Effetto del carico nutrizionale di calcio e fosfato sulla cinetica delle particelle di calciproteine ​​negli adulti con funzionalità renale normale e compromessa

Astratto

Il plasma si avvicina alla metastabilità per quanto riguarda il suo contenuto di calcio e fosfato, con solo piccole perturbazioni nell'attività ionica necessarie per sostenere la crescita dei cristalli una volta nucleati. Fisiologicamente, il calcio e il fosfato vengono assorbiti in modo intermittente dalla dieta ogni giorno, tuttavia le concentrazioni plasmatiche di questi ioni si discostano minimamente dopo il pasto. Ciò implica l'esistenza di un sistema tampone minerale trasportato dal sangue per sequestrare i fosfati di calcio e ridurre al minimo il rischio di deposito nei tessuti molli. Le particelle di calciproteine ​​(CPP), colloidi endogeni di proteine ​​minerali contenenti la proteina plasmatica fetuina-A, possono svolgere questa funzione, ma mancano prove definitive che colleghino il carico minerale nella dieta con la loro formazione. Qui dimostriamo che la CPP si forma come una normale risposta fisiologica all'alimentazione negli adulti sani e che ciò si verifica nonostante il minimo cambiamento nei marcatori minerali sierici convenzionali. Inoltre, negli individui con malattia renale cronica (CKD), in cui la manipolazione dei minerali è compromessa, mostriamo che i livelli sia a digiuno che post-prandiali dei precursori della CPP sono marcatamente aumentati e fortemente inversamente correlati con la funzione renale. Questo studio evidenzia l'importante, ma spesso trascurato, contributo della biochimica colloidale all'omeostasi minerale e fornisce nuove informazioni sulla disregolazione del metabolismo minerale nella malattia renale cronica.

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introduzione

Il calcio e il fosfato formano sali altamente insolubili in soluzione acquosa e mentre il metabolismo in tutti gli organismi viventi dipende da questi nutrienti essenziali, la loro coesistenza nei fluidi biologici crea un rischio intrinseco di mineralizzazione e la necessità di una stretta regolamentazione1. La maggior parte dei fluidi extracellulari come il plasma, sono considerati metastabili o prossimi alla metastabilità per quanto riguarda le loro attività ioniche di calcio e fosfato2, sostenendo prontamente la crescita dei cristalli se nucleati. Questa tendenza alla precipitazione di calcio e fosfato è stata sfruttata dai vertebrati per le loro proprietà biomeccaniche uniche durante l'evoluzione dei tessuti scheletrici e dentali. Tuttavia, allo stesso tempo, questo ha richiesto meccanismi di rapida mobilizzazione e trasporto efficiente di massa dei precursori minerali per soddisfare le esigenze di crescita e riparazione di questi tessuti duri, nonché strategie per limitare la mineralizzazione a questi siti e prevenire la calcificazione indesiderata nei tessuti molli3 . Infatti, anche modesti aumenti delle concentrazioni plasmatiche di calcio e fosfato sono associati ad un aumentato rischio di calcificazione patologica delle arterie e dei tessuti4. Poiché l'eccesso di calcio e fosfato viene escreto quasi esclusivamente dal rene, questo rischio, insieme alle sequele cardiovascolari associate, è sostanzialmente più elevato nei soggetti con malattia renale cronica (CKD), in cui i disturbi del metabolismo minerale diventano evidenti con diminuzioni relativamente piccole della filtrazione glomerulare tasso (GFR)5,6. Data l'abbondanza di calcio e fosfato nella dieta a cui i mammiferi sono esposti in modo intermittente, si potrebbe sospettare che il rischio di mineralizzazione ectopica sia più alto dopo un pasto a causa del previsto aumento di ioni minerali assorbiti dall'intestino. Tuttavia, contrariamente a questa aspettativa, le concentrazioni plasmatiche di calcio e fosfato cambiano minimamente nel periodo post-prandiale e mentre l'aumento dell'escrezione urinaria aiuta a mantenere l'omeostasi7, questa risposta non è istantanea e ritarda di alcune ore dopo l'ingestione di quantità millimolari di calcio e fosfato8. Come soluzione a questa sfida fisiologica, è stato a lungo sospettato un sistema ematico per tamponare e trasportare i minerali9, e recentemente l'attenzione si è rivolta ai complessi minerale-proteici colloidali che potrebbero svolgere questa funzione e accompagnare in sicurezza il flusso intermittente di minerali attraverso il sistema extracellulare fluidi nei siti di utilizzo o smaltimento10.

Nel plasma, il più potente e abbondante regolatore della mineralizzazione proteica è la glicoproteina fetuina-A11, derivata dal fegato, che interagisce con i nascenti complessi minerale-proteici colloidali per formare particelle di calciproteine ​​(CPP)12,13. Analogamente a come le apolipoproteine ​​solubilizzano il loro carico lipidico per il trasporto, fetuinA stabilizza i fosfati di calcio scarsamente solubili, prevenendo la crescita dei cristalli e la precipitazione, facilitando al contempo il loro assorbimento nei tessuti per l'utilizzo o la clearance14-16. L'incapacità di produrre o stabilizzare sufficientemente la CPP, come osservato nei topi knockout fetuina-A, si traduce in uno dei più gravi fenotipi di calcificazione ectopica conosciuti17, in cui i complessi contenenti minerali precipitano direttamente nel lume della microvascolarizzazione portando a occlusione, ischemia, necrosi e fbrosi18. Il CPP viene generato attraverso una serie di passaggi ordinati, inizialmente con il legame di cluster formati spontaneamente di ioni calcio e fosfato alla fetuina-A, formando monomeri calciproteici (CPM)19, che poi fungono da elementi costitutivi per strutture polimeriche più grandi; prima, coalescente per formare CPP primario sferico (CPP-I) contenente fosfato di calcio amorfo, prima di trasformarsi in CPP secondario ellissoidale più grande e più denso (CPP-II) contenente idrossiapatite cristallina12.

Al di là del presunto ruolo fisiologico della formazione di CPP nel sequestrare e disperdere i minerali in eccesso, si osservano livelli elevati anche negli stati di metabolismo minerale alterato, incluso nella CKD20. In questo contesto, livelli sierici più elevati di CPM e CPP sono stati collegati a un aumento del rischio di eventi cardiovascolari21-25 e mortalità22. Studi preclinici suggeriscono che il CPP può indurre direttamente la calcificazione delle cellule muscolari lisce vascolari26,27, l'attivazione delle vie infiammatorie cellulari e citotossiche28,29, nonché lesioni vascolari luminali ed endoteliali30. Nel complesso, è stato proposto che l'esposizione prolungata a livelli cronicamente elevati di CPP sierica possa aiutare a spiegare i collegamenti tra l'eccesso di minerali nella dieta e gli esiti negativi dei pazienti affetti da CKD14,31. Curiosamente, dati recenti suggeriscono anche che il CPM circolante è filtrato a livello del glomerulo29, il che implica che l'insufficienza renale può influenzare il metabolismo del CPP attraverso molteplici meccanismi.

I recenti progressi metodologici consentono la quantificazione diretta di CPM32, CPP-I e CPP-II33, con questi test ora applicati in diversi studi clinici osservazionali e interventistici24,25,34-39. Un altro nuovo metodo complementare per valutare questo sistema è il test T50, una valutazione funzionale della capacità del siero di resistere alla formazione ex vivo di CPP-II quando stimolato con quantità sovrasaturanti di calcio e fosfato40. Un T50 più basso è stato coerentemente associato ad un aumentato rischio di patologia vascolare e mortalità in soggetti con funzionalità renale normale41, così come in varie coorti di CKD, incluse sia CKD non dialisi22,42,43 che anche dipendenti dalla dialisi44. Oltre alla cinetica della formazione di CPP-II, è possibile misurare anche la dimensione (raggio idrodinamico) delle molecole di CPP-II generate nel test T5040,45 e può fornire ulteriori informazioni prognostiche sul rischio vascolare46,47.

La nozione di un'origine alimentare della CPP è fortemente supportata dall'osservazione che l'alimentazione ad alto contenuto di fosfato è associata ad un aumento dei livelli ambientali di CPM48 e CPP33 negli studi sugli animali e alla riduzione della CPM34 e CPP37 sierica nei pazienti in emodialisi trattati con chelanti del fosfato intestinale. Tuttavia, manca un'osservazione definitiva dell'effetto dell'assunzione di minerali nutrizionali sulla cinetica acuta della CPP negli esseri umani. Inoltre, l'impatto della CKD sul metabolismo post-prandiale della CPP deve ancora essere documentato. Per colmare queste lacune di evidenza chiave, abbiamo condotto uno studio controllato sull'effetto dell'assunzione di cibo standardizzato sulla dimensione sierica di CPM, CPP-I, CPP-II, T50 e CPP-II, in adulti a digiuno con funzionalità renale normale o compromessa.

Estratto di cistanche

Metodologia

1. Studiare la popolazione.

Abbiamo studiato 14 individui con CKD e 16 controlli sani abbinati per età e sesso. Ogni partecipante doveva avere almeno 18 anni per essere idoneo. I partecipanti sono stati esclusi se: (i) avevano una storia di malattia minerale o ossea, diversa da quella correlata alla malattia renale cronica; (ii) erano in trattamento con un chelante del fosfato intestinale o calcitriolo; o (iii) aveva un disturbo gastrointestinale, una storia di intolleranza al lattosio o non era disposto a consumare il pasto dello studio. Per il gruppo CKD, abbiamo reclutato sette individui con un tasso di filtrazione glomerulare stimato (eGFR) compreso tra 30 e 60 ml/min/1,73 m2 e sette con un eGFR<30 mL/min/1.73 m2, excluding participants who required dialysis or with a previous kidney transplant. Healthy controls had no history of chronic medical conditions and had normal kidney function (eGFR>60 ml/min/1,73 m2). Lo studio è stato condotto dalla Dichiarazione di Helsinki.

Tutti gli individui hanno fornito il consenso informato scritto e lo studio è stato approvato dal comitato etico locale (Melbourne Health Human Research Ethics Committee MH2018.363).

2. Procedura.

Ogni partecipante è stato studiato dopo un digiuno notturno e la raccolta dei campioni è iniziata tra le 7:30 e le 9:30. Una cannula endovenosa è stata inserita all'inizio del periodo di studio. Prima della raccolta di ciascun campione di sangue, è stato scartato un prelievo iniziale di 5 mL dalla cannula. Due campioni di sangue a digiuno iniziali sono stati prelevati a 30 minuti di distanza per tenere conto della variazione di base. I valori medi di questi due punti temporali sono stati usati come "tempo 0". Immediatamente dopo la raccolta del secondo campione a digiuno, i partecipanti hanno consumato un pasto standardizzato (colazione liquida Sanitarium Up&Go; 250 ml, gusto vaniglia) contenente 815 kJ di energia, 300 mg di calcio e 188 mg di fosfato (Tabella 1). I partecipanti sono stati istruiti a consumare l'intera bevanda entro 5 minuti. Campioni di sangue seriali sono stati raccolti in cinque punti temporali post-prandiali (30, 60, 120, 180 e 240 min) dall'inizio del pasto. Durante il periodo di studio, ai partecipanti è stato permesso di bere acqua ma non è stato loro permesso di consumare altri cibi o bevande.

3. Misure di risultato.

Il sangue è stato raccolto per la misurazione ripetuta di nuovi marcatori del metabolismo minerale (dimensione CPM, CPP-I, CPP-II, T5 0 e CPP-II) in ogni momento. La fetuina-A è stata misurata in ogni punto temporale, dato il suo ruolo di principale proteina legante i minerali presente in CPM e CPP. Abbiamo anche misurato il fosfato sierico, il calcio totale, il magnesio, l'albumina e il bicarbonato in ciascun punto temporale e l'ormone paratiroideo (PTH) intatto nel siero e il fattore di crescita dei fibroblasti intatto-23 (iFGF23) in tre punti temporali ({{12 }}, 120 e 240 minuti). Il citrato sierico è stato misurato a 0, 30 e 60 min. L'urea sierica, la creatinina e la 1,25 diidrossi vitamina D sono state misurate una volta al basale a digiuno (0 min). Campioni di sangue per nuovi marcatori del metabolismo minerale, PTH, iFGF23, 1,25 diidrossi vitamina D e citrato sierico, sono stati lasciati coagulare per 30 minuti prima della centrifugazione, quindi le aliquote di siero sono state conservate a -80 gradi fino all'analisi del lotto. Tutte le altre misurazioni biochimiche sono state eseguite al momento della raccolta del campione utilizzando metodi di laboratorio standard.

4. Saggi citometrici di filtrazione su gel e flusso per CPM e CPP.

Abbiamo utilizzato due test complementari per quantificare diverse frazioni del pool di CPP circolante49. Entrambi i test utilizzano il derivato bifosfonato marcato con fluorescenza, OsteoSense 680EX (Perkin Elmer), che si lega specificamente al fosfato di calcio in fase solida e preferenzialmente alle fasi cristalline (ad es. idrossiapatite). Il metodo della 'filtrazione su gel' di Miura et al.32 è stato utilizzato per misurare piccoli (<50 nm diameter), low-density mineral-laden fetuin-A colloids. Briefly, frozen serum samples were thawed for 24 h at 25 °C to induce aggregation of CPM and phase transition to crystalline calcium phosphate. Samples were then centrifuged for 30,000g for 2 h at 4 °C to remove larger CPP-I and CPP-II, leaving less dense crystal-laden fetuin-A monomer and multimers for staining with OsteoSense (0.5 µM) in HEPES-buffered DMEM (pH 8.0). Unbound dye was subsequently removed by gel filtration (Micro Bio-Spin® Columns with Bio-Gel® P-30, Bio-Rad) and the resultant fluorescence was measured using an infrared scanner (Odyssey CLx, LI-COR; EX 685 nm, EM 700 nm). Miura and colleagues32 referred to the mineral detected as low-density (L)-CPP, however, here we refer to them as CPM to reflect the origin of this mineral fraction in vivo. In our hands, the mean interassay analytical coefficient of variation (CVA) for the CPM assay was 4.9%.

Per l'analisi citofluorimetrica, aliquote di siero congelato sono state processate utilizzando le procedure standardizzate descritte in precedenza50. CPP-I e CPP-II sono stati misurati come descritto in precedenza utilizzando un'impostazione del citometro a flusso BD FACSVerse per risolvere le particelle<200 nm from the background and operate with fluorescence triggering on OsteoSense-positive events33,37. In this assay, CPP is distinguished from membrane-delimited mineral-containing extracellular vesicles using phosphatidyl serine–binding cadherin-FITC (Haematologic Technologies Inc., Essex Junction, VT). CPP-I and CPP-II were distinguished by differences in side scatter (SSC) intensity (related to particle size) and OsteoSense fluorescence intensity. Interassay CVA for CPP-I and CPP-II were<15% and<10%, respectively.

5. Altri marcatori minerali.

Il siero T50 è stato misurato da Calciscon AG, Biel, Svizzera, come precedentemente descritto utilizzando un nefelometro Nephelostar (BMG Labtech, Ortenberg, Germania)40. Il CVA interdosaggio medio per T50 è stato del 3,4%. Il raggio idrodinamico del CPP-II è stato misurato mediante diffusione dinamica della luce utilizzando un DynaPro Plate Reader II (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, USA) come descritto da Chen et al. I test immunologici commerciali sono stati utilizzati per misurare iFGF23 (Kainos Laboratories, Tokyo, Giappone), 1,25 diidrossi vitamina D Immunodiagnostic Systems, Boldon, Regno Unito) e fetuina-A (R&D Systems, Minneapolis, USA) secondo le istruzioni del produttore. Il CVA interdosaggio medio era rispettivamente del 3,8%, 5,5% e 3,2%. Il citrato sierico è stato misurato utilizzando un test colorimetrico (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania) con un CVA interdosaggio medio del 3,5%.

6. Analisi statistica.

Using GLIMPSE, a validated linear mixed model power and sample size calculator51, we estimated that 10 participants would provide>Potenza del 90 percento per rilevare un raddoppio del CPP nel periodo post-prandiale con un tasso di errore di tipo I di 0,05. Lo studio non è stato dimensionato per rilevare una differenza tra i gruppi.

I dati demografici e biochimici a digiuno sono stati confrontati tra i gruppi utilizzando un test t non accoppiato o un test Kruskal-Wallis rispettivamente per variabili continue normali e asimmetriche e un test chi-quadrato per variabili categoriche.

Abbiamo mirato a descrivere la risposta post-prandiale all'interno e tra i gruppi per ciascun parametro ripetuto. Per fare ciò, abbiamo adattato modelli lineari a effetti misti (LMM) per ciascun parametro, utilizzando un approccio di massima verosimiglianza ristretta e con una matrice di covarianza non strutturata52. Per ogni LMM abbiamo modellato il gruppo, il tempo categorico e l'interazione gruppo per tempo come effetti fissi, ed è stata inclusa un'intercettazione casuale per ciascun partecipante per tenere conto della correlazione delle misure ripetute. Il gruppo di controllo e l'ora '0' sono stati usati rispettivamente come valori di riferimento per il gruppo e l'ora. Le stime dei coefficienti per i termini di interazione gruppo per tempo sono state utilizzate per testare le differenze nella risposta post-prandiale tra i gruppi di CKD e di controllo. Dopo aver adattato ogni LMM, abbiamo anche eseguito confronti a coppie post hoc per testare le differenze nei valori medi tra i gruppi in ogni punto temporale e per testare la deviazione dalla linea di base a digiuno all'interno di ciascun gruppo. Per questi confronti a coppie, abbiamo utilizzato il metodo di correzione di Bonferroni per regolare i confronti multipli. Le dimensioni di CPM, CPP-I, CPP-II, CPP-II, PTH e iFGF23 sono state naturalmente trasformate in log prima di adattare gli LMM per garantire la normale distribuzione dei residui. Per facilità di interpretazione, le stime dei coefficienti per i termini di interazione da questi modelli sono state quindi elevate a potenza per derivare le stime della variazione percentuale. Per il LMM di CPM, i termini di interazione gruppo per tempo hanno suggerito una differenza significativa nella risposta post-prandiale tra i gruppi. Per esplorare ulteriormente l'effetto della funzione renale sui livelli post-prandiali di CPM abbiamo anche calcolato l'area sotto la curva (AUC) per CPM utilizzando il metodo spline cubico (tempo 0 a 240 min) ed esaminato la relazione tra eGFR , AUC e concentrazione massima di CPM (utilizzando la correlazione per ranghi di Spearman) nonché tra CKD e tempo di concentrazione massima di CPM (utilizzando il test del chi quadrato).

Diversi campioni presentavano livelli non rilevabili di CPP-I (2 campioni nel gruppo di controllo e 6 nel gruppo CKD) o CPP-II (5 nel gruppo di controllo e 10 nel gruppo CKD). Per le analisi principali, è stato utilizzato il limite inferiore di quantificazione per il dosaggio (133 particelle/mL) per questi valori censurati con lef. Per valutare la potenziale distorsione da questo approccio, abbiamo eseguito un'analisi di sensibilità in cui gli LMM per CPP-I e CPP-II sono stati riadattati dopo aver imputato i valori lefcensored utilizzando la regressione Tobit multilivello, in cui il tempo e il gruppo sono stati inseriti come variabili indipendenti 53.

Valori p a due code<0.05 were considered significant. All data were analyzed using Stata MP version 17.0 (StataCorp, College Station, USA) and figures were produced using GraphPad Prism version 9.2.0 (GraphPad Sofware, San Diego, USA).

Herba Cistanche

Discussione

Per quanto ne sappiamo, questo è il primo studio a segnalare un significativo effetto post-prandiale dell'assunzione nutrizionale sui livelli sierici di CPM, CPP-I e CPP-II negli esseri umani. Questi effetti erano comuni a soggetti con funzionalità renale normale e compromessa; tuttavia, l'escursione post-prandiale della CPM sierica era molto più pronunciata nei partecipanti con CKD. Abbiamo anche riscontrato un effetto post-prandiale precoce e transitorio sul T50, che era presente indipendentemente dalla funzionalità renale e accompagnato da un concomitante aumento della fetuina-A sierica.

I nostri risultati sono coerenti con l'idea che l'assorbimento intestinale di un carico minerale dietetico può portare direttamente alla formazione di CPM circolante, CPP-I e CPP-II. Ciò è stato proposto in precedenza10,15,16 ma si basa in gran parte su dati animali33,48. Al contrario, le prove nell'uomo sono state indirette, provenienti da studi sui chelanti del fosfato intestinale in pazienti con CKD dipendenti dall'emodialisi34,37,55. Un piccolo studio di Yamada et al. suggerito variazione diurna nella CPP sierica con picchi post-prandiali, tuttavia, questo studio ha utilizzato una tecnica di analisi più vecchia che non era in grado di quantificare separatamente le sottospecie CPM e CPP e i partecipanti sono stati tutti ospedalizzati per la gestione del diabete instabile56. Al contrario, tutti i partecipanti a questo studio erano clinicamente stabili e, per quanto ne sappiamo, per la prima volta abbiamo dimostrato che le escursioni post-prandiali si osservano non solo negli individui con CKD ma anche negli adulti sani, confermando il ruolo della formazione di CPM e CPP nella normale risposta fisiologica all'ingestione di cibo.

Sono stati osservati picchi di CPM e CPP sierici anche dopo carichi minerali nutrizionali relativamente modesti e fisiologicamente rilevanti (Tabella 1). Al contrario, c'era una variazione post-prandiale minima nei marcatori più convenzionali del metabolismo minerale. Allo stesso modo, studi precedenti hanno mostrato una deviazione post-prandiale limitata nel fosfato7,57, tranne quando i soggetti sono sottoposti a grandi carichi farmacologici58,59. In condizioni di salute, il fosfato corporeo totale è regolato, in modo tale che l'assorbimento intestinale netto corrisponda all'escrezione urinaria8. Tuttavia, questa risposta non è istantanea e si può osservare un ritardo di diverse ore prima che si verifichi un aumento dell'escrezione urinaria di fosfato, anche quando il carico di fosfato viene somministrato per via endovenosa8. Invece, i modelli animali hanno dimostrato che altri meccanismi, non renali, servono a mantenere le concentrazioni ioniche sieriche in modo più acuto, attraverso la distribuzione alle ossa e ad altri tessuti59-61. È plausibile che la formazione di CPM e CPP possa essere un importante deposito temporaneo aggiuntivo di fosfato (e calcio), che può tamponare in modo acuto i carichi minerali locali, ad esempio dal sistema gastrointestinale14. Le proprietà fisico-chimiche di CPM e CPP indicano che nella circolazione possono esistere quantità potenzialmente grandi di minerali altrimenti insolubili senza rischio di precipitazione, il che apparentemente facilita il trasporto sicuro dei minerali alla rinfusa verso i siti di utilizzo o di smantellamento.

Abbiamo osservato un aumento transitorio della fetuina-A sierica nel gruppo CKD. Al contrario, fetuin-A è apparso stabile nei controlli, tuttavia, quando i confronti a coppie sono stati ripetuti senza correzione per confronti multipli, si sono verificati aumenti significativi a 30 e 60 minuti nei controlli (Tabella supplementare S8), indicando che potremmo essere stati sottodimensionati per rilevare un effetto di fondo. Oltre ad essere un reagente di fase acuta negativo, con livelli fortemente soppressi in risposta a infiammazioni acute e croniche62, si sa poco di altri meccanismi che regolano direttamente la sintesi epatica e la secrezione di fetuina-A, e vi è una scarsità di dati precedenti sull'attività diurna, o acuta variazione post-prandiale in qualsiasi specie. Dato l'aumento osservato della fetuina-A sierica dopo l'alimentazione, specialmente nel gruppo CKD, e il ruolo richiesto della fetuina-A nella formazione di CPM e CPP, è interessante considerare se l'alimentazione possa essere "rilevata" attraverso un meccanismo ancora sconosciuto, portando al rilascio epatico di fetuinA in concomitanza con un afflusso di minerali dall'intestino. Infatti, Uedono et al. recentemente ha suggerito che il CPP stesso potrebbe essere un fattore scatenante per l'espressione della fetuina-A negli epatociti in coltura63. Pertanto, i meccanismi che controllano il rilascio di fetuina-A e la loro risposta al carico di minerali richiedono ulteriori indagini.

T50 è una valutazione funzionale della capacità del siero di resistere alla formazione ex vivo di CPP-II, che rappresenta un insieme di vari fattori di calcificazione potenzianti (tra cui calcio e fosfato) e inibenti (tra cui fetuina-A, albumina, magnesio, citrato e bicarbonato)40. Abbiamo osservato un aumento precoce ma transitorio di T50. Ciò è stato osservato in entrambi i gruppi, ma nel gruppo CKD il picco coincideva con l'aumento della fetuina-A sierica. Inoltre, tra tutti i partecipanti, la variazione di T50 rispetto al basale era strettamente correlata alla variazione della fetuina-A sierica (Figura complementare S2), suggerendo che la fetuina-A potrebbe essere il fattore principale alla base dei cambiamenti osservati nella T50. In effetti, non abbiamo trovato corrispondenti cambiamenti precoci postprandiali in altri modulatori noti di T50 (fosfato sierico, calcio, bicarbonato, magnesio o albumina), sebbene ciò non escluda cambiamenti più sottili in uno o in una combinazione di questi fattori . Ad esempio, era presente un'interazione gruppo-tempo positiva per il bicarbonato sierico nel gruppo CKD a 120 minuti, che si sovrapponeva all'aumento del T50. Per quanto riguarda fetuin-A, c'era anche una correlazione tra la variazione di bicarbonato e T50 rispetto al basale (Figura complementare S4), sebbene questa fosse relativamente debole rispetto alla correlazione con la prima (r=0.385 vs. r=0.839). Tuttavia, la "marea alcalina" post-prandiale è un fenomeno riconosciuto ed è plausibile che molteplici fattori abbiano contribuito ai cambiamenti post-prandiali osservati in T5064. Il pasto dello studio conteneva anche una quantità sorprendente di citrato (~16 mM), un noto potente inibitore della formazione di CPP, tuttavia, sebbene vi fosse un piccolo aumento del citrato sierico nel gruppo CKD, questo cambiamento non coincideva con i cambiamenti osservati in T50, né vi era alcuna correlazione complessiva tra la variazione di T50 e il citrato sierico in entrambi i gruppi. Altri modulatori precedentemente descritti di T50, come pirofosfato e zinco, non sono stati misurati in questo studio. Sebbene questi, o altri fattori ancora sconosciuti, possano anche aver contribuito all'aumento post-prandiale osservato di T50, notiamo che sono generalmente necessari cambiamenti piuttosto sostanziali nella concentrazione di queste piccole molecole inorganiche per avere un impatto significativo su T5065. In contrasto con gli effetti post-prandiali su T50, il raggio idrodinamico di CPP-II è rimasto apparentemente invariato in entrambi i gruppi.

Capsule di cistanche

Mentre in entrambi i gruppi sono state osservate escursioni post-prandiali di CPM, i livelli di CPM erano costantemente più alti nel gruppo CKD in ciascuno dei punti temporali e i termini di interazione gruppo per tempo hanno indicato che l'entità della risposta post-prandiale era significativamente maggiore nei partecipanti CKD rispetto ai controlli. Di conseguenza, nell'analisi esplorativa, c'era una forte correlazione tra eGFR e CPM AUC e concentrazione massima. Anche i livelli di picco di CPM tendevano a verificarsi più tardi nel gruppo CKD. Teoricamente, queste differenze potrebbero indicare un aumento della produzione di CPM dopo l'assunzione nutrizionale e/o una ridotta capacità di eliminare il CPM in quelli con CKD. Quest'ultimo è supportato da dati recenti di Koeppert et al., che hanno utilizzato la microscopia a due fotoni dal vivo per dimostrare che il CPM circolante è prevalentemente eliminato dalla filtrazione glomerulare nei topi29. Una previsione ragionevole, quindi, potrebbe essere che la capacità di cancellare il CPM si riduca con il diminuire del GFR. Tuttavia, le alterazioni in altri aspetti dell'omeostasi minerale, incluso il turnover osseo66 e l'escrezione renale ritardata di carichi acuti di fosfato7,59 sono anche comunemente osservate nella CKD e potrebbero aver contribuito all'aumento dei livelli post-prandiali. Prove recenti hanno messo in dubbio l'idea di lunga data che la CKD influisca sull'assorbimento intestinale netto di fosfato57,67,68. Abbiamo tuttavia notato che sei dei 14 individui nel gruppo CKD stavano assumendo colecalciferolo. Considerando il potenziale per gli effetti stimolatori della vitamina D sull'assorbimento minerale intestinale, abbiamo eseguito un'analisi esplorativa ad hoc per verificare se l'uso della vitamina D nutrizionale ha influito sulla risposta acuta di CPM, CPP-I e CPP-II all'alimentazione (Tabelle supplementari S9–S11). A parte una singola interazione positiva gruppo per tempo per CPP-I a 30 minuti in coloro che assumevano colecalciferolo, tutti gli altri termini di interazione e i confronti a coppie post hoc per CPM, CPP-I e CPP-II non erano significativi, suggerendo che il colecalciferolo era improbabile che l'uso avesse avuto un effetto sostanziale sulla cinetica CPM/CPP post-prandiale. Mentre la piccola dimensione del campione e il potenziale di confusione possono precludere conclusioni definitive, la mancanza di effetto può anche riflettere la predominanza dell'assorbimento del fosfato attraverso la via paracellulare quando il minerale è abbondante, che non è regolato attivamente dall'asse della vitamina D69.

Contrariamente al CPM, non abbiamo osservato un forte effetto sulla funzione renale né nel CPP-I né nel CPP-II. A differenza del CPM, il CPP circolante viene principalmente eliminato dalla circolazione da meccanismi non renali. Modelli animali e in vitro hanno suggerito una rapida clearance del CPP-I prevalentemente da parte delle cellule endoteliali sinusoidali del fegato28, e del CPP-II da parte dei macrofagi residenti del fegato e della milza70. È plausibile che mentre i partecipanti al nostro gruppo CKD mostrassero prove di alterato metabolismo del CPM, questi discreti percorsi di clearance del CPP fossero sufficienti per mantenere i normali profili del CPP post-prandiale. Avevamo previsto che il gruppo CKD avrebbe avuto livelli di CPP nettamente più elevati rispetto ai controlli basati su studi precedenti, sebbene questi studi arruolassero pazienti con CKD più avanzato che erano dipendenti dalla dialisi33 o utilizzassero il metodo più vecchio e indiretto di misurazione della CPP20,23. Gli individui con CKD più avanzato rispetto a quelli studiati qui possono mostrare maggiori differenze nei livelli di CPP a digiuno e post-prandiale. La mancanza di separazione per CPP tra la nostra CKD e il gruppo di controllo può anche essere dovuta al nostro numero limitato di partecipanti, che ha anche limitato la nostra capacità di testare formalmente un effetto dello stadio CKD (Figura complementare S6). In effetti, il nostro studio era basato sull'esame delle risposte post-prandiali piuttosto che sulle differenze tra i gruppi. Da notare che il CPP-I sembrava tornare ai livelli di digiuno prima nei controlli rispetto ai partecipanti con CKD, e c'era un'interazione positiva gruppo per tempo per CPP-II nei partecipanti con CKD a 120 min. Entrambi i risultati indicano potenzialmente che potremmo aver osservato effetti tra i gruppi più pronunciati in una coorte più ampia. Anche una maggiore imprecisione analitica per le misurazioni CPP basate sulla citometria a flusso potrebbe aver contribuito ai risultati nulli.

Oltre a fornire nuove informazioni sulla fisiologia del metabolismo CPM e CPP, il nostro studio ha anche una rilevanza diretta per l'ottimizzazione dell'uso di questi nuovi marcatori del metabolismo minerale in studi futuri. Mentre ciascuno di questi nuovi test ha mostrato risultati promettenti nei primi lavori clinici, pochissimi studi hanno riportato43 o controllato lo stato di digiuno/assorbimento46,56. In questo studio, diversi individui avevano livelli non rilevabili di CPP-I o CPP-II nel digiuno e nel primo periodo post-prandiale, e questo profondo effetto del digiuno sulla CPP sierica è di per sé un finanziamento notevole e precedentemente non riportato. Al contrario, i livelli di CPM a digiuno erano misurabili e significativamente più alti nel gruppo CKD rispetto ai controlli, il che suggerisce che aumenti sostenuti di CPM potrebbero non manifestarsi necessariamente in livelli elevati di CPP in quelli con CKD non dipendente dalla dialisi.

Precedenti studi epidemiologici hanno suggerito collegamenti tra livelli elevati di CPM e CPP con una serie di marcatori surrogati di malattie vascolari21,23,24, nonché con eventi cardiovascolari25 e mortalità per tutte le cause22. Inoltre, studi di laboratorio hanno fornito meccanismi plausibili attraverso i quali la CPP può mediare questi esiti vascolari patologici26-28. Tuttavia, mentre gli studi in vitro hanno suggerito che molte di queste tossicità sono indotte in modo dose-dipendente se il CPP ha un normale ruolo fisiologico nella salute, allora non è chiaro a che punto queste particelle possano diventare dannose. La conoscenza dell'effetto dell'assunzione nutrizionale sulla cinetica del CPP, come rivelato qui, può rivelarsi cruciale per comprendere ulteriormente questo processo. Una concentrazione soglia per l'insorgenza di effetti patologici di CPM e CPP può (almeno inizialmente) essere raggiunta solo nello stato post-prandiale in vivo. In tal caso, i test dinamici della risposta postprandiale possono fornire ulteriori opportunità per valutare le manifestazioni precedenti del metabolismo minerale disregolato, nonché il rischio di malattia vascolare associata. Un'altra importante possibilità è che la composizione e quindi la tossicità intrinseca di CPP-I e CPP-II differisca tra salute e CKD45.

Supplemento cistanche

Limitazioni

Riconosciamo che questo studio ha diverse limitazioni, incluso un numero limitato di pazienti, come già discusso. In particolare, abbiamo utilizzato anche un pasto standardizzato somministrato dopo un digiuno notturno, quindi non possiamo commentare l'effetto della variazione della composizione del pasto o l'effetto dei pasti successivi somministrati durante il resto della giornata. Abbiamo scelto il pasto in base alla sua disponibilità commerciale, consentendo la standardizzazione tra i partecipanti, e perché rappresentava carichi nutrizionali fisiologicamente rilevanti (Tabella 1). È tuttavia possibile che se i partecipanti fossero stati sfidati con carichi minerali maggiori, sarebbe stata evidente un'ulteriore separazione tra quelli con funzionalità renale normale e compromessa. Allo stesso modo, dato che abbiamo osservato individui solo per quattro ore dopo il pasto, è concepibile che l'effetto cumulativo dei pasti successivi possa aver distinto ulteriormente anche i gruppi.

Non abbiamo recuperato feci o urina e quindi non possiamo commentare i minerali totali assorbiti o escreti durante lo studio. Partiamo dal presupposto che i cambiamenti in ciascuna misura osservati dopo l'alimentazione siano direttamente correlati all'apporto nutrizionale. Questa ipotesi è supportata indirettamente da studi di imaging dettagliati che mostrano fux di ioni calcio e fosfato in seguito all'assunzione di cibo57, nonché prove dirette da studi su animali che dimostrano che l'ingrasso orale acuto di topi con una soluzione tamponata di fosfato provoca picchi sierici di CPM/CPP48. Tuttavia, non abbiamo osservato i partecipanti in condizioni di digiuno prolungato e quindi non possiamo spiegare in modo definitivo le fluttuazioni diurne non correlate alla dieta in nessuno dei parametri studiati. Tuttavia, avevamo due campioni di digiuno, la cui media è stata utilizzata come "tempo 0" e la variabilità tra questi campioni di digiuno era banale rispetto all'entità dei cambiamenti osservati nel periodo post-prandiale.

Abbiamo utilizzato il metodo Bonferroni per tenere conto dei molteplici confronti a coppie post hoc tra e all'interno dei gruppi per ciascun parametro. Questo è senza dubbio un approccio conservativo e, a nostra conoscenza, non adottato da nessun altro studio simile sull'alimentazione del metabolismo minerale post-prandiale. Abbiamo scelto questo approccio dato l'elevato numero di punti temporali e di confronti effettuati e abbiamo ritenuto che fosse preferibile concentrarsi sui segnali più robusti e significativi. Tuttavia, di conseguenza, potremmo aver perso effetti minori, ma potenzialmente rilevanti. Non abbiamo corretto per test multipli su diversi parametri minerali data la probabilità di cambiamenti interdipendenti fisiologicamente collegati.

Cistanche tubulosa

Conclusione

Il nostro studio ha rivelato per la prima volta che l'assunzione nutrizionale di minerali porta alla formazione di CPM e CPP nel sangue come normale risposta fisiologica all'alimentazione. Questi risultati corroborano l'ipotesi che la formazione di CPM/CPP aiuti a costruire i carichi minerali post-prandiali, funzionando come riserva circolante temporanea di fosfati di calcio sfusi destinati in ultima analisi all'utilizzo/stoccaggio (p. es., un precursore minerale per la mineralizzazione ossea) o all'eliminazione. Abbiamo anche osservato livelli più elevati a digiuno di CPM sierico e una risposta post-prandiale più ampia in quelli con funzionalità renale compromessa, suggerendo che il metabolismo CPM è manifestamente alterato nella CKD. L'analisi della gestione post-prandiale di CPM/CPP può fornire nuove informazioni sui meccanismi che collegano l'eccessiva assunzione dietetica di calcio e fosfato all'aumento del rischio di malattie cardiovascolari nei pazienti con alterata escrezione di minerali. Più in generale, queste nuove scoperte sottolineano l'importante, ma spesso trascurato, contributo della biochimica colloidale all'omeostasi minerale.

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2 Dipartimento di Medicina (RMH), Università di Melbourne, Parkville, Australia.

3 Calciscon AG, Bienne, Svizzera.

4 Lindenhofspital Bern, Berna, Svizzera.

5 Dipartimento di Fisiologia e Fisiopatologia, Università Johannes Kepler, Linz, Austria.