Differenziazione, rene, nefrogenesi, progenitori del nefrone,

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ASTRATTO

La dotazione di nefrone, definita durante il periodo fetale, determina la salute renale e cardiovascolare correlata per tutta la vita. Mostriamo qui che, nonostante i suoi effetti negativi sucrescita dei reni, l'aumento genetico del GDNF prolunga il programma nefrogenico oltre la sua normale cessazione. L'analisi meccanicistica multistadio ha rivelato che l'eccesso di GDNF mantiene i progenitori del nefrone e la nefrogenesi attraverso una maggiore espressione dei suoi bersagli secreti e un aumento della segnalazione WNT, portando a un effetto in due parti sul mantenimento del progenitore del nefrone. GDNF anormalmente alto in reni embrionali sovraregolai suoi bersagli noti ma anche Wnt9b e Axin2, con la concomitante decelerazione della proliferazione del progenitore del nefrone. Il calo dei livelli di GDNF nel postnatalei reni si normalizzanola gemma ureterica e crea un ambiente permissivo per la continuazione del programma nefrogenico, come dimostrato dall'autorinnovamento e differenziazione del progenitore del nefrone postnatale morfologicamente e molecolarmente normale. Questi risultati stabiliscono che l'eccesso di GDNF ha un effetto bifasico sui progenitori del nefrone nei topi, che possono rispondere fedelmente alla manipolazione del dosaggio di GDNF durante il periodo fetale e postnatale. I nostri risultati suggeriscono che il rilevamento del livello di attività di segnalazione è un meccanismo importante attraverso il quale il GDNF e altre molecole contribuiscono alla specifica della durata della vita del progenitore del nefrone.

supplemento di cistanche tubulosa vs deserticolapernutrimento dei reni

INTRODUZIONE

Il rene dei mammiferi è un organo filtrante il sangue non rigenerante con funzioni essenziali di disintossicazione e bilanciamento degli elettroliti.

I nefroni che svolgono queste funzioni nascono durante il periodo fetale, in quanto il rene adulto mostra solo una limitata capacità riparativa o un ingrossamento glomerulare compensatorio (ipertrofia) (Chawla e Kimmel, 2012; Rinkevich et al., 2014; Romagnani et al., 2013). La bassa massa congenita del nefrone è un fattore di rischio ampiamente accettato per ipertensione, proteinuria, glomerulosclerosi e malattia renale allo stadio terminale (Bertram et al., 2011; Hoy et al., 2008) e quindi influenza notevolmente la salute renale per tutta la vita. Il programma nefrogenico termina tra le settimane di gestazione 35-37 nell'uomo e il giorno postnatale (P) 3 nel topo (Hartman et al., 2007; Hinchliffe et al., 1991; Ryan et al., 2018), ma i meccanismi che contribuiscono alla cessazione sono poco compresi. È stato ipotizzato che siano coinvolti cambiamenti specifici dello stadio nei modelli di crescita (Cebrián et al., 2004) e nei meccanismi di rilevamento dell'età intrinseco delle cellule (Chen et al., 2015a). Molecolarmente, la segnalazione SMAD indotta dalla proteina morfogenetica ossea (BMP) (Brown et al., 2015), l'hamartin (Tsc1) (Volovelsky et al., 2018) e la regolazione del microRNA (Yermalovich et al., 2019) partecipano alla determinazione del nefrogenico durata del programma. Tuttavia, la plasticità del programma nefrogenico non è stata completamente esplorata. I nefroni si differenziano da un pool di progenitori del nefrone (NP), noto anche come metanephric o cap mesenchima. Le NP che esprimono un repertorio unico di marcatori tra cui SIX2, fattore neurotrofico derivato dalla linea cellulare gliale (GDNF) e CITED1, sono presenti solo nel rene embrionale dove circondano ciascuna punta della gemma ureterale (UB) dalla sua istituzione (Boyle et al., 2008; Sé et al., 2006). Il processo di nefrogenesi è sincronizzato con la ramificazione UB, che contemporaneamente mantiene l'autorinnovamento nella popolazione NP indifferenziata e induce un sottoinsieme di NP a subire una transizione graduale dal mesenchima all'epitelio attraverso stadi precursori ben definiti (aggregati pretubulari, PA; vescicole renali , RV; corpi a forma di virgola, CSB; corpi a forma di S, SSB), che alla fine si differenziano in nefroni funzionali (Kobayashi et al., 2008; Lindström et al., 2018). L'equilibrio tra auto-rinnovamento e differenziazione all'interno della popolazione NP dipende dai segnali che mediano le interazioni reciproche del tessuto induttivo che si verificano tra l'UB e il mesenchima vicino. Il mesenchima metanefrico e i segnali derivati ​​da NP, come il GDNF e i fattori di crescita dei fibroblasti (FGF), regolano la morfogenesi dell'UB, attraverso la quale il rene embrionale cresce di dimensioni, raggiunge la sua forma e stabilisce il sistema dei dotti collettori (Costantini e Kopan, 2010). La segnalazione RET attivata dal GDNF nelle punte UB regola un profilo trascrizionale responsabile del controllo dei progenitori dei dotti collettori e della morfogenesi di UB (Kurtzeborn et al., 2018; Li et al., 2019; Lu et al., 2009; Ola et al. , 2011; Riccio et al., 2016). Le trascrizioni regolate dal GDNF comprendono anche proteine ​​secrete, come WNT11 e CRLF1, con un potenziale dimostrato di regolare il programma nefrogenico (O'Brien et al., 2018; Schmidt-Ott et al., 2005). Altri regolatori della nefrogenesi derivati ​​da UB sono WNT9b e FGF-ligandi che influenzano il mantenimento e la differenziazione delle NP (Barak et al., 2012; Carroll et al., 2005; Kiefer et al., 2012). In precedenza abbiamo riportato che l'interruzione genetica della regione non tradotta di Gdnf 3' provoca un aumento dell'espressione di GDNF endogeno da 3- a 6- e provoca ipoplasia renale dovuta al difetto di ramificazione UB (Kumar et al., 2015). A differenza della letalità neonatale nei knockout Gdnf, i topi Gdnfhyper/iper sopravvivono fino a 3 settimane e hanno rivelato il ruolo essenziale del GDNF nel raccogliere l'autorinnovamento del progenitore del dotto (Costantini, 2012; Kumar et al., 2015; Li et al., 2019). Qui, dimostriamo che l'eccesso di GDNF, nonostante il suo effetto negativo sulla crescita complessiva dei reni, può espandere la durata della vita di NP, rafforzando così ulteriormente la plasticità recentemente riconosciuta dei reni dei mammiferi.

PAROLE CHIAVE:Differenziazione, Rene, Nefrogenesi, Nefroni progenitori, Topo

RISULTATI

Il programma nefrogenico embrionale dipende dal GDNF

La disposizione spaziale di SEI2-NP positive nell'embrione e nel primo periodo postnatalerenisegue uno schema stereotipato e ben descritto, in cui il tessuto multicellulare iniziale si assottiglia nel tempo senza influenzare molto l'organizzazione complessiva della nicchia (Short et al., 2014). Le NP nei reni Gdnfhyper/iper erano distribuite attorno a UB anormalmente ampio come uno strato più sottile (Fig. 1A-F; Fig. S1A, B). La quantificazione delle NP a E11.5 ha rivelato un aumento iniziale, che è stato transitoriamente normalizzato a E12.5 ma gravemente diminuito a E14.5 nei reni Gdnfhyper/iper (Fig. 1E-G; Fig. S1C-F). L'analisi della mitosi ha dimostrato che il GDNF sia aumentato in modo endogeno che integrato in modo esogeno provoca una riduzione significativa del pHH3 più NPC (Fig. 1H; Fig. S1G). Collettivamente, i dati mostrano che l'eccesso di GDNF, che funziona principalmente nell'UB, dove sono espressi i suoi recettori (Pachnis et al., 1993), induce un rapido calo della proliferazione delle cellule NP durante lo sviluppo iniziale del rene.

È noto che la differenziazione prematura o accelerata delle NP può causare il declino delle cellule NP nella loro nicchia (Kobayashi et al., 2008; O'Brien, 2018). Per valutare questo, la nefrogenesi è stata esaminata mediante colorazione con LEF1 e ciclina D1, che etichettano rispettivamente le prime cellule e nefroni impegnati nella differenziazione che subiscono la piena epitelizzazione (Lindström et al., 2015). Ciò ha mostrato un calo generale del numero di precursori del nefrone precoce e ha indicato una ridotta differenziazione del nefrone nel Gdnfhyper/iper embrionalereni(Fig. 2). La valutazione della densità glomerulare ha ulteriormente supportato questo e ha dimostrato densità complessive inferiori nei reni ipodisplastici Gdnfhyper / iper rispetto ai reni di tipo selvaggio (WT) (Fig. S1G). È interessante notare che l'analisi dei glomeruli corticali all'interno dell'area totale misurata, e in particolare i rapporti corticali-glomeruli totali, hanno rivelato rapporti leggermente superiori ai rapporti WT in Gdnfhyper/iper (Tabella 1; 17% in Gdnfhyper/iper, 12% in WT). Ciò indica che, nonostante la precoce decelerazione dell'autorinnovamento e della differenziazione delle NP, i reni che affrontano un eccesso di GDNF durante l'organogenesi hanno una nefrogenesi postnatale in corso con un lieve aumento dei nefroni più nati, che sono localizzati più corticamente (Rumballe et al., 2011; Short et al., 2014).

L'eccesso di GDNF prolunga la durata della vita del pool NP postnataleMolti modelli murini con carenza dicrescita dei reni, a causa della morfogenesi UB e/o della differenziazione del nefrone, muoiono immediatamente dopo la nascita (Kuure e Sariola, 2020). Nonostante l'ipoplasia significativa, le anomalie nella morfologia UB e la nefrogenesi embrionale gravemente interrotta (Fig. 2), i topi Gdnfhyper/iper sopravvivono fino a 3 settimane dopo la nascita (Kumar et al., 2015; Li et al., 2019), fornendo una possibilità per esaminare la nefrogenesi postnatale.

Come è stato stabilito (O'Brien, 2018), la nostra analisi delle popolazioni NP a P1-P10 ha rivelato una drammatica perdita nei reni WT a P3, in cui è stata rilevata principalmente la SIX2-positività nel

differenziando i precursori del nefrone e solo il 10 percento delle punte UB analizzate (nicchie) erano ricoperte da cellule progenitrici del nefrone (NPC) (Fig. 3A, n=2 reni). Tuttavia, SEI2-NP positive sono state rilevate nel 59% delle nicchie Gdnfhyper/iper in P3 (Fig. 3B, n{7}} reni). Allo stesso modo, sono state rilevate NP PAX2-positive in nicchie NP di reni Gdnfhyper/iper in P3, ma le cellule PAX{10}}positive si sono localizzate esclusivamente nei precursori differenzianti del nefrone in WTreni(Fig. 3C,D).

Nefrogenesi in Gdnfhyper/iper postnatalereniha dimostrato un miglioramento significativo rispetto a quello nei reni embrionali, come esemplificato da modelli simili di precursori del nefrone nei reni WT e Gdnfhyper/iper (Fig. 3E-H; confronta con Fig. 2). Infine,

abbiamo scoperto che circa il 18% delle nicchie NP sosteneva SEI2-NPC positivi in ​​P4 e gli NPC impegnati erano presenti in Gdnfhyper/hyperrenifino a P6, mentre gli NPC impegnati sono stati rilevati in WT

renisolo fino a P4 (Fig. 4; Fig. S1H). Ciò dimostra che la durata della vita delle NP in vivo non è prefissata e suggerisce che la modulazione dei livelli del fattore di crescita, in particolare il GDNF, contribuisce alla tempistica dell'onda di differenziazione del nefrone finale.

Abbiamo ipotizzato che gli NPC persistenti nei reni Gdnfhyper/iper postnatali potrebbero derivare da meccanismi compensatori generali provocati da difetti di ramificazione UB che portano all'ipoplasia renale (Kumar et al., 2015; Li et al., 2019) o in alternativa derivare dal GDNF-specifico effetti sulla popolazione NP. Per discriminare tra le opzioni, le NP postnatali sono state analizzate in altri modelli di ipoplasia renale. Fgf9;20-carenterenimostrano un assottigliamento simile degli strati cellulari NP embrionali (Barak et al., 2012) come rilevato in Gdnfhyper/hyperreni, ma non siamo riusciti a rilevare SIX2- e/o PAX2-cellule positive nelle loro nicchie NP postnatali (Fig. S2). Per approfondire ulteriormente questo, abbiamo successivamente analizzato Hoxb7Cre; Mek1fl/fl; Mek2 più /- reni (Ihermann-Hella et al., 2014) in cui, simile ai topi Gdnfhyper/iper, l'ipoplasia renale è causata da una ramificazione UB alterata. Questo modello mancava anche di segni di nefrogenesi prolungata, come rilevato dalla presenza di SIX2- e/o PAX2-cellule positive nelle loro nicchie NP postnatali (Fig. S3), supportando l'opinione che l'ipoplasia renale come tale non è sufficiente per mantenere la nefrogenesi postnatale.

I dati pubblicati dimostrano anche che l'ipoplasia renale da sola non è in grado di supportare il mantenimento postnatale della NP (Kuure e Sariola, 2020), il che suggerisce ulteriormente un ruolo attivo per il GDNF. Tuttavia, non possiamo escludere completamente la possibilità che fattori di crescita in eccesso diversi dal GDNF abbiano lo stesso effetto.

Le NP postnatali sostenute mantengono il programma nefrogenico oltre la sua normale cessazione

Le NP postnatali sostenute mantengono il programma nefrogenico oltre la sua normale cessazione

Successivamente, il potenziale di differenziazione delle NP sostenute nel Gdnfhyper/iper postnatalereniè stato esaminato. L'analisi Ki67 ha rivelato modelli di proliferazione postnatale comparabili nei reni WT e Gdnfhyper / iper fino a P4 (Fig. 5A, B). Da P5 in poi, le cellule Ki67- positive sono diminuite nella zona di differenziazione corticale dei reni WT (Fig. 5C,E,G). Un tale calo della proliferazione corticale non è stato rilevato nei reni Gdnfhyper / iper, che hanno mostrato cellule cicliche attivamente in strutture simili a precursori del nefrone in P7 (Fig. 5D, F,

H) ma non più in P12 (Fig. S4A,B).

L'analisi del differenziamento postnatale del nefrone ha dimostrato una quantità eccessiva di precursori del nefrone in Gdnfhyper/hyperrenifino a P7, mentre questi sono stati rilevati nei reni WT solo fino a P4 (Fig. 6; Fig. S4C-F). Tale nefrogenesi postnatale persistente, tuttavia, non è riuscita ad aumentare la densità glomerulare rispetto a quella negli stadi embrionali tardivi (Fig. S5A-C; 6,4 ± 2,1 contro 10,2 ± 1,2, rispettivamente; media ± sem). La proporzione di glomeruli corticali nei reni Gdnfhyper/iper a P7 (59 percento) è 1,5 volte superiore

Fig. 1. I progenitori del nefrone si esauriscono nell'iper/iper Gdnf embrionalereni. (A,B) Il marcatore del progenitore del nefrone (NP) SIX2 (rosso) si localizza alle punte del germoglio ureterico (UB) capping del mesenchima (calbindina, verde) in WT (A; n{1}} reni) e Gdnfhyper/iper (B; n=5 reni) reni a E11.5. (C,D) Reni E12.5 WT (C) e Gdnfhyper/iper (D) coltivati ​​in vitro per 24 ore e colorati per SIX2 (rosso) per visualizzare la popolazione NP e calbindina (verde) per UB (n{{9} } reni/trattamento, tre esperimenti indipendenti). (E,F) Le NP sono abbondanti nel rene E14,5 WT (E; 42,6/punta), mentre in Gdnfhyper/iper rene le NP sono chiaramente ridotte (F; frecce, 29,8/punta) (n=207 per WT e 431 per Gdnfhyper/iper suggerimenti analizzati in nove reni/genotipo).

Le frecce bianche indicano le cellule NP (rosse).

(G) Analisi di SEI2-quantità NP positive in WT e Gdnfhyper/hyperrenimostra pool NP iniziali comparabili a E12.5. I dati sono presentati come quantità media di SEI2-NP positivi±sem rispetto a quelli dei compagni di cucciolata WT, che sono impostati su 100 percento e riflettono i risultati ottenuti da quattro cucciolate indipendenti (WT: 100±15,61 percento, n{{ 7}}; Gdnfhyper/hyper: 124,74±33,89 percento, n=5; P=0.533, test t a due code in SPSS). (H) La proporzione di NP proliferanti SIX2-positivi nei reni Gdnfhyper/iper a E12.5 mostra una diminuzione significativa rispetto al rene WT. I dati sono presentati come proporzione media di SIX{20}}NP positivi ± sem in proliferazione rispetto a quelli dei compagni di cucciolata WT che sono impostati su 100 percento e riflettono i risultati ottenuti da tre cucciolate indipendenti (WT: 100±9,04 percento, n{{ 25}}; Gdnfhyper/iper: 56,94±12,67 percento, n{30}};

*P=0.024, test t a due code in SPSS). Barre di scala: 100 µm.

che in WTreni(39 percento) (Tabella 1) a sostegno dell'opinione che il pool di NP postnatale sostenuto nei reni Gdnfhyper/iper induce nuovi nefroni dopo la normale cessazione della nefrogenesi.

I topi Gdnfhyper/iper con nefrogenesi prolungata in reni gravemente ipodisplastici non mostrano segni di neoplasia o tumorigenesi durante la loro breve vita (Kumar et al., 2015; Turconi et al., 2020).

I reni Gdnfwt/hyper mostrano un declino embrionale più lieve degli NPC rispetto a Gdnfhyper/hyperreni. Questi topi vivono una vita normale e non mostrano tumorirenese altri organi (Turconi et al., 2020) (Fig. S6A-D, n=62). Il duplice aumento del GDNF durante l'embriogenesi, tuttavia, non riesce a mantenere la popolazione NP nei reni Gdnfwt / iperreni postnatali (Fig. S6E, F), suggerendo una stretta

Fig. 2. Effetto dell'eccesso di GDNF sulla nefrogenesi embrionale. (A) LEF1 (rosso), un marker di aggregati pretubulari, vescicole renali distali e corpi a forma di S, nel rene WT E14.5. (B) E14.5 Il rene Gdnfhyper/iper mostra pochissimi precursori del nefrone differenzianti LEF1- positivi e l'abbondanza tipica dell'epitelio della gemma ureterale (UB) come rilevato dalla colorazione della calbindina (verde).

(C) La ciclina D1 (rossa) colora tutti i precursori dei nefroni differenzianti (gli asterischi contrassegnano gli aggregati pretubulari e i corpi a forma di virgola, le frecce indicano i corpi a forma di S), che possono essere osservati abbondantemente accanto all'epitelio UB (verde) in E14.5 WTrene.

(D) In ​​E14.5 Gdnfhyper/iper vengono rilevati precursori di nefrone significativamente meno differenziatirene. (E, F) Localizzazione della ciclina D1 (rossa) in E16.5 WT (E) e

Reni Gdnfhyper/iper (F). Calbindin (verde)

la colorazione visualizza l'epitelio UB in tutte le immagini. Per ogni colorazione in un dato stadio n=3 reni/genotipo. Barra della scala: 100 µm.

Tabella 1. Quantificazione della densità glomerulare nei reni Gdnfhyper/iper a E18.5 e P7

I dati sono la quantità media di nefrone per mm cubo±sem (n=4 reni/genotipo, una media di otto vetrini analizzati per ciascun rene con intervalli di 125 µm per evitare il conteggio delle iterazioni degli stessi glomeruli). La proporzione di glomeruli corticali nei reni WT a E18,5 è del 12%, mentre nei reni Gdnfhyper/iper è del 17%. A P7, la proporzione di glomeruli nella corteccia è ulteriormente aumentata in Gdnfhyper/hyperreni,suggerendo che i nefroni si stanno ancora differenziando attivamente.

soglia limite per la capacità del GDNF di modulare il programma nefrogenico.

La nefrogenesi postnatale persistente dipende dai cambiamenti nella segnalazione indotta dal GDNF

L'espressione di Gdnf viene persa dai reni WT da P2 (www.gudmap.org), mentre il suo mRNA e la sua proteina sono ancora presenti in Gdnfhyper/hyper

La nefrogenesi postnatale persistente dipende dai cambiamenti nella segnalazione indotta dal GDNF

L'espressione Gdnf viene persa da WTrenida P2 (www.gudmap.org), mentre il suo mRNA e la sua proteina sono ancora presenti in Gdnfhyper/hyper

renifino a P7 (Fig. 7A-D). Il complesso del recettore GDNF conservativo è espresso solo nelle punte epiteliali UB (Costantini, 2012;

Golden et al., 1999). A causa della localizzazione del recettore nel tessuto adiacente alla popolazione di NPC, sospettavamo che gli effetti dell'aumento del GDNF endogeno sulla nefrogenesi dovessero essere mediati

attraverso molecole derivate da UB, secrete, dipendenti dal GDNF (http:/ www.signalpeptide.de/index.php) (Lu et al., 2009; Ola et al., 2011; Schmidt-Ott et al., 2005) (Tabella 2), o altre molecole la cui espressione potrebbe cambiare a causa dell'UB sovradimensionato.

L'analisi dell'espressione degli obiettivi GDNF secreti da UB ha rivelato una significativa sovraregolazione di Crlf1, Srgn e Wnt11 nei reni Gdnfhyper/iper a E14.5 (Fig. 7E). Inoltre, l'espressione di Wnt9b è significativamente aumentata (Fig. 7E). Un'ulteriore analisi dei bersagli di segnalazione WNT/ - catenina (Clevers e Nusse, 2012) nel controllo E14.5 e nei reni Gdnfhyper/iper hanno dimostrato una sovraregolazione significativa del target canonico Axin2 (P=0.003371), mentre WNT espresso da NP target (Karner et al., 2011) hanno mostrato una tendenza alla downregulation, che probabilmente riflette il numero complessivo ridotto di NPC (Fig. S7A). Insieme, questi indicano che non solo l'aumento della segnalazione indotta da GDNF, ma anche l'aumento della segnalazione indotta da Wnt9- e Wnt11-con funzioni note nella regolazione NPC partecipano alla mediazione della comunicazione reciproca dall'UB mutante al pool NP adiacente a E14.5 (Karner et al., 2011; Kiefer et al., 2012; Nagy et al., 2016; O'Brien et al., 2018).

Fig. 3. Differenziazione del nefrone alla cessazione della morfogenesi renale. (A) Il rene P3 WT ha perso i progenitori corticali del nefrone SIX2-positivo (NP) come mostrato dalla perdita di cellule nel mesenchima del cappuccio (freccia). Invece, SIX2 si localizza nel mesenchima laterale e nei primi precursori del nefrone (punte di freccia).

La quantificazione di 48 nicchie NP (numeri di punta analizzati) ha rivelato solo cinque nicchie con NP. (B) Cap mesenchima positivo per SIX2 è ancora presente nel rene Gdnfhyper/iper in P3 (frecce). La quantificazione di 107 nicchie NP (numeri di punta analizzati) ha rivelato 63 nicchie con cellule NP. Colorazione (C,D) PAX2 (rosso) e calbindina (verde) in WT (C) e Gdnfhyper/iper

(D) reni in P3. Le frecce indicano la posizione in cui le celle NP vengono mantenute in Gdnfhyper/hyperreni.

(E,F) Quantità comparabile di precursori del nefrone (rossi) positivi alla ciclina D1- in P3 WT (E) e Gdnfhyper/iper

(F) reni. (G,H) La visualizzazione dei precursori del nefrone LEF1-positivi (rosso) e dell'epitelio ureterico (verde) rivela una nefrogenesi in corso simile nel WT

reni (G) e Gdnfhyper/iper (H). Per ogni colorazione

n{0}} reni/genotipo. Barre di scala: 100 µm.

Caratterizzazione molecolare di P5 Gdnfhyper/iperreniha mostrato una sovraregolazione persistente di Crlf1, Etv4, Etv5, Cited1 e Uncx4.1 (noto anche come Uncx), ma ha anche rivelato una maggiore espressione del potenziale fattore di nicchia Lama1 (Rayagiri et al., 2018), induttore di differenziazione del nefrone Wnt4 (Stark et al. , 1994) e l'agonista di segnalazione WNT R-spondin 1 (Rspo1) (Fig. 7F; Fig. S7B). Un tale profilo trascrizionale suggerisce un effetto derivato da UB aumentato sulle NP, che sembrano subire un'onda di differenziazione basata sulla ridotta espressione di Fgf9 e Fgf20 e sulla localizzazione spostata delle cellule SIX2 plus (Figure 4C, D e 7F). Abbiamo testato funzionalmente se le espressioni Crfl1, Wnt11 e Wnt9b più significativamente aumentate influiscono sul programma nefrogenico nel topo. CRLF1, in complesso con il suo ligando fisiologico citochina simile alla cardiotropina, induce la differenziazione nelle colture di mesenchima renale di ratto isolato (Schmidt-Ott et al., 2005). La caratterizzazione dei reni knockout Crfl1- ha rivelato dimensioni renali e nefrogenesi comparabili con i reni WT (Fig. S6C-F), suggerendo funzioni CRLF1 superflue in vivo. Successivamente è stato testato il contributo dell'aumento della segnalazione WNT canonica ai fenotipi causati dall'eccesso di GDNF. IWR1 inibisce le tankirasi 1 e 2, necessarie per il normale sviluppo renale (Chen et al., 2009; Huang et al., 2009; Karner et al., 2010). Il trattamento IWR1 ha alleviato il numero e la morfologia delle punte UB in presenza di GDNF in eccesso (Fig. S8). Infine, abbiamo chiesto se un aumento significativo dell'espressione di Wnt11 nei reni Gdnfhyper/iper contribuisca al programma nefrogenico prolungato nei topi Gdnfhyper/iper incrociando l'allele knockout Wnt11 con lo sfondo Gdnfhyper. Questo non è riuscito a generare il doppio omozigote

Fig. 4. I progenitori del nefrone sono persistentemente sostenuti nei reni Gdnfhyper/iper postnatali. (A, B) La localizzazione del marcatore progenitore del nefrone (NP) SIX2 (rosso) in WT a P4 (A) e P6 (B) mostra la perdita di NP nei reni WT in cui SIX2 si trova solo in vescicole renali debolmente positive (asterischi) . (C) In Gdnfhyper/iper reni a P4 SIX2 si localizza anche in NP che ricoprono le punte (frecce) del germoglio ureterico (verdi) (n=315 punte in WT e 245 in Gdnfhyper/iper analizzato in quattro reni/genotipo). (D) La localizzazione di SIX2 (rosso) e calbindina (verde) in P6 Gdnfhyper/iper reni rivela la persistenza di cellule NP impegnate (13; * indica nefroni differenzianti) nel rene mutante (n=3 reni/genotipo) . La quantificazione delle nicchie di cellule NP ha mostrato pochissimi suggerimenti, che non avevano SEI2-NP positivi nei reni WT, mentre l'81% delle nicchie nei reni Gdnfhyper/iper (n=2, 16 nicchie) era accompagnato con SEI2-positività in precursori di nefroni impegnati e differenziati. Barra della scala: 100 µm.

Gdnfhyper/hyper;Wnt11−/− prole (Tabella 3; n=95; P=0.005 Gdnfwt//hyper;Wnt11 più /− allevamento). Questi risultati indicano letalità embrionale per Gdnfhyper/hyper; Wnt11-/- mutanti e ci hanno costretto a concentrare l'analisi su Gdnfhyper/hyper; Wnt11 più /- reni. La rimozione di un allele Wnt11 in Gdnfhyper/iper background ha leggermente migliorato la morfologia UB e ha ridotto ulteriormente la dimensione del rene rispetto a quella dei reni Gdnfhyper/iper, probabilmente riflettendo una ridotta formazione di cisti del dotto collettore alla diminuzione del dosaggio di Wnt11 (Fig. S9A-C). Tuttavia, la popolazione NP2-positiva è stata aumentata (29,8 NPC/punta contro 40,7 NPC/punta a E14,5 e 20,3 NPC/punta contro 30,9 a P0) e la nefrogenesi è stata migliorata nella zona di differenziazione corticale di Gdnfhyper/iper ;Wnt1 più /− reni (Fig. 8; Fig. S9D-F; confrontare anche con Fig. 1F). Pertanto, questi risultati suggeriscono che l'aumento dei livelli di GDNF aumenta diversi bersagli GDNF / Ret derivati ​​​​dal germoglio, che, non da soli ma in combinazione tra loro e insieme all'aumento del segnale WNT canonico, stanno regolando gli NPC nei reni embrionali.

DISCUSSIONE La conta dei nefroni è definita durante la vita fetale e può variare notevolmente da individuo a individuo. L'espansione e la durata della vita delle NP influenzano notevolmente la dotazione finale del nefrone, e quindi l'identificazione dei meccanismi regolatori che controllano l'autorinnovamento delle NP è importante. Qui, mostriamo che il fattore neurotropico GDNF, noto per avviare lo sviluppo renale e regolare la morfogenesi UB (Costantini, 2010; Kurtzeborn et al., 2018; Li et al., 2019), è, nonostante i suoi effetti negativi sulla crescita renale, in grado di di prolungare il programma nefrogenico oltre la sua normale cessazione. I nostri risultati dimostrano che l'eccesso di GDNF ha un effetto bifasico sull'autorinnovamento e sul mantenimento di NP. Sulla base della nostra analisi, proponiamo un modello di come funziona il GDNF in eccesso nei reni Gdnfhyper/iper

attraverso meccanismi che coinvolgono cambiamenti nella progressione del ciclo cellulare e nella capacità di percepire i livelli dei fattori di crescita. Inizialmente nei reni embrionali, livelli elevati di GDNF causano un rapido calo del numero di NP per nicchia, che è tipico per molti modelli murini con carenza primaria di UB (Carroll e Das, 2013; Chen et al., 2015b; Costantini e Kopan, 2010; Liu et al., 2018). Il declino prematuro di NP osservato in questi modelli precedentemente pubblicati è in genere causato dalla loro differenziazione prematura, il che non è il caso dei reni Gdnfhyper/iper. Invece, l'eccesso di GDNF è in grado di mantenere il ciclo cellulare attivo nella corteccia renale postnatale significativamente più a lungo di quanto si osserva nei reni WT. La proliferazione si verifica nelle cellule NP, che vengono mantenute più a lungo rispetto ai reni WT e continuano a produrre nuovi nefroni. In futuro, sarà interessante vedere se sarà possibile somministrare un eccesso di GDNF in modo favorevole per la continua nefrogenesi postnatale senza influenzare gravemente la morfogenesi dell'UB per distorcere la crescita complessiva dell'organo. I nostri dati dimostrano che il declino precoce delle NP embrionali dei reni Gdnfhyper/iper è dovuto alla diminuzione della proliferazione cellulare piuttosto che all'aumento della differenziazione prematura. Questo meccanismo cellulare è supportato da cambiamenti molecolari rilevati in noti bersagli GDNF (Crlf1, Wnt11 e Srgn) (Lu et al., 2009; Ola et al., 2011) e in importanti regolatori della segnalazione di mantenimento delle cellule NP (Wnt9b, Wnt11 e loro target trascrizionali) (Karner et al., 2011; Kiefer et al., 2012; O'Brien et al., 2018). Precedente esame della longevità e della resilienza delle cellule NP mediante l'ablazione della popolazione NP con la tossina difterica A, o disturbando l'attivazione di MAPK/ERK, che hanno entrambi provocato un rapido declino delle cellule NP senza un effetto positivo sulla loro durata (Cebrián et al., 2014 ; Ihermann-Hella et al., 2018), insieme ai nostri risultati suggeriscono che la proliferazione delle cellule NP gioca intrinsecamente un ruolo importante nella definizione della loro vita totale. D'accordo, le cellule NP nei reni embrionali tardivi mostrano tassi di proliferazione significativamente ridotti e differenziazione accelerata, mentre il trapianto di vecchie cellule NP nei reni allo stadio iniziale prolunga la loro durata (Chen et al., 2015a). Sulla base dei nostri risultati, proponiamo che il GDNF contribuisca al meccanismo attraverso il quale le cellule NP percepiscono la loro età di sviluppo e, in definitiva, la loro durata di vita. In un rene normale, l'espressione di GDNF è elevata all'inizio della morfogenesi renale e durante la fase di crescita attiva, mentre un netto calo dei livelli di GDNF si verifica nei reni embrionali tardivi, con conseguente perdita di espressione nella fase postnatale precoce (Figg. 7 e 9). . I livelli di GDNF nei primi reni Gdnfhyper/iper sono anormalmente alti, il che sembra essere inibitorio della proliferazione delle cellule NP, probabilmente a causa dei cambiamenti cellulari e molecolari rilevati all'interno dell'UB mutante come un percorso WNT alterato

(Fig. 7E, F; Fig. S7A, B), che ha effetti noti sulla biologia degli NPC (Karner et al., 2011; Kiefer et al., 2012; Nagy et al., 2016; O'Brien et al., 2018). Simile ai reni WT, i livelli di proteina Gdnf mRNA e GDNF diminuiscono nei reni Gdnfhyper/iper postnatali in cui Gdnf viene manipolato a livello post-trascrizionale consentendo la regolazione temporale endogena dell'espressione (Kumar et al., 2015). Probabilmente, questo diminuisce l'espressione del GDNF al livello che è permissivo per l'autorinnovamento e la differenziazione delle cellule NP, che vengono rilevati come un programma nefrogenico sostenuto nei reni postnatali (Fig. 9). Una tale plasticità dipendente dal fattore di crescita recentemente riconosciuta nella differenziazione renale fa sperare in un suo utilizzo a scopi rigenerativi in ​​futuro. I primi indizi per la possibilità di allungare il periodo di differenziazione del nefrone provenivano da esperimenti che inibivano BMP/

Fig. 5. Proliferazione corticale sostenuta nei reni Gdnfhyper/iper postnatali. (A, B) La colorazione Ki67 nei reni P4 WT (A) e Gdnfhyper/iper (B) mostra un modello simile di cellule proliferative nei reni corticali (frecce rosse) di entrambi i genotipi. (C, D) Nei reni P5 WT (C) la positività al Ki67- è significativamente ridotta nella corteccia (freccia rossa), mentre i reni Gdnfhyper/iper (D) mostrano ancora una proliferazione focale molto alta (frecce rosse). (E, F) La proliferazione nel rene corticale WT (E) è ulteriormente ridotta a P6, mentre rimane altamente attiva nei reni Gdnfhyper/iper (F). (G, H) Le cellule proliferative Ki67- positive si localizzano nei tubuli renali midollari (freccia nera) nei reni P7 WT (G) ma la proliferazione attiva è ancora rilevata nelle strutture corticali differenzianti del nefrone (frecce rosse) dei reni Gdnfhyper/iper (H). Per ogni stadio postnatale, n=3 reni/genotipo. Barra della scala: 1 mm.

P7 solo nei reni Gdnfhyper/iper. (A, B) Il marcatore precursore del nefrone LEF1 (rosso) nei reni WT (A) e Gdnfhyper/iper (B) in P4 dimostra una nefrogenesi in corso in entrambi i genotipi (frecce) (n=2 reni/genotipo). (C,D) I reni P5 WT (C) mostrano pochissime cellule LEF1-positive nella corteccia, mentre un'ampia nefrogenesi viene rilevata nei reni Gdnfhyper/iper (D; frecce; n=4 reni/genotipo) . (E, F) LEF1 non è più presente nella corteccia dei reni WT in P6 (E), mentre abbondanti precursori del nefrone sono ancora rilevati nei reni Gdnfhyper/iper (F) (n=3 reni/genotipo). (G) Cyclin D1 (bianco) e JAG1 (rosso) si localizzano in tubuli distali differenziati del nefrone (freccia gialla e punta di freccia) nel rene P7 WT (n{13}} reni). (H) In P7 Gdnfhyper/iper reni la ciclina D1 e JAG1 si localizzano in corpi a forma di virgola (punta di freccia) e a forma di S (freccia) di precursori del nefrone nella zona di differenziazione corticale, mostrando così una nefrogenesi sostenuta in questo stadio postnatale tardivo (n{ {19}} reni). Barre di scala: 100 µm.

Segnalazione SMAD1/5, che ha portato a reni leggermente più grandi con più nefroni rispetto ai reni trattati con veicolo (Brown et al., 2015). Il dosaggio ridotto di Tsc1, che codifica per un inibitore di mTOR, mantiene le cellule NP per un giorno aggiuntivo, senza effetti riportati sul numero di cellule NP embrionali (Volovelsky et al., 2018). Nefrogenesi prolungata è stata osservata anche nei topi con sovraespressione di Lin28, Lin28b o Let-7 inattivato (Let-7a1; Let-7d; Let-7f1) (Urbach et al ., 2014; Yermalovich et al., 2019), che mostrano anche tumorigenesi diretta o attivazione dei loci Igf2 o H19h associati al tumore del rene pediatrico Il tumore di Wilms (Chen et al., 2018; Ogawa et al., 1993). Come nota, non sono stati rilevati cambiamenti nella localizzazione o nei livelli di pSMAD1/5 nei reni Gdnfhyper/iper, che sono ipodisplastici e compatibili con la vita per tre settimane.

Il presente studio si concentra sulla caratterizzazione della funzione del GDNF nella nefrogenesi, che è stata precedentemente esaminata diminuendo il dosaggio di Gdnf endogeno e si traduce in una ridotta dotazione di nefrone (Cullen-McEwen et al., 2001, 2003). Il complesso recettore canonico per GDNF è formato dalla tirosina chinasi RET e dal suo corecettore GFRa1, che sono esclusivamente co-espressi solo nell'epitelio UB (Costantini, 2012; Golden et al., 1999; Pachnis et al., 1993) . Il GDNF è un fattore di nicchia chiave per le cellule della punta UB (Chi et al., 2009; Riccio et al., 2016; Shakya et al., 2005). Abbiamo precedentemente dimostrato che l'eccesso di GDNF espande il pool di progenitori del dotto di raccolta a scapito dell'allungamento del tronco ureterico, con conseguente fenotipo della punta espansa e del tronco corto a causa di difetti nella motilità del progenitore e lunghezza del ciclo cellulare ridotta (Li et al., 2019). Durante le fasi embrionali l'effetto combinato di anormalmente

Fig. 7. Analisi dell'espressione dei regolatori cruciali dello sviluppo renale. (A) Il test di ibridazione in situ di Gdnf a P4 non è in grado di rilevare alcuna trascrizione nel rene WT (n=3 reni). (B) L'espressione di Gdnf è mantenuta nel rene P4 Gdnfhyper/iper e si localizza nella zona di differenziazione corticale in cui vengono mantenuti i progenitori del nefrone (frecce rosse) a causa dell'eccesso di GDNF (n{4}} reni). (C) analisi qRT-PCR delle trascrizioni Gdnf in reni Gdnfwt/ko, WT, Gdnfwt/iper e Gdnfhyper/iper a P7 (n{7}} reni/genotipo). L'espressione di Gdnf nei reni Gdnfhyper/iper è significativamente più alta rispetto a WT (P=0.036) e Gdnfwt/ko (P=0.038) (test t medio±sem, a due code in SPSS ). (D) Analisi ELISA dei livelli di proteina GDNF nei reni P7 (n=5 reni/genotipo) (media±sem). (E, F) quantificazione basata su qRT-PCR dei livelli di espressione relativa dei geni selezionati a E14 (E) e P5 (F) (n=3 reni/genotipo in un determinato stadio). I target GDNF secreti da UB sono elencati sopra la linea tratteggiata, mentre altri noti regolatori della nefrogenesi sono presentati sotto la linea. Gdnfhyper/iperreni mostrano una sovraregolazione significativa di Crlf1 (*P=0.019), Srgn (*P=0.021), Wnt11 (**P=0.001) e Wnt9b ( **P=0.01) a E14, mentre a P5, le espressioni geniche aumentate in modo significativo includono Crlf1 (**P=0.009), Etv4 (**P=0.{{ 39}}), Etv5 (*P=0.03), Lama1 (*P=0.014) e Wnt4 (*P=0.026). Al contrario, la trascrizione di Sostdc1 (**P=0.000), Fgf9 (**P=0.001) e Fgf20 (**P=0.001 ) è significativamente diminuito nei reni Gdnfhyper/iper a P5. Barra della scala: 100 µm.

alto GDNF, cambiamenti biofisici indotti dalla morfologia della punta UB anomala e alterazioni molecolari associate nei bersagli GDNF e il percorso WNT sembrano spingere congiuntamente le cellule NP verso una ridotta proliferazione. Mostriamo qui che la morfologia della punta UB espansa migliora nel tempo ma persiste in forme lievi fino a P4 nei reni Gdnfhyper/iper postnatali (Fig. 5). Le cellule della punta UB sono molecolarmente ancora presenti nei reni P5 Gdnfhyper/iper, che esprimono livelli elevati di marcatori di punta regolati dal GDNF Crlf1, Etv4, Etv5 e Lama1, target WNT canonici espressi da NPC Cited1 e Uncx4.1, nonché agonista WNT R -spondin1 (Fig. 7E, F; Fig. S7A, B) (Karner et al., 2011; Lu et al., 2009; Vidal et al., 2020). Tali cambiamenti molecolari nell'UB postnatale probabilmente forniscono quindi un ambiente favorevole per l'autorinnovamento sostenuto delle NP oltre P2/P3. Abbiamo identificato CRLF1 e WNT11 secreti da UB come bersagli GDNF che, insieme al WNT canonico aumentato

la segnalazione, ulteriormente potenziata dall'aumentata espressione di Wnt9b, media i suoi effetti sulla regolazione NP. I nostri dati indicano anche che la funzione di CRLF1 è ridondante con altre citochine poiché la sua inattivazione non influisce sulla differenziazione renale. Sia WNT9b che WNT11 regolano molti aspetti degli NPC e della nefrogenesi (Carroll et al., 2005; Karner et al., 2011; Majumdar et al., 2003; Nagy et al., 2016; O'Brien et al., 2018). L'upregulation di Wnt9b espresso da UB, che è noto per regolare molti aspetti della nefrogenesi, nei reni Gdnfhyper/iper può imitare la sua espressione forzata nelle NP, il che interrompe il loro equilibrio di mantenimento rispetto alla differenziazione (Kiefer et al., 2012) e quindi contribuisce meccanicamente all'auto-rinnovamento squilibrato di NP nella nefrogenesi iper/ iper nefrogenesi. Ciò è supportato da una migliore morfologia della punta sull'inibizione canonica del WNT da parte di IWR1 in reni interi che affrontano un eccesso di GDNF.

Tabella 2. Geni bersaglio GDNF secreti con potenziale di influenzare il programma nefrogenico

I nostri risultati mostrano che l'inibizione di IWR1 stessa ha un effetto importante sugli NPC, che sono dispersi e aderiscono vagamente alle punte UB. L'inibizione canonica del WNT negli stessi NPC contribuisce probabilmente all'incapacità di aumentare il loro fenotipo in presenza di GDNF in eccesso. Ciò è supportato dai nostri esperimenti genetici in cui l'abbassamento dell'espressione Wnt11 espressa da UB nello sfondo Gdnfhyper/iper ha migliorato il mantenimento e la differenziazione delle NP, ma non è riuscito a salvare completamente l'ipoplasia renale causata dall'eccesso di GDNF. Ciò potrebbe essere almeno in parte dovuto alla mancata inattivazione di entrambi gli alleli Wnt11 nello sfondo Gdnfhyper/iper a causa della letalità embrionale di Wnt11-/- (Nagy et al., 2016). Pertanto, un restante allele Wnt11 può persino aumentare la cascata del GDNF come suggerito in precedenza (Majumdar et al., 2003) e quindi in parte vietare il pieno salvataggio della nefrogenesi. Il nostro attuale studio non può escludere la possibilità che alcuni effetti del GDNF sulle NP siano dovuti alla segnalazione non canonica del GDNF, poiché i suoi potenziali recettori di segnalazione alternativi sono espressi dalle NP (Brodbeck et al., 2004; Enomoto et al., 2004; Keefe Davis et al., 2013; Paratcha et al., 2003). Tuttavia, sia la delezione di NCAM che l'espressione di Gfra1 solo in UB (ponendola sotto il controllo del promotore Ret) mantengono il fenotipo renale normale (Cremer et al., 1994; Heuckeroth et al., 1999; Keefe Davis et al., 2013; Rossi et al., 1999; Sariola e Saarma, 2003). Ciò suggerisce che, almeno da soli, né NCAM né GFRa1, sono essenziali per il programma nefrogenico. In sintesi, i nostri esperimenti suggeriscono che il GDNF, che è stato, ed è attualmente, in studi clinici per il morbo di Parkinson (Kirkeby e Barker, 2019), potrebbe avere il potenziale per servire come mezzo potenziale per migliorare la dotazione di nefroni in futuro. Sono necessarie ulteriori sperimentazioni per identificare possibili mezzi per attivare eccessivamente la segnalazione del GDNF senza effetti dannosi sulla crescita renale

MATERIALI E METODI

Animali

I protocolli di cura e ricerca degli animali sono stati eseguiti in conformità con il Codice di condotta etica per la sperimentazione animale e le direttive dell'Unione europea (Direttiva 2010/UE/63) e sono stati approvati dal National Animal Experiment Board of Finland. I topi sono stati alloggiati in gabbie ventilate individualmente con cibo e acqua ad libitum. L'umidificazione e il riscaldamento ottimali sono stati forniti costantemente presso il Centro per animali da laboratorio certificato dell'Università di Helsinki. La generazione e la genotipizzazione dei modelli murini Gdnfhyper (Kumar et al., 2015) e Fgf9;20 (Barak et al., 2012) sono state descritte in precedenza. I cuccioli Gdnfhyper;Wnt11− provengono da incroci di C57BL6 Wnt11−

Tabella 3. Riepilogo dei genotipi della prole da Gdnfwt//hyper; Wnt11 plus /− intercrosses

(Nagy et al., 2016) e Gdnfhyper, e sono stati genotipizzati come descritto in precedenza (Kumar et al., 2015; Nagy et al., 2016 ). Tutte le linee di topo utilizzate negli studi sono state mantenute su uno sfondo triplo misto 129Ola/ICR/C57bl6. La generazione di topi knockout Crlf è stata descritta in precedenza (Alexander et al., 1999). La genotipizzazione PCR è stata eseguita utilizzando un set di primer neo-specifico (5′-AGAGGCTATTCGGCTATGACTG-3′ e 5′-CCTGATCGACAAGACCGGCTTC-3′) insieme a set di primer gene-specifici per Crlf1 (5′-GCCTAATAGGTGCTGGGTGA{{ 18}}′ e 5′-GACCCTATCTGCGTTTTCCA-3′). Raccolta dei tessuti Gli embrioni sono stati stadiati secondo i criteri di Theiler (1989) come descritto in precedenza (Kuure et al., 2005) e raccolti dopo la dislocazione cervicale di femmine gravide in anestesia profonda con CO2. I cuccioli embrionali e postnatali tardivi sono stati sacrificati tramite decapitazione. Il tessuto è stato sezionato nel mezzo di Dulbecco integrato con lo 0,2% di albumina di siero bovino (BSA) seguito da fissazione con paraformaldeide al 4% (PFA) o coltura d'organo. Coltura d'organo Reni isolati da embrioni di topo E11.5 ed E12.5 sono stati posti all'interfaccia aria-liquido supportata dal sistema di membrane in poliestere Transwell® (Costar) e coltivati ​​a 37 gradi in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2 con terreno di coltura renale [F12 :DMEM (1:1) più Glutamax (Gibco)] integrato con il 10% di siero bovino fetale e penicillina-streptomicina (Ihermann-Hella e Kuure, 2019). Per la coltura in vitro con 100 ng/ml di GDNF esogeno (ProSpec Ltd) (Sainio et al., 1997) finalizzata alla quantificazione di NPC, ogni blocco urogenitale contenente metanefro, il rudimento renale definitivo, è stato dimezzato lungo la linea mediana ventralis. Metà di ciascun campione è stata coltivata con GDNF esogeno mentre l'altra metà fungeva da controllo. Gli esperimenti di inibizione del WNT sono stati testati per la prima volta con 50-100 ng/ml GDNF e 50-100 µM IWR1 (I0131-25, Sigma-Aldrich). Sulla base di questi esperimenti di dipendenza dalla dose, le concentrazioni ottimali erano 50 ng/ml GDNF e 75 µM IWR1. Istologia e immunocolorazione Per gli studi che studiano il marker di interesse sulle sezioni di paraffina, i reni sono stati sezionati dagli embrioni o dai cuccioli degli stadi indicati, seguiti dall'elaborazione e dal sezionamento dei tessuti come descritto in precedenza (Li et al., 2019). In ciascuna analisi sono state utilizzate almeno cinque sezioni di ciascun rene e da tre a cinque diversi reni per genotipo. I numeri esatti del campione sono forniti nelle legende delle figure. L'ematossilina e l'eosina (H&E) e l'immunoistochimica eseguita su sezioni di paraffina sono state completate come descritto in precedenza (Li et al., 2019). In breve, il tessuto sezionato è stato fissato durante la notte con PFA al 4% (pH 7,4), seguito da disidratazione e paraffinazione con un elaboratore di tessuti automatico (Leica ASP 200). Sezioni di 5 µm di spessore sono state preparate e decerate in xilene seguita da reidratazione prima di essere colorate con Harris H&E o sottoposte al recupero dell'antigene indotto dal calore nel tampone di recupero dell'antigene (10 mM citrato; pH 6,0). Per l'immunocolorazione, è stato utilizzato il 3% di BSA per il blocco (1 ora a temperatura ambiente) seguito da 30 minuti di trattamento con perossido di idrogeno allo 0,5% per la colorazione cromogenica. Le sezioni sono state quindi incubate con anticorpi primari durante la notte a più 4 gradi, seguite da incubazione di anticorpi secondari specie-specifici per 2 ore a temperatura ambiente. Il rilevamento cromogeno è stato implementato con il kit EnVision Detection System-HRP (DAB) (Dako).

Fig. 8. La diminuzione genetica del livello di Wnt11 salva parzialmente la perdita del progenitore del nefrone nei reni Gdnfhyper/iper. (A) SEI2-progenitori nefronici positivi (NP, rosso) sono scarsi nei reni Gdnfhyper/iper E14,5 (media di 29,8 NP/punta in 552 punte analizzate in nove reni). (B) Gdnfhyper/iper; i reni Wnt11 più /- mostrano un aumento dell'abbondanza generale di NP per nicchia in assenza di un allele Wnt11 (media di 40.7 NP/punta in 107 punte analizzate in quattro reni ). (C,D) PAX2-cellule positive in Gdnfhyper/hyper (C) e Gdnfhyper/hyper; i reni Wnt11 più /- (D) mostrano schemi e quantità simili a E14.5. (EH) A P0, la colorazione SIX2 dimostra un miglioramento dei numeri di NP mediante la rimozione di un allele Wnt11 (media di 20,3 NP/punta in 610 punte Gdnfhyper/iper contro una media di 30,9 NP/punta in Gdnfhyper/iper; Wnt11 plus /- punte analizzate in sei reni/genotipo), che è supportato dalla colorazione PAX2. La distribuzione di SEI2-NP positive (A′,B′,E′,F′) e cellule PAX2- positive (C′,D′,G′,H′) sono mostrate senza calbindina ( verde), che raffigura l'epitelio UB in tutti i reni. Barre di scala: 200 µm.

I reni E11.5 ed E12.5 sottoposti a colorazione con immunofluorescenza a montaggio intero sono stati fissati e permeabilizzati con 100 percento di metanolo ghiacciato per 10 minuti prima dell'incubazione notturna con anticorpi primari. L'incubazione con i corrispondenti anticorpi secondari specie-specifici è stata implementata il secondo giorno dopo un lavaggio vigoroso con PBST (0,1% Tween 20 in PBS). I dettagli sugli anticorpi primari e secondari utilizzati nel presente studio sono elencati nella Tabella S1. Ibridazione in situ L'ibridazione in situ è ​​stata condotta come descritto in precedenza (Ihermann Hella et al., 2014). In breve, una sonda RNA antisenso contro gli esoni Gdnf è stata trascritta e ibridata su sezioni spesse derivate da reni P4 (10-15 sezioni/rene, n=3 reni/genotipo) incorporate in agarosio a basso punto di fusione del 4%. (NuSieve GTG, Lonza). BM Purple è stato utilizzato per la reazione colorimetrica

I livelli di proteina ELISA GDNF nei reni P7.5 sono stati misurati tramite ELISA come riportato in precedenza (Kumar et al., 2015). GDNF Emax® Immunoassay (Promega) è stato utilizzato con trattamento acido durante l'esecuzione del test ELISA. In dettaglio, per ogni genotipo, tre reni sono stati lisati subito dopo essere stati sezionati. Dopo aver misurato la concentrazione proteica con DC protein Assay (Bio-Rad), 25 µg di proteine ​​totali sono stati caricati nel pozzetto sulla piastra ELISA. Ogni campione è stato analizzato in duplicato.

Imaging L'immunocolorazione e l'ibridazione in situ sulle sezioni sono state riprese utilizzando uno Zeiss AxioImager dotato di sorgente luminosa a fluorescenza HXP 120V, un Hamamatsu Orca Flash 4.0 LT B/N e Zeiss AxioCam 105 a colori o con un Leica DM5000B dotato di sorgente luminosa ad alogenuri metallici Leica EL 6000 e fotocamera Hamamatsu Orca-Flash4.0 V2 sCMOS. La colorazione dell'immunofluorescenza a montaggio intero è stata ripresa utilizzando uno Zeiss AxioImager con l'applicazione Zeiss ApoTome. L'imaging a montaggio intero per le misurazioni delle dimensioni del rene intatto è stato eseguito utilizzando una Leica MZFLIII dotata di una fotocamera Leica DFC7000T. Analisi quantitative basate su immunocolorazione e imaging La quantificazione della densità glomerulare è stata calcolata dalle sezioni sequenziali dei reni E18.5 e P7. I reni sono stati sezionati e le sezioni per la quantificazione glomerulare sono state raccolte ogni 125 µm per evitare il conteggio delle iterazioni dei glomeruli. Il numero di glomeruli in ciascuna sezione è stato contato manualmente e l'area di ciascun rene è stata misurata con il software Fiji ImageJ (V1.51) delineando manualmente il contorno. Per calcolare le densità glomerulari, il numero totale di glomeruli

Fig. 9. Schema degli effetti dell'eccesso di GDNF sullo sviluppo di reni di topo. (A) Nei reni embrionali in fase di crescita attiva, le cellule progenitrici del nefrone (NPC, rosso) ricevono segnali di guida secreti (ad es. Wnt11 e Wnt9b) dalle punte delle gemme ureteriche (UBT, blu scuro) per controllare l'equilibrio della proliferazione NP e dell'auto-rinnovamento e la loro differenziazione in aggregati peritubulari (PA, cluster di cellule rosa). (B) Nei reni postnatali, l'identità della punta dell'UB (UB, azzurro) è persa, come molecolarmente evidenziato dal declino nell'espressione di es. Wnt9b, Wnt11, Crlf1 e Etv4/5, indicato da sottili lettere rosse. La graduale perdita dei fattori secreti derivati ​​da UB (Wnt9b, Wnt11 e Crlf1) contribuisce al declino della proliferazione e dell'autorinnovamento delle NP. Contemporaneamente, i livelli di GDNF e FGF diminuiscono, il che coincide con una differenziazione accelerata di NP. Questi insieme esauriscono rapidamente il pool di NP con conseguente cessazione della nefrogenesi. (C) L'eccesso di GDNF nei reni embrionali induce una morfologia UBT anormale e aumenta l'espressione delle molecole regolatrici secrete dal germoglio (Crlf1, Sign, Wnt11 e Wnt9b). L'eccessiva espressione di molecole secrete dalle gemme ha un effetto inibitorio sul ciclo cellulare NP con conseguente riduzione della proliferazione e dell'autorinnovamento. I numeri NP complessivi drop-in rallentano la differenziazione PA, come rilevato dall'espressione Wnt4 ridotta. (D) Nei reni postnatali, la morfologia UBT, e quindi la nicchia che fornisce per l'NPS, si normalizza nonostante l'espressione superiore a WT di bersagli secreti da gemma (Crlf1, Etv4/5 e Lama1). Insieme a Wnt9b e Wnt11 normalizzati (non mostrati), questi cambiamenti molecolari sovvenzionano la normale proliferazione, auto-rinnovamento e differenziazione delle NP, come evidenziato dal mantenimento di una vasta popolazione di NP, una maggiore espressione di Wnt4 e una quantità simile di precursori del nefrone (cluster rosa di cellule) come nei reni embrionali WT. Attraverso tali meccanismi, l'eccesso costitutivo di GDNF sotto il proprio promotore consente al programma nefrogenico di continuare fino a P7. Testo grigio scuro, espressione non modificata; testo rosso, espressione ridotta; testo verde, maggiore espressione.

e il numero di glomeruli nella corteccia sono stati contati separatamente. Per ciascun campione sono stati quindi calcolati l'area renale totale media e i numeri complessivi e corticali dei glomeruli. La densità glomerulare media è stata calcolata dividendo il numero glomerulare medio per l'area media misurata. La media dei glomeruli corticali all'interno dell'intera area media è stata calcolata dividendo il numero glomerulare corticale medio per l'area totale media misurata. Sono stati registrati solo glomeruli con forme intatte. Quantificazione del totale di SEI2-NPS positivi a E11,5 (n=4 per WT, n=5 per Gdnfhyper/iper) e E12,5 (n=10 reni/ trattamento, tre esperimenti indipendenti) erano basati sulla colorazione con immunofluorescenza a montaggio intero. Le immagini sono state acquisite con l'applicazione di Zeiss ApoTome e quindi elaborate con il software Imaris (Bitplane) utilizzando il tracciamento spot. Tutte le immagini sono state elaborate con protocolli di analisi identici. Per normalizzare la variazione tra le cucciolate, la quantità media di SEI2-NP positive nei reni WT all'interno di ciascuna cucciolata è stata impostata al 100% e la quantità di SEI2- NP positive nel Gdnfhyper /iperreni è stata confrontata con la quantità media nei reni WT all'interno della cucciolata. L'indice mitotico di SIX2-NPS positivo nei reni E12,5 (n=10 reni/trattamento, tre esperimenti indipendenti) coltivati ​​con GDNF esogeno è stato calcolato in modo simile per normalizzare la variazione tra le cucciolate.

La proporzione media di SIX{0}}NP positive in proliferazione nei reni WT e nei reni coltivati ​​senza GNDF esogeno all'interno di ciascuna cucciolata è stata fissata all'100 percento e la proporzione di SIX in proliferazione{{2 }}NP positivi in ​​presenza di GDNF in eccesso (Gdnfhyper/iper reni e applicazione esogena) dalla stessa cucciolata sono stati tracciati nella figura dopo il confronto con i compagni di cucciolata WT. L'indice mitotico di SIX2-NPS positivo in reni E11.5 coltivati ​​con GDNF esogeno è stato tracciato come dato/valore originale. Il calcolo della media di SIX2-NPS positivi per nicchia nefrogenica (E14,5 e P0) e nicchie nefrogeniche con progenitori (P3-P6) è stato condotto mediante colorazione con immunofluorescenza in sezioni di paraffina. Il numero di SIX{12}}NPS positivi è stato contato con il software Fiji ImageJ (V1.51) su ciascuna sezione selezionata per l'analisi mediante l'analisi delle particelle e il numero di punte è stato contato manualmente nelle sezioni corrispondenti. Il numero di campioni analizzati a E14.5 era di tre reni per WT e Gdnfhyper/iper reni e due reni per Gdnfhyper/iper; Wnt11 più /-. Il numero di punte analizzate a E14.5 era 207 in WT, 431 in Gdnfhyper/iper e 107 per Gdnfhyper/iper; Wnt11 più /− reni. Il numero di campioni analizzati a P0 era di tre reni per genotipo e un numero di punte analizzate, presentato nelle figure corrispondenti, varia da 10 a 315, essendo il più basso nei reni WT P6, in cui le punte sono raramente presenti. Le misurazioni della punta UB sono state eseguite utilizzando il programma LAS X del sistema operativo del microscopio Leica dopo 48 ore di coltura in presenza di sostanze chimiche specificate e visualizzazione delle punte con l'anticorpo E-caderina (Tabella S1). Le punte sono state misurate da sei reni in ciascuna condizione di due serie indipendenti di esperimenti in cui il numero di punte misurate era: 101 per GDNF, 131 per IWR1 e 115 per 75 µM IWR1 più 50 ng/ml GDNF. Le misurazioni delle dimensioni del rene negli esperimenti che valutavano l'effetto della cancellazione di Wnt11 in Gdnfhyper/iper background sono state condotte con il software Fiji ImageJ (V1.51) su immagini a montaggio intero attraverso il tracciamento manuale del contorno del rene. Analisi statistica Tutti i valori sono presentati come media ± sem tranne l'analisi degli effetti principali di Gdnf e Wnt11 sulla dimensione del rene, che è mostrata come media ± sd La significatività statistica è stata fissata a P<0.05 for="" all="" the="" analyses.="" independentsamples="" two-tailed="" t-test="" was="" used="" for="" pairwise="" comparisons="" with="" spss="" statistics="" software="" (ibm;="" version="" 25)="" in="" the="" study="" unless="" otherwise="" noted.="" the="" data="" obtained="" via="" in="" vitro="" tissue="" culture="" with="" exogenous="" gdnf="" was="" analyzed="" with="" the="" paired-sample="" t-test="" using="" spss="" statistics="" software.="" the="" impact="" of="" genetically="" modified="" gdnf="" and="" wnt11="" expression="" on="" kidney="" size="" was="" analyzed="" via="" two-way="" anova="" followed="" by="" main="" effects="" test="" with="" spss="" statistics="" software.="" the="" statistical="" significance="" for="" the="" deviation="" of="" gene="" distribution="" from="" mendelian="" ratio="" was="" performed="" using="" the="" χ2="" test="" also="" with="" spss="" statistics="" software.="" the="" data="" obtained="" from="" elisa,="" qrtpcr,="" and="" wnt="" inhibition="" experiments="" were="" analyzed="" with="" one-way="" anova="" followed="" by="" bonferroni="" posthoc="" test="" using="" spss="" statistics="" software.="" reverse="" transcription="" and="" quantitative="" rt-pcr="" (qrt-pcr)="" experiments="" were="" conducted="" as="" previously="" reported="" (kumar="" et="" al.,="" 2015).="" in="" more="" detail,="" 150-500="" ng="" of="" total="" rna="" from="" each="" sample="" (n="3" kidneys/genotype="" at="" the="" given="" stage)="" was="" treated="" with="" rnase-free="" dnase="" i="" (thermo="" fisher="" scientific).="" the="" reverse="" transcription="" reaction="" was="" performed="" with="" random="" hexamer="" primers="" and="" revertaid="" reverse="" transcriptase="" (thermo="" fisher="" scientific)="" immediately="" after="" inactivation="" of="" dnase="" i="" with="" 5="" mm="" edta="" at="" 65°c.="" complementary="" dna="" (cdna)="" was="" diluted="" 10×="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" qrt-pcr.="" for="" qrt-pcr,="" lightcycler="" 480="" sybr="" green="" i="" master="" (roche)="" or="" bio-rad="" c1000="" touch="" thermal="" cycler="" upgraded="" to="" cfx384="" system="" (bio-rad),="" supplied="" with="" sybr="" green="" i="" master="" (roche)="" and="" 250="" pmol="" primers="" were="" loaded="" into="" the="" well="" of="" 384-well="" plates="" with="" a="" total="" volume="" of="" 10="" µl.="" negative="" control="" was="" always="" included="" in="" every="" reaction="" via="" setting="" conditions="" with="" minus-reverse="" transcription="" or="" water.="" a="" combination="" of="" pgk1,="" hprt,="" and="" gapdh="" was="" used="" as="" the="" reference="" genes="" in="" all="" the="" qrt-pcr="" experiments,="" except="" the="" one="" with="" p7.5="" kidneys,="" in="" which="" mouse="" actb="" as="" the="" reference="" gene.="" primer="" sequences="" can="" be="" found="" in="" table="">

Ringraziamenti Ringraziamo il personale delle unità di imaging e microscopia ottica Biomedicum presso l'Istituto di scienze della vita di Helsinki (HiLIFE) per il loro prezioso aiuto nell'analisi delle immagini e nelle tecniche di quantificazione. I topi Wnt11 sono stati gentilmente forniti dal Professor Seppo Vainio (Università di Oulu, Finlandia) e inviati al Laboratory Animal Center di HiLIFE, Università di Helsinki