet sono stati disidratati con successive incubazioni in 30, 50, 70, 80, 90, 95 e 100 percento di etanolo, per 10 minuti ogni volta, tranne quando l'etanolo ha raggiunto il 70 percento, in cui i pellet sono stati conservati a 4 gradi durante la notte. Altre soluzioni di etanolo sono state messe a contatto con i pellet solo per 10 minuti. I pellet disidratati sono stati infiltrati con mezzo di incorporamento bianco LR (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) utilizzando diversi rapporti di etanolo e mezzo LR (3:1, 1:1 e 1:3) per 30 minuti ciascuno. I pellet sono stati infiltrati con mezzo LR fresco (100%) durante la notte prima della polimerizzazione. I pellet infiltrati con mezzo LR sono stati incubati in un forno a 60 gradi per 2 giorni per consentire la polimerizzazione della resina. Blocchi di rene e HS-NP sono stati sezionati per produrre fette con uno spessore di 70-100 nm utilizzando un microtomo Reichert Ultracut S (Leica, Wetzlar, Germania). Le sezioni di tessuto sono state colorate con acetato di uranile al 4% prima della visualizzazione al microscopio elettronico a trasmissione JEM 1230 (JEOL, Tokyo, Giappone) operato a 100 kV. I modelli di diffrazione elettronica sono stati ottenuti utilizzando lo stesso sistema. Come supporto sono state utilizzate griglie di nichel.

Per l'analisi EDX, sezioni sottili di tessuti renali sono state colorate con acetato di uranile e lavate con ddH2O come sopra, seguite dall'essiccazione in un essiccatore elettronico. I campioni sono stati osservati al microscopio elettronico a trasmissione JEM 2100 ad alta risoluzione (JEOL) operato a 120 kV. Gli spettri EDX sono stati ottenuti in triplicato utilizzando un sistema INCA Energy EDS (Oxford Instruments, Abingdon, Regno Unito). Sezioni sottili di HS-NPs sono state osservate senza colorazione.

Preparazione di NP mineralo-organiche.Tutte le soluzioni di partenza sono state regolate a pH 7,4 e sterilizzate mediante filtrazione attraverso membrane 0.2μm prima dell'uso. L'HS è stato ottenuto da volontari umani sani utilizzando una tecnica di venipuntura convenzionale. L'uso di fluidi biologici umani in questo studio è stato approvato dall'Institutional Review Board del Linko Chang Gung Memorial Hospital ed è stato ottenuto il consenso informato scritto dai volontari. Gli HS-NP sono stati preparati aggiungendo 3 mM di CaCl2 e Na2HPO4 ciascuno in DMEM (Gibco, Carlsbad, CA) contenente il 10% di HS, seguito da incubazione per una settimana in condizioni di coltura cellulare (37 gradi, 5% di CO2, aria umidificata). Le particelle sono state pellettate mediante centrifugazione a 16,000 × g per 15 minuti a 4 gradi e lavate due volte con tampone HEPES (20 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) utilizzando la stessa procedura di centrifugazione.

SDS-PAGE e Western blotting.L'analisi SDS-PAGE e Western blot è stata eseguita essenzialmente come prima15. In breve, 0.2 ug (Fig. 5A,D) o 1,2 ug (Fig. 5B,C) di proteine ​​HS, 47 ug (Fig. 5A,B,D) o 590ug di proteine ​​HS-NP (Fig. 5C), 0.1ug di HSA (Fig. 5A–D) e 0.6ug (Fig. 5A, C, D) o {{23} }.15ug di HSF (Fig. 5B) sono stati disciolti in 5 × "tampone di caricamento" (0.313 M Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 0,05% blu di bromofenolo, 50% glicerolo, 12,5% - mercaptoetanolo) a una concentrazione finale di 1 ×, prima del riscaldamento a 95 gradi per 5 minuti e della separazione in condizioni di denaturazione e riduzione su una SDS-PAGE al 10 percento utilizzando un sistema mini-gel (Hoefer, Holliston, MA). Il controllo NP (utilizzato nella corsia 1 di Fig. 5A-D) consisteva in NP minerali preparati aggiungendo 3 mM CaCl2 e Na2HPO4 ciascuno in DMEM (volume finale di 1 ml), seguito da incubazione per un giorno in condizioni di coltura cellulare; le particelle sono state pellettate mediante centrifugazione a 16,{49}} × g per 15 minuti, lavate due volte con tampone HEPES e risospese in 50 ul di tampone HEPES. Un'aliquota di 20 ul di particelle risospese è stata elaborata per SDS-PAGE come sopra. Le membrane PVDF sono state bloccate per 1 ora in latte sgrassato al 5% (p/v) a temperatura ambiente. Gli anticorpi primari generati internamente come descritto in precedenza25 sono stati utilizzati a una diluizione di 1:1,000 ( -apo-A1 e -HS-NP), 1:3,000 ( -HSF) , o 1:6,000 (-HSA). L'anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano di capra anti-coniglio è stato utilizzato sulla base delle istruzioni fornite dal produttore (Millipore, Billerica, MA). Le macchie sono state rivelate utilizzando una chemiluminescenza potenziata (Amersham Biosciences, Amersham, Regno Unito) e pellicole autoradiografiche.

Etichettatura Immunogold.I campioni sono stati preparati per l'osservazione TEM. I blocchi HS-NP sono stati sezionati in fette di spessore inferiore a 70 nm. Le sezioni di campione sulle griglie sono state bloccate con gelatina di pesce all'1% (Sigma) in tampone HEPES 0.1 M (pH 8,0) per 25 minuti. Le griglie sono state incubate con i seguenti anticorpi primari: -HSA, 1:30; -HSF, 1:50; -apo-A1, 1:30; -HS-NP, 1:60. Il controllo negativo non conteneva anticorpi primari (1% di gelatina di pesce in tampone HEPES). Le sezioni incubate sono state risciacquate con tampone HEPES per 15 minuti. Le sezioni risciacquate sono state bloccate con gelatina di pesce all'1% in tampone HEPES per 20 minuti. I campioni sono stati trattati con IgG anti-coniglio di capra coniugato con oro nm 5- secondario per 1 ora. I campioni sono stati lavati con tampone HEPES per 10 minuti, prima del lavaggio con ddH2O per 10 minuti. Le osservazioni TEM sono state eseguite come sopra.

Microscopia a fluorescenza.I vetrini istologici di tessuto renale preparati come sopra sono stati bloccati con albumina di siero bovino all'1% per 1 ora a temperatura ambiente. I vetrini sono stati incubati con anticorpi policlonali primari a una diluizione di 1:4,000. Dopo le fasi di lavaggio, i campioni sono stati incubati con gli anticorpi secondari capra anti-coniglio-FITC (492/520 nm) e capra anti-coniglio-TRITC (550/570 nm) (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) a 1:100 per 1 ora I complessi sono stati lavati con PBST per 15 minuti. La colorazione fluorescente 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) è stata utilizzata a 10 ug/ml per 15 minuti. I campioni colorati con DAPI sono stati disidratati con 95 e 100% di etanolo per 10 minuti ciascuno, seguiti da disidratazione in xilene per altri 10 minuti. I campioni di rene disidratato sono stati montati con il mezzo di montaggio Vectashield fluorescence H-1000 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) e sono stati osservati al microscopio confocale (LSM510 Meta; Zeiss, Oberkochen, Germania) dotato di una fotocamera Spot Flex.

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Riferimenti

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