L'echinacoside ritarda la senescenza cellulare delle cellule fibroblastiche umane MRC-5
Mar 10, 2022
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Il principio attivo di Cistanche: come agisce l'echinacoside antietà?
Hong Xie 1, Hui Zhu1,2, Cong Cheng1, Yu Liang1, Zhao Wang1
In questo studio sono stati studiati gli effetti dell'echinacoside, uno dei feniletanoidi isolati dagli steli di Cistanches salsa, una medicina tradizionale cinese a base di erbe, sulle cellule fibroblastiche MRC{0}} del polmone dell'embrione umano. L'attività di proliferazione cellulare è stata valutata con Alamar Blue, dimostrando che il trattamento con echinacoside potrebbe ritardare la senescenza. I risultati della citometria a flusso mostrano che l'echinacoside potrebbe far sì che le cellule nella fase G1 entrino nella fase S e nella fase G2 e potrebbe migliorare la degradazione dei ROS. I risultati del test della cometa indicano che l'echinacoside potrebbe proteggere le cellule dai danni al DNA, chiarindo in parte il meccanismo dei suoi effetti. Tutti i risultati di cui sopra suggeriscono che l'echinacoside ha una potenziale attività anti-senescenza.
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1. Introduzione
Le cellule normali coltivate in vitro proliferano per un numero limitato di raddoppi di popolazione (il "limite di Hayflflick") ed entrano in una fase di senescenza replicativa. Le cellule senescenti subiscono un arresto della crescita cellulare nella fase G1 e un cambiamento nella morfologia e nel metabolismo, compreso l'allargamento cellulare, l'aumento della biogenesi del lisosoma e l'espressione di una maggiore attività della galattosidasi a pH 6 (galattosidasi associata alla senescenza, SA- - -Gal ) (Hayflflick e Moorhead 1961; Dimri 1995). L'accumulo di cellule senescenti predice il declino correlato all'etàfazzoletto di carta/organofunzioni. Per accedere al modo di ritardare o invertire l'invecchiamento, gli sforzi per scoprire sostanze attive antietà non sono mai cessati.Echinacosideè uno dei feniletanoidi isolati dagli steli diSalsa di cistanches, una medicina erboristica tradizionale cinese, che ha potenziali attività biologiche, sia come antisiero cheantistanchezzaagente (Deng et al. 2004; Xiong et al. 1996). È stato anche segnalato che si comporta in vitro come un potentegratuitoradicalespazzino(Facino et al. 1995) e mostreneuroprotettivoattivitàin vitro e in vivo (Koo et al. 2005; Geng et al. 2007). L'echinacoside può essere un candidato per una sostanza antietà e un'attività antietà potrebbe essere una delle sue proprietà biologiche. Pertanto, abbiamo trattato una linea cellulare fibroblastica polmonare di embrione umano senescente MRC-5 con echinacoside, aspettandoci che potesse ritardare o invertire la senescenza.
2. Indagini e risultati
In primo luogo, abbiamo aggiunto l'echinacoside nel mezzo di coltura per verificarne l'influenza sulla crescita cellulare e sui cicli cellulari. È stato osservato che la vitalità delle cellule con un'esposizione di 48 ore all'echinacoside è aumentata evidentemente rispetto al controllo, poiché la concentrazione è aumentata (Fig. 1A), indicando che l'echinacoside ha aiutato le cellule senescenti a proliferare. Il risultato della colorazione con SA-Gal ha mostrato che il livello di SA--Gal è ovviamente diminuito dopo il trattamento con echinacoside (dati non mostrati), suggerendo che una parte delle cellule senescenti era invertita dalla senescenza. Per confermare se le cellule senescenti fossero effettivamente spinte a proliferare dall'echinacoside, è stata introdotta un'altra citometria per controllare l'alterazione della fase del ciclo cellulare delle cellule senescenti MRC-5 dopo il trattamento con echinacoside. Nel nostro studio, abbiamo osservato che con l'aumento della concentrazione di Echinacoside, il rapporto tra le cellule nel periodo G1 si riduceva gradualmente. Al contrario, più cellule sono state spinte ad entrare nella fase S e nella fase G2 (Fig. 1B). L'accumulo di focolai di eterocromatina associati alla senescenza (SAHF) è un altro biomarcatore specifico delle cellule senescenti (Shay e Wright 2001). Le cellule senescenti mostravano focolai di DNA punteggiati che sono stati visualizzati dalla colorazione di Hoechst (Fig. 1C). Al contrario, le cellule MRC-5 trattate con echinacoside sembravano avere meno SAHF.
Il livello di specie reattive dell'ossigeno (ROS) aumenta quando le cellule si avvicinano al limite di Hayflflick (Hutter et al. 2002). Il trattamento continuo di cellule con livelli subletali di ROS non solo aumenta il livello di prodotti del danno ossidativo come la lipofuscina (Sitte et al. 2001), ma provoca anche un arresto permanente della crescita accompagnato dall'attivazione del p53-inibitore della crescita percorso (Toussaint et al. 2000). Pertanto, a livello cellulare, i ROS svolgono un ruolo chiave nell'indurre la senescenza. Il colorante fluorescente FL DCFH-DA è stato utilizzato per misurare il contenuto di ROS con altri citometri. È stato dimostrato che rispetto al controllo, il contenuto di ROS era evidentemente diminuito nelle cellule incubate con echinacoside (Fig. 2A). Questi risultati lo indicanoechinacosidepotrebbe agire come un antiossidante, riducendo la produzione di ROS o accelerando la rimozione dei ROS.
Le specie reattive dell'ossigeno accumulate (ROS) causano il notevole deterioramento delle macromolecole nelle cellule, comprese le proteine, il DNA ei telomeri (Kovtun et al. 2007). I danni ossidativi al DNA innescano l'arresto della crescita G1 p53-dipendente, in seguito all'espressione di p21Waf-1/SDI-1/Cip1 (Chen et al. 1998) e alla senescenza cellulare nei fibroblasti umani normali. Abbiamo usato un test della cometa per misurare il danno al DNA e la sua riparazione. La dimensione dei frammenti di DNA e il numero di rotture determinano la migrazione e il modello della cometa vista. Il contenuto di DNA della coda (prodotto della lunghezza della coda e del contenuto di DNA della coda) aumenta con il danno. I nostri risultati mostrano che il pretrattamento con echinacoside può in parte promuovere la riparazione del danno al DNA, almeno proteggere le cellule dalle lesioni del DNA causate da H2O2 (Fig. 2B). Sulla base di questi fatti, concludiamo che l'echinacoside ha un'attività anti-senescenza almeno nelle cellule MRC-5. I risultati del nostro studio mostrano che l'echinacoside può ridurre l'accumulo di ROS, proteggere le cellule dai danni al DNA, promuovere le cellule MRC-5 dalla fase G1 alle fasi S e G2 e quindi migliorare la proliferazione delle cellule. In generale, gli effetti dell'echinacoside sulle cellule MRC-5 potrebbero essere suddivisi in due aspetti: promuovere la proliferazione cellulare e ridurre l'accumulo di ROS. Sebbene il meccanismo preciso della senescenza cellulare sia ancora sconosciuto e la rete di regolazione del ciclo cellulare rimanga controversa, abbiamo dimostrato che l'echinacoside può proteggere le cellule dal danno ossidativo. Pertanto, lo ipotizziamoechinacosidepotrebbe essere un buon candidato per regolare la senescenza, anche se il preciso meccanismo sottostante rimane una questione aperta e sono in corso ulteriori studi.
3. Sperimentale
3.1. Coltura cellulare e trattamento
La linea cellulare fibroblastica del polmone di embrione umano MRC{{0}} (Institute of Biochemistry and Cell Biology, SIBS, CAS) è stata mantenuta in terreno minimo essenziale modificato (Gibco/BRL) e integrata con il 10% di siero bovino fetale. Le cellule MRC-5 subiscono una senescenza replicativa dopo più passaggi cellulari, valutata dal rallentamento del metabolismo e dalla cessazione della divisione entro 7 giorni. Tutte le colture sono state seminate a una densità cellulare di 104/cm2 se non diversamente indicato e sono state lasciate proliferare, indisturbate, per 7 giorni. Varie concentrazioni di echinacoside sono state aggiunte 48 h prima dell'esame con solvente come controllo, salvo diversa indicazione. La concentrazione di DMSO nelle colture era inferiore allo 0,3 percento (v/v). Per il trattamento con H2O2, le cellule sono state indotte con H2O2 250 M per 12 ore.
3.2. Saggio del tasso di sopravvivenza
Le cellule sono state coltivate e trattate con echinacoside su piastre da 96 pozzetti. Prima del rilevamento, al terreno è stato aggiunto il 10 percento di Alamar BlueTM e incubato per 4 ore. L'assorbanza è stata misurata con uno spettrofotometro.
3.3. Analisi di citometria a flusso
La citometria a flusso è stata introdotta per misurare il contenuto di DNA e i livelli di ROS intracellulari utilizzando rispettivamente ioduro di propidio e DCFH-DA. Le cellule sono state piastrate a una densità di 105 cellule/10 ml di soluzione cellulare in piastre di 100 mm di diametro e integrate con echinacoside per 48 ore dopo la semina cellulare. Dopo 48 ore di trattamento, le cellule sono state raccolte e lavate in PBS dopo centrifugazione, quindi risospese in una soluzione di PBS con 0,1 percento di RNasi e 50 g/ml di ioduro di propidio o terreno di coltura contenente 10 M DCFH-DA per 30 minuti. Il contenuto di DNA o ROS è stato quindi determinato mediante smistamento cellulare attivato con fluorescenza FL su un sistema di citometria a flusso Beckman Coulter. I dati sono stati analizzati dal software MultiCycle.
3.4. Colorazione Hoechst
Le cellule sono state coltivate e trattate con echinacoside per 48 ore su una piastra da 96 pozzetti. Il mezzo è stato rimosso, le cellule sono state lavate con PBS, quindi fissate con formaldeide al 4% in PBS per 20 minuti, seguite da un lavaggio con PBS una volta e colorate con colorante Hoechst per 10 minuti. Le immagini sono state catturate.
3.5. Elettroforesi su gel unicellulare (test della cometa)
Il test della cometa è stato condotto come riportato (Olive and Banath 2006). Le singole immagini delle comete sono state analizzate con il software CometScore. Riconoscimento: questo lavoro è stato finanziato dal National Basic Research Program (973 Project) della Cina (n. 2007CB507406), dalla National Natural Science Foundation of China (n. 30572341) e dal Tsinghua-Yue-Yuen Medical Sciences Fund (THYY20070008 ).
