L'echinacoside promuove la proliferazione delle cellule epiteliali tubulari renali umane bloccando la via di segnalazione NF‑κB mediata da HBX/TREM2

Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

YuFan ZHanG, QinFanG Wu, liMin ZHonG, donGWei GonG

Astratto.

La proteina del virus dell'epatite B X (HBX) è necessaria per la replicazione dell'HBV e svolge un ruolo nella progressione dell'epatite nell'uomo. Tuttavia, la funzione sottostante dell'HBX durante la glomerulonefrite cronica indotta da HBV (HBV-Gn) è sconosciuta. (echinacoside da cistanche)(ecH) è un glicoside feniletanoide del genere Cistanche, che possiede forti attività antiapoptotiche e neuroprotettive. nel presente studio, sono state esplorate la funzione di HBX e la relazione tra HBX ed ecH nelle cellule epiteliali tubulari renali umane (rTecs; linea cellulare HK-2). Per quantificare i livelli di espressione di mRNA e proteine ​​di HBX nelle cellule HK-2, sono state utilizzate analisi Pcr e western blot quantitativa trascrizione inversa, rispettivamente. Il test del kit di conteggio cellulare-8 è stato eseguito per analizzare la proliferazione cellulare. L'analisi della citometria a flusso è stata utilizzata per determinare il tasso di apoptosi. HBX ha mostrato effetti antiproliferativi e proapoptotici nelle cellule HK-2 ed è stato positivamente associato al recettore scatenante espresso sull'espressione della cellula mieloide 2 (TreM2). Inoltre, ECH ha interrotto la funzione di HBX nelle cellule HK-2, funzionando come un soppressore di HBX. Inoltre, un inibitore specifico di NF‑κB, PdTc, è stato utilizzato per esaminare ulteriormente la relazione tra HBX e nF-κB. I risultati hanno suggerito che nF-κB era coinvolto nella via di segnalazione HBX/TreM2 e regolava negativamente l'espressione TreM2 in RTECS. Il presente studio ha fornito nuove informazioni sulla funzione dell'HBX e ha anche indicato il potenziale valore dell'ECH come agente terapeutico per l'HBV-Gn.

introduzione

Il virus dell'epatite B (HBV) è un virus Hepadnaviridae, che porta a epatite acuta e cronica nell'uomo (1). L'HBV non solo provoca un'infezione persistente o transitoria nel fegato, ma infetta anche il tessuto extraepatico, inclusi pancreas, dotto biliare, sistema linfoide e reni (2). Inoltre, l'infezione da HBV è strettamente associata alla glomerulonefrite cronica (HBV-Gn); tuttavia, i meccanismi molecolari dell'HBV durante l'HBV-Gn non sono completamente compresi (3,4).

La proteina del virus X (HBX) dell'epatite B regolatoria dell'HBV è necessaria per la replicazione dell'HBV (5,6). numerosi studi hanno riportato che l'HBX promuove la proliferazione cellulare durante l'epatocarcinoma associato all'infezione da HBV (7-9). Le cellule epiteliali tubulari renali umane (rTecs) sono una parte importante dell'interstizio tubulare renale e svolgono un ruolo attivo nell'infiammazione renale (10). L'apoptosi rTec è strettamente associata alla disfunzione dell'interstizio tubulare, che successivamente porta alla progressione dell'HBV-Gn (10). HBX è espresso principalmente nelle cellule rTec e provoca apoptosi rTec e lesioni del tubo renale nei pazienti con HBV-Gn (11,12). Inoltre, è stato riportato che HBX sopprime la proliferazione delle rTec di ratto (13) e la sovraespressione di HBX accelera la progressione del ciclo cellulare dalla fase G1 alla fase S nelle rTec primarie, portando all'arresto del ciclo cellulare nella fase S (14). Pertanto, l'identificazione di un inibitore dell'HBX può fornire una nuova terapia per l'HBV-Gn. Tuttavia, la precisa rete molecolare dell'HBX nelle rTec umane non è completamente compresa.(echinacoside da cistanche)(ecH) è un composto naturale estratto daCistanchepiante, che mostra effetti antiapoptotici e antinfiammatori (15,16). Uno studio precedente ha riportato che ecH induce la proliferazione e previene l'apoptosi delle cellule epiteliali intestinali (17). Inoltre, è stato riportato che ecH accelera la rigenerazione ossea aumentando la proliferazione delle cellule degli osteoblasti (18). ecH può anche diminuire la replicazione dell'HBV, l'espressione dell'antigene e l'infiammazione nelle cellule epiteliali intestinali di ratto (16,19). Tuttavia, l'effetto biologico di ecH su rTecs non è stato completamente chiarito.

La sovraespressione di TreM2 ha promosso la proliferazione delle cellule di glioma (22). Al contrario, il knockdown di TreM2 diminuisce la traslocazione di nF-κB nel nucleo nelle cellule degenerative del nucleo polposo umano (23). Inoltre, TreM2 è stato identificato come un nuovo bersaglio terapeutico per la degenerazione del disco intervertebrale umano (23). Tuttavia, la funzione biologica di TreM2 nelle rTec umane non è stata segnalata. nel presente studio, la sovraespressione di HBX (oeHBX) è stata indotta nelle rTec umane (linea cellulare HK-2) ​​e, successivamente, l'effetto di ecH(echinacoside da cistanche) su cellule oeHBX trasfettate è stato studiato. Lo scopo del presente studio era di indagare le funzioni di HBX e il potenziale valore di ecH come agente terapeutico efficace per HBV-Gn.

Materiali e metodi

Cellula cultura.La linea cellulare umana rTec HK-2 è stata acquistata da Shanghai Yaji Biotechnology co., ltd. Le cellule HK-2 sono state coltivate in terreno DME/F12 (cat. n. SH30023.01B; Hyclone; cytiva) integrato con il 10% di siero bovino fetale (cat. n. 16000‑044; Gibco; Thermo Fisher Scientific, inc. .), 2 mM di l-glutamina e 1% di penicillina/streptomicina (n. cat. P1400-100; Beijing Solarbio Science & Technology co., Ltd.) a 37˚C con il 5% di CO2.

RNA isolamento e inversione trascrizione-quantitativa PCR (RT-qPCR).L'RNA totale è stato estratto dalle cellule HK-2 utilizzando Trizol® (n. cat. 1596 -026; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, inc.), secondo il protocollo del produttore. L'RNA totale è stato trascritto inversamente in cDNA utilizzando il kit di sintesi del cDNA First-Strand secondo il protocollo del produttore (n. cat. K1622; Thermo Fisher Scientific, Inc.). La qPCR è stata eseguita utilizzando la premiscela SYBr-Green secondo il protocollo del produttore (n. cat. K0223; Thermo Fisher Scientific, Inc.) su un rilevatore in tempo reale ABI‑7300 ​​(Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Le condizioni della PCR erano: 95˚C per 10 min seguiti da 40 cicli di 95˚C per 15 sec, 60˚C per 45 sec. Sono state necessarie tre ripetizioni per ciascuna reazione. Per la qPCR sono state utilizzate le seguenti coppie di primer: HBX forward, 5'-GGcTGcTaGGTTGTacTG-3' e reverse, 5'-caGaGGTGaaGcGaaGTG -3'; TreM2 avanti, 5'-TGGcacTcTcaccaTTacG-3' e indietro, 5'-ccTccc aTcaTcTTccTTcac-3'; e GaPdH avanti, 5'-AAT cccaTcaccaTcTTc-3' e indietro, 5'-aGGcTGTTG TcaTacTTc-3'. I livelli di mRNA sono stati quantificati utilizzando il metodo 2‑ΔΔCq e normalizzati al gene di riferimento internoGAPDH (24).

Sovraespressione e stendere.Per indurre la sovraespressione di HBX e TreM2, le sequenze di cDNA HBX o TreM2 a lunghezza intera sono state inserite nel vettore plVX-puro (cleantech laboratori, inc.) mediante doppia digestione (Posterioreiii eEcoRI). Successivamente, il plasmide ricombinato (1,5 µg) è stato trasfettato in cellule HK-2 (2x105). Il plasmide simulato (un vettore vuoto, 1 µg) è stato transientemente trasfettato in cellule HK-2 (2x105) come controllo negativo (oenc) utilizzando lipofectamine® 2000 (cat. n. 11668-027, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, inc.). ecH(echinacoside da cistanche)(cat. n. 82854-37-3; Biopurify Phytochemicals, ltd.) è stato sciolto in DMSO (cat. n. d2650; Sigma-Aldrich; Merck KGaa) alla concentrazione di 1, 2,5, 5, 10, 20 e

50 mg/l rispettivamente; e aggiunto alla coltura di cellule oeHBX o oeTreM2 trasfettate. La successiva sperimentazione iniziò 48 h dopo.

Per abbattere l'espressione di TreM2, sono stati sintetizzati tre piccoli (si)RNA interferenti (siTreM2-1, siTreM2-2 e siTreM2-3; 20 µM) mirati a TreM2 (Shanghai Majorbio Bio-Pharm Technology co . ltd.) e successivamente trasfettato in cellule HK-2 (2x105) utilizzando lipofectamine® 2000 secondo il protocollo del produttore (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Come controllo negativo è stata utilizzata una sequenza siRNA codificata non specifica (5'uucuccGaacGuGucacGu3, 25 nM) si-negativa (nc). Il luogo mirato e le sequenze delle sirna TreM2 sono forniti nella Tabella Si. La successiva sperimentazione è stata eseguita 48 h dopo.

Occidentale tamponando.La proteina totale è stata estratta dalle cellule HK-2

utilizzando il tampone di lisi RIPA (n. cat. BYl40825; Jrdun Biotech Co., Ltd.). La proteina totale è stata quantificata utilizzando il kit di analisi dell'acido bicinconinico (n. cat. PICPI23223; Thermo Fisher Scientific, inc.) secondo il protocollo del produttore e 20 µg di proteina/corsia sono stati separati tramite SDS-PaGe su un gel al 15%. La densitometria dei campioni è stata determinata utilizzando un lettore di micropiastre (dnM-9602, Pulangxin). Successivamente, le proteine ​​separate sono state trasferite su una membrana in PVDF. Dopo il blocco con il 5% di latte in polvere scremato per 1 ora a temperatura ambiente, la membrana è stata incubata con anticorpi primari (Tabella SII) a 4˚C durante la notte e reincubata con l'anticorpo secondario anti-topo igG (1:1, 000, cat. n. a0216, Beyotime Institute of Biotechnology) per 1 ora a 37˚C. Le bande proteiche immunoreattive sono state visualizzate utilizzando un sistema ecl (cytiva). Le macchie sono state eseguite in triplicato.GAPDHe H3 sono stati usati come controlli di caricamento rispettivamente per le proteine ​​citoplasmatiche e nucleari.

Risultati

ECH (echinacoside da cistanche)sopprime la funzione di HBX in HK-2 cellule.Valutare

la funzione di HBX, la sovraespressione di HBX è stata indotta nelle cellule HK-2. I livelli relativi di mrna e proteine ​​di HBX erano significativamente sovraregolati nelle cellule oeHBX rispetto alle cellule oenc (Fig. 1a e B). Successivamente, le cellule oeHBX sono state coltivate con diverse concentrazioni di ecH (1, 2,5, 5, 10, 20 e 50 mg/l; e1, e2.5, e5, e10, e20 ed e50, rispettivamente). La sovraespressione di HBX ha ridotto significativamente la proliferazione delle cellule HK-2 e questa diminuzione è stata invertita da ecH in modo dose-dipendente a 24 e 48 ore (Fig. 1c).

Inoltre, il tasso di proliferazione delle cellule oeHBX non ha mostrato differenze significative rispetto alle cellule trattate con E1 (Fig. 1c). Al contrario, il trattamento con e10 ha aumentato significativamente il tasso di proliferazione delle cellule oeHBX rispetto al trattamento con E20 ed E50 che non ha mostrato differenze significative (Fig. 1c). Pertanto, l'effetto di ecH sull'apoptosi è stato esaminato nelle cellule trattate con e2.5, e5 ed e{9}}. La sovraespressione di HBX ha aumentato significativamente l'apoptosi delle cellule HK-2 e il tasso di apoptosi delle cellule oeHBX è diminuito con il trattamento con ecH in modo dose-dipendente (Fig. 1d). nel complesso, i risultati hanno suggerito che ecH ha inibito la funzione di HBX nelle cellule HK-2 in modo dose-dipendente.

TREM2 espressione è inibito di ECH(echinacoside da cistanche) in trasfettato oeHBX

cellule.rT-qPcr e western blotting sono stati utilizzati per esaminare rispettivamente i livelli di espressione relativa di mrna e proteine ​​di TreM2 nelle cellule oeHBX. TreM2 mrna e livelli di espressione proteica erano significativamente sovraregolati nelle cellule oeHBX rispetto alle cellule oenc (Fig. 2a e B). Tuttavia, ecH ha ridotto i livelli di espressione di TreM2 nelle cellule oeHBX trasfettate in modo dose-dipendente (Fig. 2a e B). Pertanto, i risultati hanno suggerito che l'espressione di HBX fosse positivamente associata all'espressione di TreM2 e hanno ulteriormente indicato l'effetto soppressivo di ecH su HBX nelle cellule HK-2.

Stendere e sovraespressione di TREM2 in HK-2 cellule.Per valutare ulteriormente la funzione di TreM2, il knockdown e la sovraespressione di TreM2 sono stati indotti nelle cellule HK-2 utilizzando rispettivamente l'interferenza dell'RNA e un vettore lentivirale. Per il test di abbattimento, tre siRNA che prendono di mira il gene umanoTREM2(siTreM2-1, siTreM2-2 e siTreM2-3) sono stati trasfettati in cellule HK‑2 e un siRNA non specifico è stato utilizzato come controllo negativo (sinc). tutte e tre le sirna TreM2 hanno abbattuto con successo l'espressione endogena di TreM2 nelle cellule HK-2 (Fig. 3a e B). Tuttavia, i livelli relativi di mrna e di espressione proteica di TreM2 più bassi sono stati osservati nelle cellule trasfettate con siTreM2-1 e siTreM2-2- (Fig. 3a e B), quindi siTreM2-1 e siTreM{{13 }}le cellule trasfettate sono state scelte per la successiva sperimentazione. Per gli esperimenti di sovraespressione, è stato costruito un plasmide contenente la sequenza TreM2cdna umana a lunghezza intera e successivamente trasfettato in cellule HK-2 (oeTreM2). un

il finto plasmide fungeva da controllo negativo (oenc). Il livello di espressione di TREM2 è stato significativamente aumentato nelle cellule oeTREM2 rispetto alle cellule oenc (Fig. 3c e d). Pertanto, le cellule oeTreM2 sono state utilizzate per la successiva sperimentazione.

TREM2 silenziare diminuisce il apoptosi di oeHBX cellule.È stato valutato il profilo di apoptosi delle cellule oeHBX trasfettate con siTREM2 o sinc. Il tasso di apoptosi delle cellule oeHBX più sinc era significativamente più alto rispetto alle cellule aperte. Tuttavia, il tasso di apoptosi è stato significativamente ridotto nelle cellule oeHBX più siTreM2-1 o siTreM{2}} rispetto alle cellule oeHBX più sinc (Fig. 4a). I risultati hanno suggerito che il knockdown di TreM2 ha inibito la funzione di HBX durante l'apoptosi delle cellule HK-2.

Survivin appartiene all'inibitore di una famiglia di proteine ​​dell'apoptosi, che inibisce l'attività apoptotica e sopprime la morte cellulare (25). Targeting Survivin è stato identificato come un nuovo approccio per il trattamento del carcinoma a cellule renali (26). nF-κB è anche un inibitore dell'apoptosi che svolge un ruolo nei processi tumorali antiapoptotici (27). Inoltre, l'attivazione della caspasi3 è strettamente associata all'apoptosi (28). nel presente studio, è stato quantificato il contenuto proteico di TreM2, Survivin e cleaved caspase3 nelle cellule HK-2. Il livello di espressione di TREM2 è stato significativamente ridotto nelle cellule oeHBX più siTreM2-1/2 rispetto alle cellule oeHBX più sinc (Fig. 4B). Il livello di espressione di Survivin è stato significativamente aumentato nelle cellule oeHBX più siTreM2-1/2 rispetto alle cellule oeHBX. inoltre, il livello di espressione della caspasi3 scissa era significativamente ridotto nelle cellule oeHBX più siTreM2-1/2 rispetto alle cellule oeHBX più sinc (Fig. 4B). Inoltre, oeHBX ha ridotto significativamente la traslocazione di NF‑κB nel nucleo e la trasfezione siTREM2‑1/2 ha aumentato significativamente la traslocazione nucleare di nF-κB (Fig. 4B). Presi insieme, i risultati hanno suggerito che TreM2 fosse un fattore a valle di HBX nelle cellule HK-2, pertanto, HBX potrebbe promuovere l'apoptosi regolando l'espressione di TreM2 nelle rTec umane.

TREM2 sovraespressione sopprime il traslocazione diNF‑κB a il nucleo in HK-2 cellule.L'effetto di ech(echinacoside da cistanche)su oeTreM2-sono state analizzate le cellule trasfettate. La sovraespressione di TreM2 ha promosso l'apoptosi delle cellule HK-2 (Fig. 5a). L'apoptosi delle cellule oeTREM2 è stata significativamente ridotta dal trattamento ECH (E10; Fig. 5A). Inoltre, ECH ha ridotto significativamente l'espressione di TreM2 nelle cellule oeTreM2. La sovraespressione di TREM2 ha ridotto significativamente i livelli di espressione di Survivin, tuttavia, questa diminuzione dell'espressione è stata invertita da ecH. inoltre, i livelli di espressione proteica della caspasi3 scissa erano significativamente aumentati nelle cellule oeTreM2 rispetto alle cellule oenc; un effetto che è stato significativamente ridotto dal trattamento con ECH. Inoltre, ecH ha promosso la traslocazione di nF-κB nel nucleo nelle cellule oeTreM2 (Fig. 5B). Presi insieme, i risultati hanno indicato che ecH sopprimeva anche la funzione di TreM2 nelle cellule rTec umane.

Funzioni HBX sono soppresso di il NF‑κB inibitore PDTCin umano RTEC.Per valutare ulteriormente la relazione tra

Le cellule HBX e nF-κB, HK‑2 sono state coltivate con uno specifico inibitore di nF-κB, PdTc (10 µmol/l; P10). Il tasso di apoptosi cellulare delle cellule oeHBX era significativamente aumentato rispetto alle cellule oenc (Fig. 6a). Tuttavia, le cellule oeHBX più PdTc hanno mostrato un tasso di apoptosi significativamente aumentato rispetto alle cellule oeHBX. Inoltre, i livelli di espressione relativa di mRNA e proteine ​​di TreM2 sono diminuiti nelle cellule oeHBX più PdTc rispetto alle cellule oeHBX (Fig. 6B). Pertanto, i risultati

ha suggerito che l'espressione di TreM2 regolata negativamente da nF-κB nelle cellule trasfettate con oeHBX.

NF‑κB inibitore PDTC sopprime TREM2 promotore attività in oeHBX cellule.un reporter della luciferasi (pGl3-enhancer-luc2) contenente la sequenza del promotore di tipo selvaggio di TreM2 (pGl3-enhancer-luc2-pTreM2) è stato costruito e successivamente trasfettato in oenc, oeHBX e oeHBX più cellule in coltura P10.

L'attività della luciferasi del vettore reporter contenente il promotore di TREM2 di tipo selvaggio era significativamente aumentata nelle cellule oeHBX rispetto alle cellule oenc. Tuttavia, PdTc ha soppresso significativamente l'attività della luciferasi del reporter nelle cellule oeHBX (Fig. 7). nel complesso, i risultati hanno indicato che PdTc ha inibito la trascrizione di TreM2 sopprimendo l'attività del promotore di TreM2 nelle cellule oeHBX.

Discussione

HBX è espresso principalmente in rTecs di pazienti con HBV-Gn e funge da determinante della patogenesi virale (11,29). Pertanto, aumentare la conoscenza della funzione della rete di molecole HBX è un passaggio fondamentale nello sviluppo di un nuovo approccio per il trattamento dell'HBV-Gn. Lo scopo del presente studio era di esaminare ulteriormente la funzione di HBX ed esplorare la sua potenziale rete molecolare nelle rTec umane.

HBX inibisce la proliferazione di rTec (11). nel presente studio sono state identificate le funzioni antiproliferazione e pro-apoptosi dell'HBX negli RTEC umani, suggerendo che l'HBX ha soppresso lo sviluppo delle rTec umane. Uno studio precedente ha indicato che ecH(echinacoside da cistanche)inibisce la replicazione dell'HBV e l'espressione dell'antigene (19). nel presente studio, ecH(echinacoside da cistanche)il trattamento ha interrotto la funzione di HBX nelle cellule HK-2, pertanto HBX potrebbe essere influenzato da ecH nelle cellule HK-2.

Rapporti di medicina molecolare 22: 1137-1144, 2020 1143

Inoltre, i risultati hanno suggerito che ecH(echinacoside da cistanche)può servire come potenziale agente terapeutico per HBV-Gn.

TreM2 è un recettore immunitario innato che svolge un ruolo nella risposta infiammatoria (30). Nel presente studio, l'espressione di HBX è stata positivamente associata all'espressione di TreM2 negli RTECS umani. Inoltre, il knockdown di TREM2 ha ridotto significativamente il tasso di apoptosi delle cellule oeHBX ed ecH(echinacoside da cistanche)il trattamento ha ridotto l'effetto di oeTreM2 sull'apoptosi cellulare. Presi insieme, questi risultati hanno suggerito che TreM2 fosse preso di mira da HBX nelle celle HK-2. Pertanto, ecH(echinacoside da cistanche)può inibire l'apoptosi delle rTec umane bloccando l'attività della via di segnalazione HBX/TreM2.

Un precedente rapporto ha dimostrato che nF-κB, non solo svolge un ruolo nell'apoptosi cellulare, ma è anche coinvolto nella regolazione delle risposte immunitarie e dell'infiammazione (31). Inoltre, TreM2 è mediato dal microRNA sensibile a nF-κB-34a durante il morbo di Alzheimer e la degenerazione maculare (32,33). nel presente studio, il tasso apoptotico delle cellule oeHBX era significativamente aumentato in presenza di PdTc. Per quanto ne sappiamo, il presente studio ha suggerito per la prima volta che l'inibitore NF‑κB PdTc sopprimeva l'attività del promotore di TreM2. Inoltre, i risultati hanno suggerito che TreM2 regolasse negativamente la traslocazione di nF-κB nel nucleo nelle cellule HK-2, ma fosse positivamente associato ai livelli di espressione della caspasi3 scissa. TreM2 ha svolto un ruolo opposto nelle cellule HK-2 rispetto al suo ruolo nel nucleo polposo degenerativo umano e nelle cellule di glioma (22,23). Pertanto, il presente studio ha suggerito che TreM2 potrebbe avere funzioni diverse in diversi tipi di cellule umane.

Nel complesso, il presente studio non solo ha indicato che nF-κB era un nuovo componente della via di segnalazione HBX/TreM2, ma ha anche suggerito che nF-κB regola negativamente l'espressione di TreM2 nelle rTec umane. Tuttavia, i principali limiti del presente studio erano la mancanza diin vivoesperimenti e dati clinici. Pertanto, oltrein vivoe sono necessari studi clinici per confermare i risultati del presente studio.

nel presente studio, la funzione di ecH(echinacoside da cistanche)è stato studiato e i risultati hanno suggerito i potenziali effetti di ecH(echinacoside da cistanche)sulle vie di segnalazione nelle rTec umane. Inoltre, il presente studio ha migliorato le conoscenze esistenti sulla funzione biologica di ecH nelle cellule rTec umane e ha anche suggerito il suo potenziale come nuovo agente terapeutico per HBV-Gn.

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