I flavanoli di cacao dietetici migliorano la funzione mitocondriale nel muscolo scheletrico e modificano il metabolismo di tutto il corpo nei topi sani

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Astratto: La disfunzione mitocondriale è ampiamente segnalata in varie malattie e contribuisce alla loro patogenesi. Abbiamo valutato l'effetto diflavanoli di cacaointegrazione sulla funzione mitocondriale e sull'intero metabolismo e abbiamo esaminato se la deacetilasi mitocondriale sirtuina-3 (Sirt3) è coinvolta o meno. Abbiamo esplorato gli effetti di 15 giorni di integrazione di FC in wild type e Sirt3-/topi. Il metabolismo dell'intero corpo è stato valutato mediante calorimetria indiretta e per valutare è stato eseguito un test di tolleranza al glucosio oralemetabolismo del glucosio. La funzione respiratoria mitocondriale è stata valutata in fibre permeabilizzate e il contenuto di nucleotidi piridinici (NAD plus e NADH) è stato quantificato. Nel tipo selvaggio, la supplementazione di FC ha modificato significativamente il metabolismo di tutto il corpo promuovendo l'uso di carboidrati e una migliore tolleranza al glucosio. La supplementazione di FC ha indotto un aumento significativo della massa mitocondriale, mentre si è verificato un significativo adattamento qualitativo per mantenere la produzione di H2O2 e lo stress ossidativo cellulare. La supplementazione di FC ha indotto un aumento significativo del contenuto di NAD plus e NADH. Tutti gli effetti sopra menzionati sono stati attenuati nei topi3-7Sirt. Collettivamente, la supplementazione di FC ha potenziato il metabolismo del NAD che stimola il metabolismo delle sirtuine e ha migliorato la funzione mitocondriale, che probabilmente ha contribuito all'adattamento osservato del metabolismo di tutto il corpo, con una maggiore capacità di utilizzare i carboidrati, almeno in parte attraverso Sirt3.

Parole chiave: flavanoli di cacao; metabolismo del NAD; massa mitocondriale; metabolismo del glucosio; muscolo scheletrico

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1. Introduzione

I mitocondri sono organelli subcellulari coinvolti in molteplici funzioni cellulari, come la trasduzione di energia attraverso la fosforilazione ossidativa mitocondriale e la produzione di perossido di idrogeno mitocondriale o l'attivazione della morte cellulare mediata dai mitocondri [1-3]. Prove emergenti suggeriscono che la disfunzione mitocondriale è coinvolta in molte patologie e gioca un ruolo centrale nella loro patogenesi [4]. Il nostro gruppo ha riportato una compromissione mitocondriale in pazienti con diabete di tipo 1 molto prima delle complicanze cliniche [5]. Inoltre, con l'invecchiamento si verifica una diminuzione della capacità ossidativa mitocondriale anche nelle persone sane [6]. Pertanto, l'identificazione di strategie per mitigare queste disfunzioni o aumentare la massa mitocondriale sono opportunità per prevenire, o almeno ridurre, l'incidenza di molti disturbi o aumentare la capacità aerobica di soggetti sani.

In questo contesto, è di interesse l'identificazione di composti sicuri e naturali che migliorano la funzione mitocondriale e il metabolismo di tutto il corpo con o senza effetti collaterali limitati. Tra i composti naturali,flavanoli di cacao(CF) sono considerate molecole promettenti poiché è stato dimostrato che il loro consumo influisce positivamente sulla salute cardiovascolare, sulla resistenza all'insulina o sulla funzione immunitaria [7]. In effetti, è stato dimostrato che la FC migliora il metabolismo del glucosio e una somministrazione a breve termine di FC è seguita da un aumento della sensibilità all'insulina, anche nei pazienti ipertesi intolleranti al glucosio [8,9].

Tra i flavanoli, (-)-epicatechina (EPI) è il monomero più comunemente trovato nella FC e l'EPI è considerata la principale molecola biodisponibile e bioattiva della FC [10]. Un consistente corpo di prove indica che l'integrazione di EPI migliora la funzione mitocondriale e/o il contenuto nel muscolo scheletrico [11]. La supplementazione di EPI stimola percorsi multipli che convergono sull'attivatore gamma del recettore proliferatore del perossisoma 1-alfa(PGCl) e sui principali complessi trascrizionali nucleari. L'EPI migliora direttamente la generazione di ossido nitrico, che stimola la biogenesi mitocondriale [11]. Contemporaneamente, anche le sirtuine 1 e 3 sono stimolate dalla supplementazione di EPI [11]. L'uso di proantocianidine, oligomericoflavonoidiche contengono EPI, hanno dimostrato di aumentare i livelli intracellulari di nicotinamide adenina dinucleotide (NAD plus) attraverso l'aumento di diversi precursori per la biosintesi di NAD e sovraregolare i livelli di mRNA della sirtuina{0}} nel fegato di ratto [12]. La famiglia delle sirtuine (Sirt), una deacetilasi NAD-dipendente, comprende sette membri che differiscono per distribuzione subcellulare, specificità del substrato e funzioni cellulari [13]. Sirt1, un membro ampiamente studiato di questa famiglia, stimola la biogenesi mitocondriale promuovendo la deacetilazione di PGCl, migliorando così la sua attività trascrizionale [14]. Sirte, un sensore metabolico chiave, è stato stimolato dopo la somministrazione di EPI [12,{7}}]. Tuttavia, l'influenza dell'EPI su altre sirtuine non è stata esplorata. La valutazione dell'effetto EPI sarà particolarmente interessante sulle sirtuine localizzate all'interno dei mitocondri (Sirt3, Sirt 4 e Sirt5), che sono note per modulare l'attività del ciclo di Krebs e degli enzimi della catena respiratoria [18]. Sirt3, che è altamente espresso nei tessuti con elevato turnover metabolico e contenuto mitocondriale, è di particolare interesse per il suo ruolo critico nel mantenimento della normale funzione mitocondriale attraverso la deacetilazione reversibile della lisina proteica [19-21]Inoltre, Sirt3 svolge un ruolo importante nel regolazione del metabolismo di tutto il corpo [20. Sirt3 ha dimostrato di essere alterato nel muscolo scheletrico di modelli di diabete di tipo 1 e di tipo 2 e malattie cardiovascolari [22,23]. Inoltre, è stato suggerito che l'attivazione di Sirt3 potrebbe rappresentare una promettente strategia terapeutica per migliorare la funzione mitocondriale e il metabolismo [23,24]. Pertanto, è interessante determinare se Sirt3 sia alla base di parte degli effetti benefici della supplementazione di FC sul metabolismo di tutto il corpo e sulla funzione mitocondriale.

In questo studio, abbiamo utilizzato un approccio integrativo per studiare, nei topi, l'effetto di una supplementazione di 15-giorno CF. Abbiamo ipotizzato che la supplementazione di FC avrebbe: (i) modificare il metabolismo di tutto il corpo emetabolismo del glucosio, (ii) aumentare la funzione mitocondriale nel muscolo ossidativo e glicolitico nelle fibre permeabilizzate e (ii) aumentare il metabolismo del NAD. Abbiamo anche esplorato il presunto coinvolgimento di Sirt3 nella biogenesi mitocondriale indotta da CF e nel metabolismo di tutto il corpo. Le nostre ipotesi erano che gli effetti della FC sul metabolismo di tutto il corpo e sulla massa mitocondriale sarebbero stati attenuati nei topi Sirt3-7.

2. Metodi

2.1. Animali e dieta

Per questo studio, topi maschi di 129S1/SvlmJ 10-di una settimana sono stati acquistati dai Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA). Per determinare se le sirtuine sono coinvolte nell'adattamento della massa mitocondriale e della funzione indotto dalla somministrazione di FC, abbiamo anche utilizzato 10- topi maschi knock-out Sirt3 di una settimana sullo stesso ceppo del tipo selvaggio [25]. I Sirt3/topi sono stati utilizzati per esplorare il coinvolgimento di Sirt3 nella biogenesi mitocondriale indotta da CF e negli adattamenti del metabolismo di tutto il corpo. I topi sono stati tenuti in una stanza a una temperatura regolata di 23-25 gradi e illuminazione controllata (12-h cicli di luce e buio). Gli animali avevano accesso a cibo per roditori e acqua del rubinetto ad libitum.

Dopo almeno una settimana di assuefazione nella struttura animale, gli animali da esperimento hanno ricevuto la supplementazione di FC tramite sonda gastrica di un estratto naturale (302,1 mg/kg di peso corporeo due volte al giorno per 15 giorni) risospeso in una carbossimetilcellulosa (Sigma-Aldrich, St. Louis , Mo, USA). La composizione della polvere di cacao è descritta nella Tabella 1 ed è stata ottenuta da Naturex (Quart de Poblet, Spagna). La composizione è stata stabilita con il metodo della cromatografia liquida ad alta prestazione e 100 mg dell'estratto equivalgono a una media di 475 mg di semi secchi di cacao. I topi di controllo hanno ricevuto un veicolo composto da un contenuto simile di teobromina e caffeina disciolti in carbossimetilcellulosa mediante sonda gastrica. La dose giornaliera è stata determinata in base alla guida del settore che converte la dose umana in dosi equivalenti agli animali in base alla superficie corporea e abbiamo moltiplicato la dose umana per 12,3 [26]. La sonda gastrica è stata eseguita da un tecnico esperto.

2.2. Collezione di tessuti1

Ventiquattro ore dopo l'ultima sonda gastrica, gli animali non a digiuno sono stati anestetizzati utilizzando ketamina e xilazina (rispettivamente: 100 e 10 mg/kg). La raccolta dei tessuti è stata eseguita immediatamente dopo il raggiungimento dell'anestesia. Il soleo e la porzione bianca del gastrocnemio sono stati asportati. I campioni sono stati immediatamente congelati in azoto liquido e conservati a -80 gradi per analisi successive o utilizzati per preparare le fibre muscolari spellate.

2.3. Valutazioni dell'attività metabolica e fisica

La calorimetria indiretta e l'attività fisica spontanea sono state misurate utilizzando il sistema completo di monitoraggio degli animali da laboratorio (CLAMS; Columbus Instruments, Columbus, OH, USA). I topi sono stati alloggiati individualmente nelle camere a 28 gradi, con luce da 07h00 a 19h00 e accesso ad libitum al cibo dei roditori e all'acqua del rubinetto. I topi sono stati acclimatati alle gabbie metaboliche per tre giorni prima del primo giorno di raccolta dei dati. La raccolta dei dati è stata effettuata il quindicesimo giorno di integrazione. Il consumo di ossigeno (VO2), la produzione di anidride carbonica (VCO2) e il rapporto di scambio respiratorio (RER) sono stati misurati con un flusso d'aria di 0,5 l/min e un'aria campione di 0,4 l/ min. La frequenza cumulativa relativa percentuale (PCRF) della RER è stata determinata in un periodo di 24-h come descritto in precedenza da Riachi et al. (2004). In breve, la PCRF è stata determinata aggiungendo la frequenza di ciascun punto dati alla sequenza di incremento precedente (da 0,65 a 1,20 con un incremento di 0,01)[27]. La flessibilità metabolica è stata determinata dalla pendenza di Hill (valore H) e dal 50° percentile (EC50) della curva PRCF e misurando l'ampiezza della RER su 24 h (Riachi et al.2004). L'attività fisica generale è stata monitorata utilizzando un sistema di sensori a raggi infrarossi che ha rilevato l'attività degli assi xez. Sono stati valutati sia i conteggi totali (ogni volta che un raggio viene interrotto) sia i conteggi ambulatoriali (ogni volta che un nuovo raggio viene interrotto). Un conteggio X-totale (X-TOT) viene registrato quando l'animale si muove orizzontalmente per più di 0,5 pollici ed è rappresentativo di attività ripetitive su piccola scala, come graffiare e toelettatura. Il conteggio X-ambulatorio (X-AMB) misura la locomozione effettiva registrando un conteggio solo quando l'animale rompe un nuovo raggio. Un conteggio Z-totale (Z-TOT) viene registrato quando si verifica un movimento verticale di 1,5 pollici, ovvero l'allevamento (Abreu-Vieira 2016). Per la stima di carboidrati e grassiossidazioneda VO2 e VCO2, abbiamo utilizzato la tabella del quoziente respiratorio non proteico di Péronnet e Massicotte precedentemente utilizzata nei topi [28,29].

2.4. Massa corporea totale e massa grassa

La massa grassa totale e la massa magra totale sono state determinate in topi non anestetizzati mediante analisi di interferenza di risonanza quantitativa utilizzando l'analizzatore di risonanza magnetica a corpo intero EchoMRI (Echo Medical System, Houston, TX, USA). La massa grassa totale rappresentava la somma di tutto il grasso corporeo. La massa magra totale comprendeva principalmente muscoli e organi interni. È noto che la massa muscolare scheletrica rappresenta la porzione più grande della massa magra totale.

2.5.Test di tolleranza al glucosio orale (OGTT)

La glicemia è stata misurata utilizzando una goccia di sangue raccolta dalla coda con un glucometro (Accu-Chek Performa, Roche, Argentina). L'OGTT è stato eseguito su topi a digiuno da 5 a 6 ore. La misurazione è stata eseguita l'ultimo giorno di integrazione CF. Dopo la misurazione della glicemia basale (tempo O), i topi sono stati quindi iniettati per via orale con una soluzione al 20 percento di glucosio in acqua sterile a una dose di 1,5 g di glucosio·kg di peso corporeo-1. La glicemia è stata misurata a 15, 30, 60,90 e 120 minuti dopo l'iniezione della soluzione di glucosio. L'area incrementale della curva glicemica è stata quindi calcolata come misura della tolleranza al glucosio.

2.6.Analisi qRT-PCR

The forward (F) and reverse (R) primers of the selected genes used in this study are presented in Table 2. Total RNA was obtained from pulverized frozen white gastrocnemius muscle using Trizol reagent (Invitrogen Life Technologies, Rockville, MD, USA). The purity, integrity, and quantity of RNA were evaluated using a microplate reader (Synergy H1(Biotek Instruments, Winooski, Vermont). The sample was considered pure when the ratio OD260/OD280 was>1.8. Il cDNA è stato sintetizzato dall'RNA totale (2 μL) utilizzando il supermix di trascrizione inversa iScript per RT-qPCR (Biorad, Hercules, CA, USA). I prodotti RT totali sono stati analizzati mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa (PCR) utilizzando il 2x Platinium SYBR Green qPCR SuperMix-UDG secondo le specifiche del produttore (Invitrogen Lige Technologies, Burlington, Canada). Il ciclismo è stato ottenuto in un cycler CFX96 (Biorad, Hercules, California; condizioni: 95 gradi C per 10 minuti e 40 cicli di 95 gradi per 30 s, 55 gradi per 45 s e 72 gradi per 45 s). Alla fine di ogni corsa, l'assenza di formazione di primer-dimero e la presenza di un unico amplicone sono state confermate utilizzando la curva di fusione. I valori del ciclo soglia (Ct) sono stati utilizzati seguendo il metodo 2-A△Ct per analizzare i dati qPCR, con ß-actina o HPRT1 come gene housekeeping【30】. I valori quantitativi della RT-PCR erano correlati a quelli del gruppo di controllo, che erano impostati su 1.

2.7. Attività enzimatiche

La misurazione dell'attività specifica dei complessi della catena di trasporto degli elettroni e della citrato sintasi è stata eseguita spettrofotometricamente come descritto in precedenza [31]. I muscoli gastrocnemio bianchi congelati polverizzati (~ 30 mg) sono stati omogeneizzati con un omogeneizzatore di microsfere vibranti in 500 ul di tampone di omogeneizzazione (120 mM KCl, 20 mM di HEPES, 2 mM di MgCl2, 1 mM di EGTA e 5 mg·mL-Iof BSA , pH7,4) seguito dall'aggiunta di 500 μL di mezzo ipotonico (fosfato di potassio 25 mM e MgCl 5 mM, pH 7,2). I campioni sono stati quindi sottoposti a tre cicli di gelo-scongelamento in azoto liquido. I campioni sono stati centrifugati per 10 minuti a 600×g a 4 gradi e il supernatante è stato mantenuto in ghiaccio fino all'analisi. Il contenuto proteico è stato determinato nel surnatante in triplicato utilizzando un kit Pierce BCA Protein Assay (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).

L'attività della citrato sintasi (CS) è stata determinata spettrofotometricamente a 412 nm in seguito alla riduzione di 2 mM 5,5'-ditio-bis(2-acido nitrobenzoico) in presenza di 0.1 mM acetile -CoA e 12 mM di acido ossalacetico in tampone Tris 200 mM (pH 7,4). Il test NADH-decilubichinone ossidoreduttasi (complesso I) sensibile al rotenone è stato eseguito a 340 nm utilizzando l'accettore 2,3-dimetossi-5-metil-6-n-decil-14-benzochinone （ 80 μM） e NADH come donatore di elettroni （200 μM） in tampone Tris 10 mM（pH 8,0）. L'aggiunta di 4μM di rotenone è stata utilizzata per quantificare l'attività sensibile al rotenone. L'attività della citocromo ossidasi (complesso IV) è stata eseguita a 550 nm utilizzando 10μM di citocromo c ridotto come donatore e 2,5 mM di n-dodecil-ß-maltoside per permeabilizzare entrambe le membrane mitocondriali in tampone fosfato di potassio 100 mM (pH 7,0).

Tutti i test enzimatici sono stati determinati in triplicato e i risultati sono stati correlati a quelli del gruppo di controllo, che sono stati impostati su 100.

2.8. Valutazione mitocondriale

La respirazione mitocondriale e la produzione mitocondriale di H2O2 sono state studiate in situ in fibre permeabilizzate con saponina utilizzando il gastrocnemio bianco e i muscoli del soleo|1]. In breve, le fibre sono state separate al microscopio binoculare nella soluzione A a 4 gradi (in mM:2,77 CaK2 EGTA,7,23 K, EGTA,6,56 MgCl2, 20 taurine,0.5 DTT,5{ {50}} K-metano solfonati, 20 imidazoli, 5,7 Na2 ATP e 15 creatina-fosfato, pH 7,1) e permeabilizzati in soluzione A con 50 ug·mL-I di saponina per 30 minuti a 4 gradi. La funzione respiratoria mitocondriale è stata determinata in un ossimetro dotato di un elettrodo di tipo Clark (Oxygraph, Hansatech Instruments, Glasgow). La camera è stata riempita con 1 mL di soluzione B (in mM: 2,77 CaK, EGTA, 7,23 K, EGTA, 6,56 MgCl,, 20 taurina, 0,5 DTT, 50 K-metano solfonati e 20 imidazoli, pH 7,1) e dopo la registrazione contenuto di ossigeno di base nella camera, un fascio di 1-2 mg di peso secco di miofibre permeabilizzate è stato posto nella camera, che è stata quindi sigillata. Dopo le letture basali, sono state effettuate le seguenti aggiunte in sequenza: palmitoil carnitina e malato (160 μM∶5 mM), glutammato (10 mM), succinato (25 mM), rotenone (0,5 μm), il disaccoppiatore CCCP (1 μM), antimicina -A (8 uM) e N, N', N'-tetrametil-p-fenilendiammina dicloridrato e ascorbato (0,9:9 mM). La respirazione è stata misurata a 23 gradi sotto agitazione continua. Alla fine di ogni test, le fibre sono state accuratamente rimosse dalla cellula xilografica, asciugate e asciugate per almeno 24 ore a ~ 80°C per la determinazione del peso delle fibre. I tassi di consumo di O2 (JO2) sono stati espressi in nmol O2 min-1.(mg peso secco)-I. Tutte le misurazioni sono state eseguite almeno in duplicato.

Il rilascio netto di H2O2 da parte dei mitocondri respiratori è stato misurato in fasci di fibre permeabilizzate con la sonda fluorescente Amplex Red（20 μM∶emissione-eccitazione∶563-587 nm）, come descritto in precedenza [32]. Dopo la preparazione di fibre permeabilizzate, campioni

destinati alle misurazioni di H2O2 sono stati risciacquati tre volte nel tampone Z(in mM:110 K-Mes, 35 KCl,1 EGTA,5 K2HPO4, 3MgCl,6H2O e 0.5 mg:mL{ {14}} BSA, pH7,3 a 4 gradi). Fasci di fibre ({{20}}.3-1,0 mg di peso secco) sono stati incubati a 37 gradi in una microcuvetta di quarzo con agitazione magnetica continua in 600 ul di tampone Z(pH 7,3 a 37°C) integrato con 1,2 U·mL-I perossidasi di rafano. Le letture della fluorescenza di base sono state effettuate in assenza di substrati respiratori esogeni. Le seguenti aggiunte sono state quindi apportate in sequenza: glutammato (5 mM), succinato (5 mM), rotenone (0,5 uM), ADP (10 mM) e antimicina-A （8 μM). Al termine di ogni test, le fibre sono state accuratamente rimosso dalla cuvetta, asciugato e asciugato per determinare il peso della fibra. I tassi di produzione di H2O2 sono stati espressi in AU·min-1.(mg peso secco)-I e per capacità oxphos che corrispondevano alla massima respirazione mitocondriale in stato di fosforilazione. Tutte le misurazioni sono state eseguite almeno in duplicato.

La capacità di ritenzione del calcio mitocondriale (CRC) è stata valutata nelle fibre fantasma del muscolo gastrocnemio bianco come descritto in precedenza [33]. In breve, le fibre sono state incubate in una microcuvetta di quarzo sotto agitazione continua in 600 μL di tampone CRC (in mM∶250 saccarosio, 10 MOPS, 0,005 EGTA e 10P;-Tris, pH7,3). Le fibre sono state quindi esposte a un singolo impulso di 20 nM di Ca2 plus. I cambiamenti nella concentrazione di calcio extramitocondriale sono stati monitorati fluorimetricamente utilizzando calcio verde 5N(1 mM: eccitazione-emissione:505-535 nm). La suscettibilità dei pori di transizione della permeabilità (PTP) è stata valutata misurando il tempo richiesto per l'apertura del PTP e il CRC è stato preso come la quantità totale di Ca' accumulata dai mitocondri prima del suo rilascio. Alla fine di ogni test, le fibre sono state accuratamente rimosse dalla cuvetta, asciugate e asciugate per determinare il peso delle fibre. I valori di CRC sono stati espressi in nM di Ca2 più per mg di peso secco.

2.9. Analisi Western Blot

Le proteine ​​del gastrocnemio bianco e dei muscoli del soleo sono state diluite in tampone Laemmli e separate su gel di poliacrilammide prefabbricato Mini-PROTEAN TGX senza macchie all'10 percento (Biorad); uno standard interno è stato caricato su ciascun gel. La separazione elettroforetica è stata eseguita a 200 V per 35 minuti nel buffer di migrazione (TrisBase 25 mM, glicina 0.2 M e SDS 1% (p/v)). La tecnologia Stain-Free(SF) contiene un composto tri-alone brevettato che reagisce con le proteine, rendendole rilevabili attraverso l'esposizione ai raggi UV. L'imaging SF è stato eseguito utilizzando ChemiDoc MP Imager e Image Lab4.0.1 software (Biorad, Hercules, California, USA) con un 5-tempo di attivazione della colorazione minimo e sono stati pertanto visualizzati i pattern proteici totali. Le proteine ​​sono state quindi trasferite su un foglio di nitrocellulosa da 0,2 um utilizzando il Trans-Blot Turbo Transfer System (Biorad). La qualità del trasferimento è stata controllata mediante imaging di membrane utilizzando la tecnologia SF. Dopo la fase di trasferimento, le proteine ​​carboniliche sono state derivatizzate con dinitrofenilidrazina diluita in HCL 2N e infine sono state lavate estensivamente con metanolo. Le membrane sono state bloccate con il 5% di latte in polvere scremato in soluzione fisiologica tamponata con Tris contenente Tween-20 (TBST:15 mM Tris/HCl, pH7,6,140 mM NaCl e 0,05% di Tween-20) per 1 ora a temperatura ambiente. Le membrane sono state quindi incubate a 4 gradi durante la notte o 2 ore a temperatura ambiente con i seguenti anticorpi primari: anticorpo primario di carbonile proteico (Anti-DNP; #STA-308, Cell Biolabs) e SOD2 (#Ab13533, Abcam). Dopo tre lavaggi di 10 minuti in TBST, le membrane sono state analizzate con anticorpi secondari per il carbonile proteico (coniugato HRP; #STA-308, Cell Biolabs) e SOD2 (legato IgG-HRP anti-coniglio; #7074, Segnalazione cellulare) in soluzione bloccante per 2 ore a temperatura ambiente e infine sono stati ampiamente lavati con TBST. La diluizione degli anticorpi primari e secondari è stata ottimizzata per ciascun anticorpo. Il rilevamento della chemiluminescenza è stato eseguito utilizzando ECL Clarity (Biorad) e l'acquisizione delle immagini è stata eseguita con ChemiDocMP. Tutte le immagini sono state analizzate utilizzando il software Image Lab 4.0.1. La normalizzazione delle intensità del segnale proteico è stata effettuata in seguito alla quantificazione dei rispettivi livelli proteici totali su immagini SF, controllo del campione e standard interni.

2.10. Misurazione NAD

I livelli totali di NAD e NADH sono stati misurati nel gastrocnemio bianco omogeneizzato utilizzando un kit commerciale (#K337-100, Biovision, USA) e seguendo le istruzioni del produttore. In breve, è stato estratto il pool totale di NAD (NADt= NADt e NADH). Per ciascuno dei campioni estratti, metà del campione è stata riscaldata a 60 gradi per 30 minuti per decomporre il NADt mantenendo intatto il NADH. Entrambi i campioni NADt e NADH sono stati miscelati con l'enzima ciclico NAD e l'assorbanza è stata misurata a 450 nm. NADt e NADH sono stati quantificati confrontandoli con la curva standard NADH e normalizzando a mg di proteine. Infine, è stato calcolato il rapporto tra NAD più (NADt-NADH) e NADH. Tutti i test sono stati eseguiti in triplicato.

2.11. Statistiche

I dati sono riportati come media ± deviazione standard (DS). La normalità dei dati è stata valutata utilizzando il test di normalità D'Agostino-Pearson. L'analisi dei dati è stata eseguita utilizzando il test t di Student e l'ANOVA a due vie (gruppo e tempo) per misurazioni ripetute seguite dal test post hoc di Bonferroni utilizzando Prism8.4.1 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). È stato applicato un livello bilaterale del 5 percento per l'errore di tipo I.

3. Risultati

3.1. Composizione corporea e metabolismo di tutto il corpo

Quindici giorni di supplementazione per FC, nei topi wild-type(WT), non hanno modificato il peso corporeo(p=0.091), la massa magra(p=0.{{24} }73) e massa grassa valutata mediante EchoMRI (p=0.89; Figura 1A). I tassi di consumo di O2 espressi per massa magra erano significativamente più alti nel ciclo di buio (8±8 percento, p=0.042), mentre sono rimasti simili nel ciclo di luce (p =0 .392; Figura 1B.). Non ci sono stati cambiamenti nell'attività locomotoria (dati non mostrati). I topi CF hanno mostrato un aumento significativo del dispendio energetico di tutto il corpo del 15 ± 15 percento (p =0.042; Figura 1C) e in assunzione di cibo (0,08±0,01 vs.0,11±0,01 g per peso corporeo magro, rispettivamente gruppo CF e WT, p=0.013, Figura 1D).

La supplementazione di FC ha modificato significativamente il metabolismo dell'intero corpo: l'effetto principale di una RER più elevata nel gruppo di FC è stato osservato nell'arco di 24 ore(p=0.023, Figura 2A) e la RER media nell'arco di 12 ore era più alta nel gruppo FC in cicli di luce e buio( più 5±3 percento, p=0.035 e più 9±4 percento, rispettivamente, p=0.026). Inoltre, l'integrazione di CF ha promosso l'uso di carboidrati (CHO)(51±13% del consumo di energia dipendeva dall'ossidazione di CHO nel gruppo CF vs.37±12% nel gruppo di controllo durante il ciclo di luce,p=0.108 e 71±21% nel gruppo CF vs.47±24% nel gruppo di controllo durante il ciclo oscuro, p=0.004; Figura 2B.). Tuttavia, quando espresso in kJ, non c'era differenza nell'ossidazione CHO né nell'ossidazione degli acidi grassi (CHOossidazione: 3,7±1,4 kcal·d-1 nel controllo vs.4,4±1,7 kcal.massa corporea magra-1. d-1 in CF,p{38}}.33 e ossidazione degli acidi grassi: controllo 2,3±1,0 kcal·d-Iin vs.2,6±0,87 kcal.massa corporea magra-1.d{{ 50}}in CF,p=0.608). L'analisi di PRCF di RER ha rivelato un aumento dei valori di EC50 nel gruppo CF (p=0,009; Figura 2D), il che significa che CF induce uno spostamento verso un maggiore utilizzo di carboidrati. Una diminuzione della pendenza di Hill è stata osservata nel gruppo CF (valori H: 25,16±4,44 nei controlli vs.12,79±3,96 nel gruppo CF, p<0.001). moreover,="" the="" rer="" amplitude="" over="" 24h="" was="" increased="" by="" 31±="" 31%="" in="" the="" cf="" group="" (p="0.035)." cf="" supplementation="" improved="" glucose="" tolerance="" following="" oral="" glucose="" administration="" from="" unchanged="" baseline="" blood="" glucose="" levels="" after="" an="" overnight="" fast="" (figure="" 2e,p="0.003)." the="" area="" under="" the="" capillary="" blood="" glucose="" curve="" was="" lower="" in="" the="" cf="" group(1018±135="" vs.="" 1181±="" 170="" mm·120="" min,="" p="0.005;" figure="">

3.2. Bioenergetica mitocondriale

Abbiamo testato l'effetto della supplementazione di CF sull'energia dei mitocondri nel gastrocnemio bianco e nel muscolo soleo nei topi WT. È stata osservata una respirazione mitocondriale superiore utilizzando substrati IV complessi nei muscoli bianchi del gastrocnemio e del soleo (p=0.004 e p{2}}.028, rispettivamente; Figura 3A, B). Non è stata osservata alcuna modifica dei rapporti di respirazione CII/CI e CIV/CI (p =0.899 e p =0.701 per il gastrocnemio bianco e p=0.693 e p{{ 11}}.912 per i muscoli solei, rispettivamente, dati non mostrati). Inoltre, le attività del complesso,I, IV e della citrato sintasi erano significativamente aumentate nel muscolo gastrocnemio bianco (rispettivamente: più 31 ± 27 percento ,p=0.004; più 28 ± 38 percento ,p=0 .027; più 35±38 percento,p= 0.009; più 14±13 percento,p=0.040;Figura 3C).La capacità dei mitocondri di ossidare la palmitoil-carnitina tende ad aumentare in il gastrocnemio bianco( più 24±12 percento ,p =0.096; Figura 3D), mentre non è stata osservata alcuna differenza nel soleo(p =0.363). I tassi relativi di respirazione stimolata con palmitoil-carnitina sono rimasti invariati quando espressi in funzione della respirazione del complesso I (62±11 nel gruppo di controllo vs.64±20 nel gruppo CF nel gastrocnemio bianco e 70±18 vs.72±16 nel soleo). Successivamente, abbiamo esplorato la sensibilità all'apertura PTP indotta da Ca plus nel gastrocnemio bianco. Come mostrato nella Figura 3E, né il tempo di apertura del PTP né la capacità di ritenzione di Ca² sono stati modificati dopo l'integrazione di CF(p{50}}.608 e p{52}}.943, rispettivamente).

La valutazione dell'mRNA dei geni coinvolti nella biogenesi mitocondriale ha mostrato una sovraregolazione del 70% dell'mRNA di NRF1, mentre non è stata segnalata alcuna differenza per PGCl, Tfam, CS, ND1, ND2, SDHa e Cox2 (Tabella 3). Abbiamo esplorato, su alcuni campioni, l'effetto della supplementazione di CF sui supercomplessi mitocondriali (Figura S1, Materiali supplementari). L'analisi densitometrica suggerisce che la supplementazione di FC ha aumentato il contenuto complessivo di supercomplessi senza adattamenti o riarrangiamenti qualitativi. In effetti, la densità respiratoria è stata migliorata del 58% utilizzando le sonde del complesso I e del complessoⅡ e del 93% utilizzando la sonda del complesso I. Allo stesso modo, il contenuto del complesso I e del complesso III incorporato nei supercomplessi era più alto nel gruppo CF.

L'integrazione di CF riduce l'emissione di ROS mitocondriali. Mentre l'emissione di H2O2 è rimasta invariata sia nel gastrocnemio bianco che nel soleo quando espressa per peso secco (Figura 4A, B, rispettivamente), i tassi sono diminuiti quando espressa per contenuto mitocondriale (Figura 4C). Un principale effetto positivo della supplementazione di FC è stato osservato in varie condizioni nel gastrocnemio bianco (p<0.048; figure="" 4c).="" the="" mitochondrial="" h2o2="" emission="" was="" also="" significantly="" reduced="" when="" expressed="" peroxidative="" phosphorylation="" capacity="" assessed="" by="" state="" 4="" respiration="" using="" complex="" i+ii="" substrates="" by="" 26±13%="" in="" the="" white="" gastrocnemius="" (p="0.044)and" by="" 29±12%="" in="" the="" soleus(p="0.024;" figure="">

3.3. Marcatori di stress ossidativo nel muscolo scheletrico

Il livello di stress ossidativo della proteina cellulare nei topi WT non è stato influenzato dalla supplementazione di CF poiché il contenuto cellulare di SOD2 era simile nei gruppi sperimentali e di controllo nel gastrocnemio e nel soleo bianchi (Figura 4E). Inoltre, non è stata osservata alcuna differenza nella carbonilazione proteica nel gastrocnemio e nel soleo bianchi (Figura 4F). Inoltre, non è stata osservata alcuna differenza nell'espressione di catalasi e mRNA di MnSod dopo l'integrazione di CF (Tabella 3).

3.4 Metabolismo del NAD

Il pool totale di nucleotidi piridinici è aumentato dopo l'integrazione con CF del 36 ± 33 percento (p=0.012). In particolare, il contenuto di NAD e NADH è aumentato nel gastrocnemio bianco (rispettivamente del 69 ± 60 percento, p{{6 }}.026 e 29± 42 percento ,p=0.017;Figura 5A,B)e il rapporto NAD più /NADH tendevano ad aumentare nel gruppo CF (p =0.084).No è stato osservato un effetto significativo per Sirt3 mRNA (p=0.096), NMNAT mRNA (p=0.094) e Sirt1 mRNA(p =0.869; Tabella 3 ).

3.5. Risposta del metabolismo cellulare e dell'intero corpo dopo la supplementazione di FC in Sirt3-/topi

Abbiamo esaminato l'effetto della supplementazione di FC nei topi Sirt{{0}}. La composizione corporea come peso, massa magra e massa grassa non era diversa tra il gruppo FC e il gruppo di controllo (p= 0.52,p=0.66,p{5}}.45,rispettivamente; Figura 6A).Allo stesso modo, il dispendio energetico giornaliero non è stato influenzato dalla supplementazione di FC ({{10}}.38±0.{{40}}1 Kcal.magra corpo massa-1.day-1 nei controlli vs. 0.39 ± 0.01 Kcal·massa corporea-1.day-1 in CF, p=0.502; Figura 6B). La RER era simile tra entrambi i gruppi nei cicli di luce e buio (p=0.301; Figura 6C) e l'ossidazione del substrato non è stata influenzata dall'integrazione di CF (il 44 ± 17 percento del consumo di energia dipendeva dall'ossidazione di CHO nel gruppo di controllo vs. 50 ± 11 percento nel gruppo FC durante la fase chiara, p=0.209 e 65±19 percento nel gruppo di controllo vs. 77±21 percento nel gruppo FC durante la fase oscura, p=0.395; Figura 6D). La flessibilità metabolica valutata dall'ampiezza della RER nelle 24 h è rimasta simile tra i due gruppi (0,19±0,05 nel controllo vs.0,20±0,03 nel CF,p=0.604), mentre la pendenza del PRCF era diminuita nel gruppo CF (Valori H:17,77±4,38 nel controllo vs.12,79±3,93 in CF,p=0.039).

Successivamente, abbiamo confrontato l'effetto della supplementazione di FC sulle attività degli enzimi mitocondriali. La supplementazione di FC non è riuscita ad aumentare l'attività enzimatica del complesso I, I, IV e CS in Sirt3-/topi come osservato in precedenza in WT (rispettivamente: p=0.623,p=0 .629,p=0.283 e p=0.791, Figura 6E). È stata osservata una maggiore attività enzimatica del complesso e IV nei topi WT rispetto ai topi Sirt3-7dopo l'integrazione con CF ( rispettivamente:p=0.027 e P=0.045)

4. Discussione

In questo studio, forniamo un'analisi integrativa dell'effetto dell'ingestione di FC. Abbiamo osservato che l'ingestione cronica di FC migliorava la respirazione mitocondriale e riduceva la produzione di H2O2, valutata nel loro ambiente di miofibre, mentre la suscettibilità all'apertura del PTP era invariata. L'ingestione di FC ha migliorato il metabolismo del NAD, supportando il coinvolgimento delle vie delle sirtuine sugli adattamenti mitocondriali osservati. Abbiamo anche osservato modifiche del metabolismo dell'intero corpo verso una maggiore capacità di utilizzare i carboidrati come substrato principale, suggerendo che gli adattamenti mitocondriali probabilmente hanno contribuito all'adattamento osservato del metabolismo dell'intero corpo.

4.1. Metabolismo

La somministrazione dietetica di flavanoli di cacao è stata identificata come una strategia efficace per alleviare l'intolleranza al glucosio, offrendo opportunità per migliorare le malattie metaboliche [34]. I nostri risultati sono in accordo con studi precedenti che riportavano una maggiore tolleranza al glucosio in seguito all'assunzione di flavanoli [35,36]. I meccanismi proposti per questo effetto comportano un aumento della traslocazione di GLUT4 verso la membrana cellulare, un aumento della fosforilazione di AMPK e l'up-regolazione dell'espressione del gene UCP-2 nel muscolo scheletrico [8,37] . Inoltre, l'ingestione di fibrosi cistica è stata associata al miglioramento della sensibilità all'insulina nell'uomo[8]. Dopo 15 giorni di consumo di cioccolato fondente, in soggetti sani è stata osservata una diminuzione del modello di valutazione dell'omeostasi dell'indice di insulino-resistenza, in concomitanza con un aumento dell'indice di controllo quantitativo della sensibilità all'insulina e dell'indice di sensibilità all'insulina [8]. Abbiamo anche osservato un aumento concomitante della tolleranza al glucosio e della flessibilità metabolica nei topi WT, che si riferisce alla capacità di un organismo di adattare l'ossidazione del carburante alla disponibilità di carburante [38]. È interessante notare che, mentre la ridotta capacità ossidativa mitocondriale e la relativa ossidazione del substrato erano associate all'insulino-resistenza 39, l'allenamento di resistenza ha aumentato il contenuto mitocondriale, la sensibilità all'insulina e la flessibilità metabolica [38]. Pertanto, i presenti risultati sono specifici per la supplementazione di FC e non sono influenzati dall'attività spontanea.

L'effetto positivo della FC sulla flessibilità metabolica, così come l'aumento dell'attività dei complessi mitocondriali, sono stati attenuati nei topi Sirt{0}}, indicando che gli effetti positivi della FC si verificano almeno in parte attraverso Sirt3. Questi risultati supportano i risultati precedenti e il ruolo fondamentale di Sirt3 sulla regolazione della flessibilità metabolica [24]. I nostri risultati suggeriscono che un aumento della funzione mitocondriale può aumentare la flessibilità metabolica. Tuttavia, oltre alla funzione mitocondriale, sono stati identificati come fattori determinanti della flessibilità metabolica anche il quoziente respiratorio basale, il tasso di eliminazione del glucosio, la capacità di immagazzinamento lipidico nel tessuto adiposo e la concentrazione plasmatica di acidi grassi liberi [40]. Studi futuri dovrebbero valutare i determinanti cellulari della flessibilità metabolica in modo più approfondito per approfondire la nostra comprensione delle cause alla base del miglioramento della flessibilità metabolica dopo l'integrazione di FC.

La valutazione del metabolismo dell'intero corpo ha rivelato un aumento dell'ossidazione relativa di CHO dopo l'integrazione di CF. Questo risultato contrasta con uno studio precedente che riportava un aumento della lipolisi a seguito di un'ingestione acuta di flavanoli o di un'integrazione di due settimane con flavan-3-oli nei topi [36]. Oltre alle differenze nella composizione dell'estratto, questi risultati contraddittori possono derivare dagli effetti pleiotropici dell'NO. È ben noto che l'ingestione di FC stimoli la produzione o la biodisponibilità del metabolismo di NO [7]. Da un lato, l'NO stimola il trasporto e l'assorbimento del glucosio nel muscolo scheletrico. La stimolazione della produzione di NO nei miotubi derivati ​​da linee cellulari da parte di insulina o perossido di idrogeno ha comportato un aumento della traslocazione di GLUT4, che è stata ridotta con l'inibizione di nNOS [41]. Inoltre, l'NO può aumentare il trasporto del glucosio in un percorso indipendente dall'insulina portando ad un aumento dei livelli di GMP ciclico e AMPK [42], che promuove l'ossidazione del glucosio nel muscolo scheletrico del ratto indipendentemente dalla disponibilità e dall'ossidazione degli acidi grassi [43]. D'altra parte, NO promuove l'ossidazione degli acidi grassi riducendo il livello di malonil-CoA attraverso l'inibizione dell'acetil-CoA carbossilasi e l'attivazione della malonil-CoA decarbossilasi nel muscolo scheletrico[44]. Mentre abbiamo osservato uno spostamento verso una proporzione relativa più bassa per utilizzare l'acido grasso come substrato con CF, non c'era alcuna differenza per quanto riguarda i valori assoluti espressi in kJ. Ciò suggerisce che l'aumento del dispendio energetico osservato con l'integrazione di CF dipende da un aumento dell'ossidazione del glucosio. Pertanto, questi risultati supportano l'idea che il consumo di FC aumenti la sensibilità all'insulina e promuova l'ossidazione del glucosio senza un effetto concomitante sulla capacità di ossidazione degli acidi grassi. Questi risultati sollevano la questione della rilevanza dell'uso dei flavanoli del cacao nel contesto di una dieta ricca di grassi. Studi futuri dovrebbero valutare un possibile effetto dannoso di un'associazione tra l'integrazione di FC e una dieta ricca di grassi.

4.2.Funzione mitocondriale

È stato dimostrato che la somministrazione dietetica di flavanoli di cacao migliora la funzione mitocondriale, inclusa (i) la respirazione mitocondriale e le attività enzimatiche della catena di trasporto degli elettroni; (i) il rilascio mitocondriale di H2O2, che riflette la produzione di specie reattive dell'ossigeno mitocondriale (ROS); e (i) capacità di ritenzione del calcio mitocondriale che riflette la suscettibilità all'apertura dei pori di transizione della permeabilità mitocondriale (mPTP) (per la revisione vedere [11]. I nostri risultati sono in accordo con studi precedenti; tuttavia, il nostro studio è stato il primo a valutare l'effetto di Supplementazione di FC sulla funzione mitocondriale valutata in situ nella fibra permeabilizzata e in diversi tipi di muscoli A differenza dei precedenti studi sui mitocondri isolati, la valutazione della funzione mitocondriale nella fibra permeabilizzata preserva la morfologia mitocondriale, le interazioni funzionali con altri componenti intracellulari [1] ed evita la struttura mitocondriale interruzione durante il processo di isolamento mitocondriale [32] Pertanto, è importante studiare la funzione mitocondriale nelle preparazioni tissutali in cui la struttura mitocondriale è preservata e tutto il pool mitocondriale è rappresentato per valutare meglio la risposta al trattamento.

Precedenti studi condotti su colture cellulari o in vivo su topi hanno dimostrato che l'integrazione con EPI, che è considerata la principale molecola bioattiva nella FC, aumenta la respirazione massima stimolata dall'ADP (p. es., respirazione di stato 3) quando i mitocondri sono energizzati con una combinazione di energia substrati che alimentano vari siti lungo la catena respiratoria [45-49]. Coerentemente con questi risultati, abbiamo osservato un effetto principale della supplementazione di FC sulla respirazione mitocondriale nei muscoli ossidativi e glicolitici. Per determinare se questo aumento è correlato a un aumento della massa mitocondriale o al rimodellamento dei complessi respiratori mitocondriali, abbiamo valutato i supercomplessi mitocondriali del muscolo quadricipite. Si ritiene che queste strutture supramolecolari riducano la produzione di ROS, stabiliscano o aiutino l'assemblaggio di complessi individuali, regolino l'attività della catena respiratoria e prevengano l'aggregazione proteica nella membrana mitocondriale interna ricca di proteine ​​[50-52]. Nonostante un numero limitato di misure, l'analisi visiva dei risultati (Materiali Supplementari) suggerisce che la supplementazione di FC induce un aumento della massa mitocondriale, come riflesso da un aumento di tutte le specie supercomplesse, piuttosto che riorganizzazioni specifiche del complesso della catena respiratoria. Collettivamente, questi risultati suggeriscono che la FC promuove un aumento della massa mitocondriale senza adattamento qualitativo delle disposizioni complesse della catena respiratoria.

Durante la respirazione mitocondriale si formano quantità variabili di superossido che possono essere metabolizzate per formare altri tipi di ROS [53]. Sebbene l'eccessiva produzione di ROS dai mitocondri sia coinvolta in un ampio spettro di patologie, basse concentrazioni fisiologiche di ROS possono avere effetti benefici, come la protezione dagli agenti infettivi e la partecipazione alla segnalazione cellulare [2,54]. Precedenti studi condotti in vivo su roditori e umani e modelli di colture cellulari hanno riportato effetti benefici dell'integrazione di CF sulla produzione di ROS e vari sistemi antiossidanti [11]. Ad esempio, la sonda gastrica con EPI per 15 giorni aumenta la SOD2 e l'attività della catalasi nei muscoli quadricipiti dei topi [17]. Sebbene la produzione di ROS mitocondriale non sia stata ampiamente valutata, abbiamo osservato che i livelli di produzione di ROS erano simili quando i valori erano espressi per peso muscolare, mentre la produzione era ridotta quando espressa per massa mitocondriale, suggerendo che si verificano adattamenti qualitativi per mantenere le concentrazioni fisiologiche di ROS. Inoltre, non abbiamo osservato alcun effetto di CF su SOD2 né danni indotti da ROS valutati dalla carbonilazione proteica. Sebbene la FC aumenti i pool proteici antiossidanti, inclusi i livelli di SOD2 e catalasi ampiamente riportati [16,17,55], questo adattamento non è sempre stato associato a una diminuzione dei danni indotti da ROS [56-59]. Questi dati supportano la teoria secondo cui bassi livelli di produzione di ROS sono necessari per la normale omeostasi cellulare [2]. Collettivamente, questi risultati suggeriscono che, in concomitanza con un aumento della massa mitocondriale, la FC promuove adattamenti mitocondriali qualitativi per migliorare la sua capacità antiossidante e mantenere bassi livelli di produzione di ROS.

4.3. Biogenesi mitocondriale

La massa mitocondriale è il risultato dell'interazione tra biogenesi mitocondriale e mitofagia. Il nostro studio si è concentrato sulla biogenesi mitocondriale attivata dal consumo di polifenoli [60]. La biogenesi mitocondriale è il processo cellulare che migliora la massa mitocondriale. Questo processo complesso e altamente regolato coinvolge diversi fattori di trascrizione, recettori ormonali nucleari e coattivatori di trascrizione che agiscono collettivamente per coordinare i cambiamenti nell'espressione dei geni codificati nel DNA nucleare e mitocondriale [61]. Precedenti studi hanno tentato di identificare quali vie possono essere alla base della biogenesi mitocondriale indotta dalla supplementazione di FC. La stimolazione della segnalazione NO-dipendente è emersa come una via centrale coinvolta nella biogenesi mitocondriale. L'integrazione di CF migliora la generazione di NO inibendo l'enzima di degradazione dell'arginina, l'arginasi, che aumenta la disponibilità di L-arginina per la biosintesi di NO [62,63]. Inoltre, utilizzando un inibitore di eNOS, l'effetto stimolatore dell'epicatechina sulla biogenesi mitocondriale è stato parzialmente attenuato [17]. Questi risultati suggeriscono il coinvolgimento di altre vie di segnalazione per stimolare la biogenesi mitocondriale.

Recentemente, Aragones et al. (2016) hanno riportato che le proantocianidine alimentari, membri della famiglia dei polifenoli, aumentano il metabolismo epatico di NAD più il potenziamento della via de now o NAD più la biosintesi e l'attività della Sirte in modo dose-dipendente nei ratti[12]. Inoltre, il fegato esporta i precursori del NADt ad altri organi, come il muscolo scheletrico, che hanno una minore capacità di sintetizzare il NAD, aumentando la possibilità di estendere gli effetti osservati nel fegato all'intero organismo [64]. Mentre alcuni studi hanno riportato un effetto della supplementazione di FC sul contenuto proteico, sull'attività o sull'mRNA di Sirt1 [12,15-17,65,66], il coinvolgimento del metabolismo del NAD nella biogenesi mitocondriale in seguito alla supplementazione di FC utilizzando la perdita o il guadagno di la funzione non è mai stata testata. Mentre un knock-out specifico per il muscolo sarebbe stato preferibile rispetto ai topi Sirt3 KO per tutto il corpo utilizzati nel nostro studio, i nostri risultati suggeriscono che la FC migliora il metabolismo del NAD e Sirt3 è coinvolto in questo miglioramento dell'attività della catena di trasporto degli elettroni mitocondriale indotto dall'integrazione. Gli effetti positivi osservati sull'attività dei complessi mitocondriali dopo l'integrazione con CF non sono stati osservati utilizzando topi Sirt3-7 e una maggiore attività delle attività del complesso I e IV è stata osservata dopo l'integrazione con CF solo nel WT. Queste osservazioni estendono i lavori precedenti che dimostrano che Sirt3 gioca un ruolo fondamentale nella funzione mitocondriale ]67. Collettivamente, questi risultati suggeriscono che le sirtuine, attraverso la modulazione del metabolismo del NAD, sono coinvolte nel miglioramento della massa mitocondriale osservato dopo l'integrazione di FC. 4.4.Limiti

Le fave di cacao sono composte da una miscela di flavanoli monomerici, oligomerici e polimerici. Tra i flavanoli, l'EPI sembra essere il monomero polifenolico più abbondante presente nei prodotti a base di cacao, rappresentando fino al 35% del contenuto di polifenoli [68]. L'EPI è stata definita come la principale molecola bioattiva alla base dei benefici associati all'integrazione di cacao e cioccolato [47,69]. Tuttavia, i metaboliti EPI (EPIm) possono essere coinvolti negli effetti biologici indotti da EPI osservati negli studi in vivo. L'EPIm può raggiungere concentrazioni plasmatiche più elevate dell'EPI[70]. Inoltre, sono state osservate importanti differenze nell'EPIm tra le specie. In effetti, l'80% dell'EPIm presente nell'uomo non è stato rilevato nei ratti, mentre la somiglianza tra topi e umani è risultata leggermente più favorevole poiché sono stati rilevati i due principali metaboliti umani [70]. Abbiamo utilizzato l'estratto CF arricchito contenente fino a cinque volte più EPI rispetto alle fave di cacao non fermentate[71]. Inoltre, il contenuto di EPI è stato ridotto del 10-20 percento dalla fermentazione e diminuito in modo dipendente dalla temperatura durante la tostatura [71,72]. Nel complesso, questi dati suggeriscono che l'attenzione dovrebbe essere prestata solo al contenuto di EPI quando si valutano i benefici dell'integrazione di EPI sulla salute umana e i risultati attuali dovrebbero essere considerati con cautela prima di estrapolare i meccanismi sottostanti osservati negli esseri umani.

5. Conclusioni

L'integrazione giornaliera di FC per 15 giorni porta a miglioramenti della funzione mitocondriale nei muscoli ossidativi e glicolitici. I risultati attuali suggeriscono che l'aumento della respirazione mitocondriale si traduce in un aumento della massa mitocondriale mentre il livello cellulare di produzione di ROS è stato mantenuto, suggerendo adattamenti qualitativi all'interno dei mitocondri. In concomitanza con l'effetto cellulare sul metabolismo dell'NO precedentemente descritto [73], la FC modula il metabolismo del NAD, che stimola l'attività delle sirtuine. Sirt3 svolge un ruolo centrale negli adattamenti mitocondriali e nella flessibilità metabolica dopo l'integrazione di FC. Poiché le sirtuine sono bersagli recenti nella patogenesi di varie malattie, come il diabete o l'asma [74,75l, ulteriori studi esploreranno il potenziale interesse dell'uso della FC come attivatore naturale delle sirtuine.

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