I recettori della dopamina D1- e D2-simili regolano in modo opposto la durata della vita tramite un meccanismo di restrizione dietetica in Cistanche

Astratto

Contesto: nonostante i recenti progressi nella comprensione dei meccanismi molecolari che regolano l'invecchiamento e la durata della vita e i percorsi coinvolti nella conservazione in diverse specie, non è stata raggiunta una piena comprensione del processo di invecchiamento. In particolare, prove crescenti suggeriscono un ruolo attivo del sistema nervoso nella regolazione della durata della vita, con i neuroni sensoriali, così come la segnalazione della serotonina e del GABA, che hanno dimostrato di regolare la durata della vita inCistanche. Tuttavia, il contributo di ulteriori fattori neurali e un'ampia comprensione del ruolo del sistema nervoso inregolare l'invecchiamentoresta da stabilire. Qui, esaminiamo l'impatto del sistema della dopamina inregolazione dell'invecchiamento a Cistanche.

Risultati: riportiamo che le mutazioni di DOP-4, un recettore dopaminergico D1-like (D1R), e DOP-2, un recettore dopaminergico D{2-like (D2R) in modo opposto durata della vita interessata, durata del movimento rapido del corpo, durata della vita riproduttiva e tasso di sviluppo in Cistanche. L'attivazione di D2R utilizzando aripiprazolo, un farmaco antipsicotico, ha notevolmente esteso sia la durata della vita che la durata della salute. Al contrario, l'inibizione del D2R utilizzando la quetiapina ha accorciato la durata della vita del verme, supportando ulteriormente il ruolo dei recettori della dopamina nella regolazione della durata della vita. Dal punto di vista meccanicistico, la segnalazione D2R regola la durata della vita attraverso un meccanismo di restrizione alimentare mediato dal percorso AAK-2-DAF-16.

Il percorso DAG-PKC/PKD collega la segnalazione tra i recettori della dopamina e il percorso AAK-2-DAF-16 a valle per trasmettere segnali di longevità. Conclusioni: questi dati hanno dimostrato un nuovo ruolo dei recettori della dopamina nella regolazione della durata della vita e delle restrizioni dietetiche . L'aripiprazolo antipsicotico clinicamente approvato ha un potenziale come nuovo farmaco antietà.

Parole chiave: dopamina, durata della vita,Cistanche, Aripiprazolo, Restrizione dietetica

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Sfondo di Cistanche sulprocesso d'invecchiamento:

I meccanismi biologici dell'invecchiamento non sono ancora ben compresi, nonostante diversi percorsi di regolazione dell'invecchiamento conservati che sono stati identificati dai lieviti all'uomo [1]. Prove crescenti suggeriscono che il sistema nervoso svolge un ruolo attivo nelprocesso d'invecchiamento. Ad esempio, gli studi hanno dimostrato che i neuroni sensoriali svolgono un ruolo essenziale nella regolazione della durata della vita [2, 3].

È stato riportato che il segnale della serotonina modula in modo antagonistico la longevità attraverso diversi recettori della serotonina [4]. Recentemente, è stato anche scoperto che la segnalazione dell'acido gamma-aminobutirrico dei neuroni inibitori (GABA) regola la durata della vita in Cistanche [5]. Tuttavia, resta ancora molto da imparare riguardo al ruolo del sistema nervoso nella regolazione del processo di invecchiamento.

Se il sistema della dopaminaregola il processo di invecchiamentoe la durata della vita non è chiara. La dopamina è un neurotrasmettitore amminico biogenico, che modula principalmente gli output comportamentali in risposta alle condizioni ambientali [6, 7]. Ad esempio, il sistema della dopamina funziona in comportamenti come la ricerca della ricompensa e il fisico

mobilità ed è noto per essere vulnerabile aleffetti dell'invecchiamento. Una volta rilasciata dai terminali presinaptici, la dopamina attiva due classi di recettori accoppiati a proteine ​​G: le classi D1 e D2 dei recettori della dopamina [8]. In Cistanche: DOP-1 e DOP-4 appartengono ai D1-come i recettori della dopamina (D1R), mentre DOP-2 e DOP-3 appartengono ai D{{ 10}}come i recettori della dopamina (D2R) [9-11].

Uno studio precedente ha mostrato che i vermi portatori di una mutazione in un gene della biosintesi della dopamina cat-2 avevano una durata di vita normale, suggerendo che la sola riduzione della produzione di dopamina non influisce sulla longevità [4]. Tuttavia, poiché D1R e D2R regolano in modo opposto una serie di comportamenti in Cistanche, tra cui il processo decisionale, il rallentamento basale e la risposta al cibo [12-14], è importante determinare i ruoli specifici di ciascuno dei recettori della dopamina nella regolazione della durata della vita di Cistanche. A causa della sua breve durata di vita, dei fenotipi osservabili legati all'età e dei percorsi biologici conservati legati all'invecchiamento [15, 16], Cistanche è uno degli organismi modello più utilizzati per studiare l'invecchiamento. Nonostante il suo sistema nervoso semplice, Cistanche possiede un sistema dopaminergico conservato rispetto a quello del sistema nervoso dei mammiferi, compresi gli enzimi biosintetici responsabili della sintesi della dopamina, i meccanismi per il rilascio sinaptico e l'espressione dei recettori della dopamina [17]. Queste caratteristiche hanno reso Cistanche un sistema modello genetico adatto per studiare il ruolo del sistema della dopamina nella longevità.

In the present study, we demonstrate that dopamine D1- and D2-like receptors oppositely regulate worm lifespan through a dietary restriction (DR) mechanism. Using molecular genetics approach and pharmacological tools, we teased out how dopamine receptors send longevity signals through their G-protein-coupled signaling transduction pathways to downstream DR-related pathways. Our findings uncover a novel mechanism of dopamine signaling in DR and lifespan regulation. Notably, aripiprazole, a clinically widely used antipsychotic drug, robustly extends both the lifespan (>50%) and healthspan (>80 percento) di Cistanche attivando la via mediata dal recettore della dopamina. La sorprendente scoperta dell'aripiprazolo promette un ulteriore sviluppo come nuovo farmaco antietà potenzialmente sicuro.

Risultati di Cistanche sull'antietà

I recettori simili a D1 e D2 della dopamina hanno effetti opposti sulla durata della vita di Cistanche. Per determinare il ruolo di ciascun recettore della dopamina nella durata della vita del verme, ceppi di vermi portatori di mutazioni su ciascuno dei quattro geni del recettore della dopamina, incluso dop-1, dop-2, dop-3 e dop-4, sono stati usati per l'analisi della durata della vita. Curiosamente, il mutante dop-2 ha mostrato una durata della vita significativamente ridotta (−11,8%, P <0.0001) rispetto a N2

animali, mentre il mutante dop{{0}} era significativamente longevo (più 29,4%, P <0,0001) rispetto agli animali N2. Anche i mutanti dop-1 e dop-3 hanno mostrato cambiamenti nella durata della vita (rispettivamente più 5,9% e -8,8%) rispetto agli animali N2, che non erano statisticamente significativi (P=0. 0765, P=0.2468, rispettivamente, Fig. 1A). Questi dati hanno dimostrato che la segnalazione tramite D2R (DOP-2) estende la durata della vita, mentre la segnalazione tramite D1R (DOP-4) la accorcia. La mancanza di significatività statistica nei cambiamenti indotti dai mutanti dop-1 e dop-3 nella durata della vita ha indicato che DOP-4 e DOP-2 sono i principali sottotipi di D1R e D2R nella regolazione durata della vita, rispettivamente.

L'estensione della durata della vita è stata associata a un rallentamento dell'invecchiamento locomotorio e riproduttivo, nonché a uno sviluppo ritardato [18-20]. Per comprendere ulteriormente i ruoli dei recettori della dopamina nel processo di invecchiamento, abbiamo successivamente esaminato la durata del movimento rapido del corpo, la durata della vita riproduttiva e il tasso di sviluppo di questi mutanti.

Rispetto agli animali N2, il mutante dop-2 ha mostrato una durata della vita riproduttiva più breve e una durata del movimento del corpo veloce rispetto agli animali N2, mentre il mutante dop-4 ha avuto una durata della vita riproduttiva estesa e una durata del movimento del corpo veloce (Fig. 1B -D). Si è sviluppato il mutante dop-2

più veloce, mentre il mutante dop-4 ha mostrato un tasso di sviluppo più lento (Fig. 1D). Questi dati hanno ulteriormente supportato l'idea che specifici recettori della dopamina abbiano svolto un ruolo selettivo e unico nella regolazione della durata della vita.

L'attivazione o l'inibizione farmacologica di D2R esercita effetti opposti sulla durata della vita di Cistanche. Per confermare ulteriormente il ruolo di D2R nell'estensione della durata di vita in Cistanche, è stato utilizzato un approccio farmacologico che utilizza aripiprazolo, un agonista di D2R, e quetiapina, un antagonista di D2R, per determinare il effetto sulla durata della vita del verme [21, 22]. I vermi N2 di tipo selvaggio sono stati trattati con aripiprazolo e quetiapina a concentrazioni comprese tra 3 e 100 μM. Sono state osservate robuste estensioni della durata della vita nei vermi trattati con aripiprazolo. L'aripiprazolo a una concentrazione di 3 μM ha esteso significativamente la durata mediana dei vermi N2 del 21,1% (P <0,0001).

I vermi esposti a 100 μM di aripiprazolo hanno raggiunto un'estensione massima della durata della vita fino al 52,6% (P <0,0001) (Fig. 2A). Al contrario, il trattamento con quetiapina ha ridotto in modo dose-dipendente la durata della vita del verme (Fig. 2B). Le curve dose-risposta sono mostrate in Fig. 2C. Questi risultati, inoltre, supportano un ruolo chiave del D2R nella regolazione della durata della vita dei vermi.

Fig. 1 I recettori della dopamina D1- e D2-simili regolano in modo opposto la durata della vita in Cistanche. A Curve di sopravvivenza di diversi ceppi di vermi coltivati ​​a 20 gradi (i ceppi mutanti sono stati confrontati con il tipo selvaggio N2: ns=non significativo; **** indicato P<0.0001, log-rank test). B Fast body movement spans of different worm strain cultured at 20 °C (mutant strains were compared with the N2: **, P <0.01, log-rank test). C Progeny produced per day by different worm strains. D The number of worms with different reproductive lifespans. E The developmental stage of different worm strains reached 2.5 days post-hatching. (see Additional fle 2 for supporting data). Experiments were performed in three independent biological replicates

L'aripiprazolo prolunga la durata della vita di Cistanche

attraverso DOP‑2 Per determinare se l'estensione della durata della vita mediata da aripiprazolo dipende dal D2R, abbiamo prima testato il farmaco su un gatto mutante carente di sintesi della dopamina -2. L'aripiprazolo non è riuscito a prolungare la durata della vita nel mutante cat -2 (Fig. 3A), suggerendo che l'effetto di estensione della durata della vita dell'aripiprazolo richiede la segnalazione della dopamina. Successivamente abbiamo assunto un dop-2; dop-3 doppio mutante e ha scoperto che era insensibile al trattamento con aripiprazolo (Fig. 3B).

Per studiare quale di questi due recettori contribuisce all'effetto di estensione della durata della vita, abbiamo testato ogni singolo mutante. I risultati hanno mostrato che l'aripiprazolo non ha prolungato la durata della vita del mutante dop-2 (Fig. 3C), mentre il mutante dop-3 ha mostrato una robusta estensione della durata della vita dopo il trattamento con aripiprazolo (Fig. 3D). Questi risultati hanno dimostrato che l'estensione della durata della vita da parte dell'aripiprazolo è stata conferita dalla sua azione sul DOP-2.

L'aripiprazolo media l'estensione della durata della vita attraverso la segnalazione D2R

Segnali DOP-2 attraverso i percorsi G o [8, 23]. Per identificare gli effettori DOP-2 a valle che mediano l'effetto di pro-longevità indotto da aripiprazolo, abbiamo prima testato un mutante privo di GOA-1, l'ortologo Cistanche della proteina G o [24]. Come previsto, GOA -1 è necessario per l'estensione della durata della vita indotta da aripiprazolo (Fig. 4A). D2R inibisce l'adenilato ciclasi e quindi sopprime la produzione di AMP ciclico intracellulare (cAMP) e l'attività della proteina chinasi A (PKA) [25]. È stato dimostrato che il percorso cAMP-PKA media la durata della vita e le risposte DR [26-28]. acy-1 codifica per l'adenilato ciclasi e regola la produzione di cAMP in Cistanche [29]. Il genoma di Te Cistanche codifica una subunità catalitica PKA (KIN-1) e una subunità regolatoria PKA (KIN-2) [30-32]. Il legame di cAMP a KIN-2 provoca il rilascio di KIN attivo-1 [29]. I risultati hanno mostrato che l'estensione della durata della vita mediante il trattamento con aripiprazolo dipendeva solo in parte da ACY-1 e KIN-1 (Fig. 4B, C).

Fig. 2 L'attivazione o l'inibizione farmacologica di D2R esercita effetti opposti sulla durata della vita di Cistanche. A Curve di sopravvivenza di vermi wild-type (N2) coltivati ​​a 20 gradi su piastre NGM contenenti diverse concentrazioni di aripiprazolo (Ari). Il trattamento con DMSO è stato utilizzato come controllo. B Curve di sopravvivenza dei vermi N2 trattati con le concentrazioni indicate di quetiapina (Que) o DMSO a 20 gradi. (il trattamento con aripiprazolo e quetiapina è stato confrontato con il trattamento con DMSO: **indicato P<0.01. ***, P <0.001. ****, P <0.0001, log-rank test). C Dose-response curve of aripiprazole (Ari) and quetiapine (Que) treatment. (see Additional fle 2 for supporting data). Experiments were performed in three independent biological replicates

Fig. 3 Aripiprazole extends the lifespan of Cistanche through DOP-2. Survival curves of mutant cat-2 (A); dop-2; dop-3 (B); dop-2 (C); dop-3 (D) treated with 100μM of aripiprazole or DMSO at 20 °C (comparison between DMSO and aripiprazole (Ari) treatment: ns=not significant with P >0.05; ****indicato P<0.0001, log-rank test) (see Additional fle 2 for supporting data). Experiments were performed in three independent biological replicates

codifica quattro omologhi PKC (tpa-1, pkc{-1, pkc-2 e pkc-3) e due omologhi PKD (dkf-1 e dkf{{5} }) [5]. Tra i quattro omologhi PKC, pkc-1, pkc-3 e tpa- 1 erano necessari affinché l'aripiprazolo prolungasse la durata della vita, mentre pkc-2 era superfluo (Fig. 4E-H) . Per i due omologhi PKD, l'estensione della durata della vita mediata da aripiprazolo dipendeva da dkf-1 piuttosto che da dkf-2 (Fig. 4I, J). Questi risultati hanno suggerito che l'aripiprazolo può prolungare la durata della vita sia attraverso PKC che PKD. Per confermare ulteriormente il ruolo del percorso DGK-PKC/PKD, abbiamo anche testato i mutanti egl-30 e egl-8, entrambi i quali dovrebbero avere una ridotta produzione di DAG e quindi una ridotta attività PKC/PKD [34]. Come previsto, l'aripiprazolo non è riuscito a prolungare la durata della vita in entrambi i mutanti (Fig. 4K, L), supportando ulteriormente il ruolo chiave del percorso DGK PKC / PKD nell'estensione della durata della vita mediata dall'aripiprazolo. Nel complesso, l'aripiprazolo media l'estensione della durata della vita attraverso GOA-1-DGK-1-PKC/PKD, ma potrebbe dipendere solo in parte dal percorso cAMP-PKA. L'aripiprazolo prolunga la durata della vita dei vermi attraverso un meccanismo di restrizione dietetica (DR) La DR ritarda notevolmente il processo di invecchiamento in molte specie [38]. Diversi fenotipi correlati alla DR in Cistanche includevano un aumento della durata della salute, un comportamento alimentare ridotto, dimensioni ridotte della covata, un periodo di riproduzione prolungato e un ridotto accumulo di lipidi [39, 40]. Pertanto, volevamo sapere se la segnalazione della dopamina e il trattamento con aripiprazolo possono modulare la durata della vita attraverso i meccanismi DR. Abbiamo prima testato l'aripiprazolo su un mutante -2 di lunga durata, un modello genetico di DR con un deficit nel pompaggio faringeo [41]. L'aripiprazolo non ha ulteriormente esteso la durata della vita del mutante -2 (Fig. 5A), indicando che i benefici della durata della vita dell'aripiprazolo erano effettivamente conferiti da un meccanismo DR. Sono stati esaminati anche diversi fenotipi correlati alla DR. Oltre all'estensione della durata della vita, anche la durata della salute che riflette la qualità dell'estensione della vita è stata di grande importanza per un invecchiamento sano. L'aripiprazolo ha aumentato la durata di salute di Cistanche in modo dose-dipendente, il che è stato associato al suo effetto sulla durata della vita. L'aripiprazolo a 100 μM ha determinato un incremento massimo (87,5 percento) sulla durata della salute degli animali N2 (Fig. 5B). Il trattamento con aripiprazolo ha anche ridotto la progenie totale prodotta per verme, anche con un periodo di riproduzione più esteso (Fig. 5C, D). Inoltre, la colorazione con olio rosso O ha mostrato che i vermi trattati con aripiprazole avevano ridotto l'accumulo di lipidi (Fig. 5E, F). La velocità di pompaggio faringeo correla positivamente con l'assunzione di cibo a Cistanche. Una delle cause dirette dell'effetto simil-DR è la riduzione dell'assunzione di cibo dovuta alla diminuzione della velocità di pompaggio faringeo, come quella osservata nel mutante eat-2. Come mostrato in Fig. 5G, i vermi N2 trattati con aripiprazolo hanno mostrato una velocità di pompaggio faringea ridotta, suggerendo inoltre che l'aripiprazolo ha innescato uno stato simile a DR in Cistanche.

Fig. 5 L'aripiprazolo prolunga la durata della vita del verme attraverso un meccanismo di restrizione dietetica. A Curve di sopravvivenza del mutante eat-2 trattato con 100μM

of aripiprazole (Ari) or DMSO at 20 °C (comparison between DMSO and Ari treatment: ns=not signifcant, P >0 .05. **, P<0.01. ****, P <0.0001, log-rank test). B Fast body movement spans of wild-type (N2) worms cultured at 20 °C on NGM plates containing indicated concentrations of aripiprazole (Ari) or DMSO. C, D Changes in brood size (C) and reproductive span (D) of N2 animals treated with or without 100μM of aripiprazole (Ari) (comparison between DMSO and aripiprazole (Ari) treatment: ****, P <0.0001, t-test). E Representative images of ORO staining of worms treated with or without aripiprazole (Ari) for 7days. Scale bar=200μm. F Relative ORO intensity of worms treated with or without aripiprazole for 7days (comparison between DMSO and aripiprazole (Ari) treatment: ****, P <0.0001, t-test). G Pharyngeal pumping rate of N2 worms treated with 100μM of aripiprazole (Ari) or DMSO for 5days (comparison between DMSO and Ari treatment: **** indicated P <0.0001, t-test). (see Additional fle 2 for supporting data). The brood size assay was performed in two independent biological replicates. Other experiments were performed in three independent biological replicates

L'aripiprazolo media l'estensione della durata della vita simile al DR attraverso il percorso AAK-2-DAF-16. Per analizzare ulteriormente i possibili meccanismi dell'estensione della durata della vita simile al DR mediata dall'aripiprazolo, abbiamo esaminato DAF-16, un omologo Cistanche della trascrizione FOXO dei mammiferi fattore noto per svolgere un ruolo centrale nella durata della vita e nella regolazione della DR [42]. Sorprendentemente, l'effetto di estensione della durata della vita dell'aripiprazolo è stato completamente abolito nel mutante daf-16 (Fig. 6A). DAF-16 si localizza nel citosol in condizioni normali. Una volta attivato, DAF-16 viene traslocato nel nucleo per innescare la trascrizione di vari geni che regolano la resistenza allo stress,

metabolismo, riproduzione e longevità. In effetti, i vermi TJ356 con DAF -16 marcato con proteina fluorescente verde (GFP) hanno mostrato un aumento dell'accumulo di DAF -16 nel nucleo una volta trattato con aripiprazolo (Fig. 6B, C), suggerendo che l'aripiprazolo media la DR -come la durata della vita

estensione tramite DAF-16. Nel meccanismo DR-like, insulina/fattore di crescita insulino-simile 1 (IGF-1) segnalazione, regolatore silenzioso delle informazioni

Fig. 6 Aripiprazole mediates DR-like lifespan extension through the AAK-2-DAF-16 pathway. A Survival curve of the daf-16 mutant treated with 100μM of aripiprazole (Ari) or DMSO at 20 °C (comparison between DMSO and aripiprazole (Ari) treatment: ns=not signifcant with P >0.05, log-rank test). B Le immagini rappresentative di vermi con localizzazione DAF citosolica, intermedia e nucleare -16 nei ceppi transgenici TJ356. Barra di scala=50μm. C Il percentile degli animali TJ356 trattati con 100μM di aripiprazolo (Ari) o DMSO con localizzazione citosolica, intermedia o nucleare. D–J Curve di sopravvivenza del mutante daf-2 (D), age-1 (E), akt-1 (F), akt-2 (G), sir{{ 12}}.1 (H), aak-2 (I), par-4 (J) trattato con 100μM di aripiprazolo

(Ari) or DMSO at 20 °C (comparison between DMSO and aripiprazole (Ari) treatment: ns=not significant with P >0.05. ** indicato pag<0.01. ****, p<0.0001, log-rank test) (see Additional fle 2 for supporting data). Experiments were performed in three independent biological replicates

agli animali N2 (Fig. 6H), dimostrando che anche l'estensione della durata della vita mediata da aripiprazolo era indipendente dal SIR-2.1.

È stato dimostrato che l'aripiprazolo attiva l'AMPK dei mammiferi nelle cellule PC12 [43, 44]. Pertanto, abbiamo ipotizzato che l'aripiprazolo potesse funzionare attraverso AAK-2 per mediare l'estensione della durata della vita. Come mostrato in Fig. 6I, l'aripiprazolo non è riuscito a prolungare la durata dell'aak-2

mutante, suggerendo che aak-2 è necessario per gli effetti del ripiprazolo sulla durata della vita. Abbiamo ulteriormente testato un mutante recante una mutazione nell'omologo PAR -4 della chinasi epatica Cistanche B1 (LKB1), una chinasi a monte di AMPK. Il mutante par -4 non ha mostrato alcuna estensione della durata della vita dopo il trattamento con aripiprazolo (Fig. 6J), il che ha ulteriormente supportato l'ipotesi che l'estensione della durata della vita mediata da aripiprazolo richieda l'attività di AAK -2.

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