Effetto della terapia protonica sull'uccisione delle cellule tumorali e sul microambiente immunitario per il carcinoma epatocellulare

Astratto: La radioterapia con terapia protonica (PT) presenta vantaggi dosimetrici rispetto alla terapia fotonica, che aiuta ad ampliare la finestra terapeutica della radioterapia per il carcinoma epatocellulare (HCC). Abbiamo valutato la risposta dell'HCC al PT ed esaminato i meccanismi sottostanti. Le linee cellulari di cancro al fegato umano HepG2 e HuH7 e la linea cellulare di cancro al fegato murino Hepa1–6 sono state selezionate per esperimenti su cellule e animali per esaminare la risposta indotta dall'irradiazione PT. Sono stati esaminati i cambiamenti biologici e la risposta immunologica dopo l'irradiazione PT. Gli esperimenti in vitro non hanno mostrato differenze significative nella sopravvivenza cellulare dopo PT rispetto alla radioterapia con fotoni. In un modello di tumore murino, i tumori erano di dimensioni più piccole 12 giorni dopo l'irradiazione PT. I cambiamenti sottostanti includevano un aumento del danno al DNA, livelli di IL-6 sovraregolati e un microambiente tumorale immunitario regolato. L'analisi delle proteine ​​in vitro e in vivo ha mostrato che PT aumentava il livello del ligando di morte cellulare programmata 1 (PD-L1) espresso nelle cellule tumorali e reclutava cellule soppressorie di derivazione mieloide (MDSC). L'aumento di PD-L1 era correlato positivamente con la dose di irradiazione. Nei modelli murini singenici Hepa1-6, la combinazione di PT con anti-PD-L1 ha aumentato il ritardo della crescita del tumore rispetto al solo PT, che è stato associato ad un aumento delle cellule T infiltranti il ​​tumore e ad un reclutamento attenuato delle MDSC nel microambiente. Inoltre, quando la PT è stata applicata al tumore HCC primario, i topi trattati con anticorpi anti-PD-L1 hanno mostrato tumori sincroni non irradiati più piccoli. In conclusione, la risposta dell'HCC al PT è stata determinata dall'uccisione delle cellule tumorali e dalla risposta immunologica nel microambiente tumorale. La combinazione con l’anticorpo anti-PD-L1 per migliorare l’immunità antitumorale è stata responsabile del sinergismo terapeutico per l’HCC trattato con PT. Sulla base dei nostri risultati, suggeriamo che la PT combinata con anti-PD-L1 possa rappresentare una politica terapeutica promettente per l’HCC.

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Parole chiave: HCC; terapia protonica; PD-L1; immune

1. Introduzione

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è un tumore che si manifesta a livello globale con un’incidenza relativamente elevata nel sud-est asiatico [1]. La maggior parte dei pazienti ha una prognosi sfavorevole a causa di tumori avanzati e/o di scarsa funzionalità epatica. Tradizionalmente, la radioterapia (RT) con una dose definita per il trattamento del cancro al fegato è stata associata ad un alto rischio di epatite indotta da radiazioni. I miglioramenti nelle tecniche di somministrazione della radioterapia hanno contribuito ad ampliare la finestra terapeutica della RT per l’HCC. Lo sviluppo della RT con terapia protonica (PT) ha portato sotto i riflettori l'uso della RT per l'HCC [2,3]. La PT presenta vantaggi dosimetrici rispetto alla terapia fotonica convenzionale per il trattamento del cancro, in particolare dell’HCC, del cancro della testa e del collo e del cancro al seno. Studi recenti hanno suggerito che potrebbero esserci differenze nei cambiamenti biologici indotti dalla RT, inclusa l’induzione di danni al DNA, stress ossidativo e regolazione delle cellule immunitarie, tra PT e fotoni a dosi di efficacia biologica relativa equivalenti [4–7]. Ulteriori indagini sull'effetto radiobiologico del PT faciliteranno l'opportunità di fornire lo sviluppo di promettenti strategie di PT per il trattamento del cancro. La combinazione di RT e immunoterapia in contesti clinici è promettente per molte indicazioni [8,9]. Poiché l’infiammazione cronica determina una predisposizione allo sviluppo dell’HCC, l’HCC è un potenziale bersaglio per l’immunoterapia [10]. La RT ha effetti sia proimmunogeni che immunosoppressivi sul microambiente tumorale [9]. Sebbene sia stato dimostrato che la RT innesca la morte delle cellule immunogeniche e migliora l'infiltrazione di cellule immunitarie antitumorali [11,12], diversi studi hanno dimostrato che la RT può indurre citochine e cellule immunitarie regolatrici, determinando un microambiente tumorale più immunosoppressivo. È stato dimostrato che la combinazione di immunoterapia e RT migliora la risposta del tumore rispetto a entrambe le modalità da sole e annulla gli effetti immunosoppressivi indotti dalla RT [13,14]. Numerosi studi preclinici e clinici hanno dimostrato che il trattamento con RT fotonica e immunoterapia ha un effetto positivo sul controllo del tumore nell’HCC [15,16]. A nostra conoscenza, quasi tutti i rapporti riguardanti le risposte immunitarie radioindotte sono stati ottenuti con irradiazione basata su fotoni. Una migliore comprensione dei meccanismi responsabili della risposta al PT potrebbe portare ad approcci terapeutici più potenti per l’HCC. Gli effetti biologici della PT responsabile del controllo del tumore e della risposta immunitaria necessitano di ulteriori indagini. Pertanto, abbiamo mirato a valutare l'effetto delle radiazioni con PT e la risposta immunitaria nel microambiente tumorale. Abbiamo anche studiato se la combinazione di PT e il blocco di PD-L1 abbia un effetto sinergico sul controllo del tumore dell'HCC

2. Materiali e metodi

2.1. Coltura cellulare 

La linea cellulare di cancro al fegato umano HepG2 e la linea cellulare di cancro al fegato murino Hepa1–6 sono state ottenute dal Bioresource Collection and Research Center. Inoltre, le cellule HuH7, una linea cellulare di epatoma umano, sono state gentilmente fornite dal Dr. Yen-Hao, Chen (Kaohsiung Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan). L'uso delle linee cellulari è stato approvato dal nostro comitato etico di ricerca istituzionale (n. 00464-2021120952922). Le linee cellulari sono state coltivate nel mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS). Inoltre, le cellule monocitiche umane THP-1 sono state mantenute nel terreno di coltura RPMI 1640. I monociti THP-1 possono essere differenziati in macrofagi M1 o M2 quando incubati in un mezzo condizionato [17,18]. Per determinare gli effetti del PT sulla capacità delle cellule tumorali di indurre la differenziazione dei macrofagi M2, le cellule HuH7 con o senza irradiazione PT sono state seminate in piastre a pozzetti 6- 24 ore prima della fine della polarizzazione dei macrofagi M2. Dopo 24 ore di cocoltura, l'espressione di CD163, un marcatore dei macrofagi M2, è stata analizzata con i macrofagi. L'analisi cellulare attivata dalla fluorescenza multicolore (FACS) è stata eseguita utilizzando un citometro a flusso calibro FACS (BD Biosciences) su sospensioni monocellulari preparate dai macrofagi differenziati e l'immunocolorazione per CD163 è stata effettuata utilizzando un anticorpo monoclonale marcato con fluorescenza. Gli esperimenti in vitro sono stati eseguiti nel Conjoint Laboratory del Chang Gung Memorial Hospital, che ha fornito le piattaforme di servizio tra cui il selezionatore cellulare, l'analizzatore cellulare multicolore e la microscopia confocale.

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2.2. Irradiazione

L'efficacia biologica relativa dei protoni è stata fissata a 1,1 e la dose di efficacia biologica relativa (RBE) è stata calcolata moltiplicando la dose di protoni per questo valore [19]. Nel presente studio, abbiamo utilizzato la dose RBE per valutare l'effetto indotto dalla RT. Il dosaggio nella radioterapia protonica viene prescritto come Gy (RBE) aumentando la dose fisica dell'10%, ovvero la dose protonica RBE=la dose fisica protonica × 1,1. Cellule e topi hanno ricevuto RT locale mediante irradiazione di fotoni o PT con la dose di RBE. L'irradiazione con fotoni è stata eseguita utilizzando Varian 21EX e la pianificazione del trattamento Eclipse. In vitro, cellule in crescita esponenziale sono state irradiate con dosi singole di 0, 3, 6 e 9 Gy utilizzando un fascio da 6 MV per l'analisi della radiazione fotonica. Per PT, l'irradiazione mediante scansione con fascio di matita (PBS) è stata eseguita a diverse dosi di protoni (0, 3, 6, 9 e 12 Gy (RBE)), con un'energia corrispondente a 93,6–109,2 MeV e 72–143,2 MeV per le cellule e topi, rispettivamente. Le irradiazioni di cellule e topi sono state condotte posizionando le cellule al centro del picco di Bragg diffuso (SOBP; larghezza di 1 cm per PT cellulare, larghezza di 6 cm per irradiazione PT di topo) per simulare le condizioni cliniche (Figura 1a,b). L'irradiazione di protoni è stata erogata dal ciclotrone utilizzato nel nostro ospedale (Sumitomo Heavy Industries, Ltd., Tokyo, Giappone), che genera un fascio di protoni continuo e ad alta intensità. La dimensione del campo RT era 20 × 10 cm2 per esaminare l'effetto abscopale, 20 × 15 cm2 per esaminare l'effetto tumoricida del PT in vivo o 20 × 20 cm2 per esaminare l'effetto del PT in vitro. Ray Station era il sistema di pianificazione del trattamento utilizzato per il calcolo della dose RT (versione 8.1, Ray Search Laboratories, Stoccolma, Svezia).

Figura 1. Modello preclinico per PT. I progetti sperimentali del fascio di protoni per modelli di tumore in vitro (a) e animali (campo RT per l'irradiazione del tumore al fegato, linea blu; campo RT per esaminare l'effetto abscopale, linea rossa) (b).

2.3. Saggio di proliferazione delle cellule T

Per esaminare se il PT fosse in grado di regolare l'effetto delle cellule tumorali e delle cellule soppressorie di derivazione mieloide (MDSC) sulla proliferazione delle cellule T CD8+, abbiamo misurato la proliferazione delle cellule T CD8+ dopo la stimolazione. Le cellule T CD8+ isolate utilizzando microsfere anti-CD8 sono state marcate con carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE) e seminate in piastre a pozzetti 96- con cellule CD11b+ in presenza o assenza di cellule tumorali 48 ore dopo il PT. La proliferazione delle cellule T CD8+ è stata stimolata da sfere anti-CD3/CD28 (Invitrogen, Waltham, MA, USA). La colorazione fluorescente CFSE è stata analizzata utilizzando la citometria a flusso 3 giorni dopo la stimolazione.

2.4. Induzione di CD14+HLA-DR da cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC)

Un nuovo sottoinsieme di MDSC è stato identificato in base alla presenza dell'espressione di CD14 ma all'assenza di espressione dell'antigene leucocitario umano (HLA)-DR (CD14+HLA-DR−) nel sangue periferico dei pazienti affetti da cancro. Secondo quanto riferito, l'accumulo anomalo di cellule CD14+HLA-DR− nelle PBMC contribuisce all'evasione immunitaria del tumore ed è correlato alla prognosi del cancro [20–22]. Per valutare il ruolo dell'irradiazione PT nell'induzione delle MDSC, la percentuale di cellule mieloidi CD14+HLA-DR è stata valutata da PBMC incubate con cellule tumorali irradiate con PT per 24 ore. La proporzione di cellule mieloidi CD14+HLA-DR− e il livello di espressione di PD-L1 sono stati analizzati utilizzando FACS (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

2.5. Saggio clonogenico

Sono stati utilizzati test clonogenici per esaminare l'effetto della RT (PT rispetto a RT fotonica) sulla perdita di sopravvivenza delle cellule riproduttive. Le colture cellulari sono state irradiate e poi incubate a 37 ◦C per la formazione delle colonie. Dopo 10 giorni, le colonie sono state fissate e colorate con cristalvioletto per la conta delle colonie. Le colonie sono state valutate per determinare l'efficienza della piastratura e le frazioni sopravvissute ad una determinata dose di RBE. La frazione di sopravvivenza è il numero di colonie dopo l'esposizione RT, con una correzione per l'efficienza della piastratura.

2.6. Modelli di tumore singenico (ectopico e ortotopico).

Tutti gli studi sugli animali sono stati conformi a tutte le norme etiche pertinenti per la ricerca sugli animali e sono stati approvati dal comitato per animali sperimentali del nostro ospedale. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti presso il Laboratory Animal Center del Chang Gung Memorial Hospital, a cui è stato concesso il pieno accreditamento dall'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Abbiamo utilizzato topi C57BL/6J come modello di impianto del tumore al fegato. Nel modello di tumore ectopico e ortotopico, le cellule tumorali (cellule Hepa 1–6 1 × 106) sono state impiantate per via sottocutanea nella regione della coscia destra e/o impiantate intraoperatoriamente nell'area della cupola epatica. Per esaminare la risposta dei tumori epatici al PT in vivo, l'irradiazione locale del PT per 12 Gy (RBE) è stata somministrata ai tumori 14 giorni dopo l'impianto con cellule tumorali Hepa1–6 (Figura 1b). I topi di controllo sono stati sottoposti a irradiazione fittizia. Per affrontare l'effetto abscopal del PT sugli ospiti immunocompetenti portatori di tumore, abbiamo impiantato simultaneamente cellule tumorali Hepa1–6 nella coscia destra (tumore primario) e nella parte superiore della schiena (tumore sincrono secondario). Quattordici giorni dopo l'impianto del tumore, la PT con 12 Gy (RBE) è stata somministrata al tumore primario ma non al tumore sincrono secondario. Abbiamo quindi osservato la crescita del tumore (compresi i tumori primari irradiati e quelli sincroni non irradiati) nei punti temporali indicati. Per studiare gli effetti dell’anti-PD-L1 sul controllo locale del tumore mediato dal PT e sull’effetto abscopal, ai topi portatori di tumore è stata somministrata una dose intraperitoneale di 250 µg di anticorpo antiPD-L1 immediatamente dopo l’irradiazione del PT e ogni 2 giorni fino alla fine dell’irradiazione. gli esperimenti. L'anticorpo anti-topo PD-L1 (B7-H1, 10F.9G2) è stato ottenuto da Bio X Cell (Libano, NH, USA).

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2.7. Analisi citometriche a flusso MDSC in vivo

Le MDSC sono caratterizzate dalla coespressione degli antigeni di differenziazione della linea cellulare mieloide Gr1 e CD11b. Pertanto, abbiamo utilizzato un anticorpo specifico anti-Gr1, che reagisce con un epitopo comune su Ly-6G e Ly-6C, e un anticorpo specifico per CD11b (BD Pharmingen) per definire le MDSC di topo come CD11b + Gr1+ [23]. Inoltre, l'antigene di differenziazione mieloide Gr-1 è costituito da due epitopi riconosciuti dagli anticorpi anti-Ly-6G e anti-Ly6C. La popolazione di MDSC CD11b+Gr-1+ era costituita da due sottoinsiemi principali: cellule con un fenotipo granulocitico che esprimeva Ly-6G e cellule con un fenotipo monocitico che esprimeva Ly6C. Un nuovo sottoinsieme di MDSC è stato identificato come MDSC monocitiche, definite come CD11b+Ly6G- nei topi. Abbiamo eseguito analisi FACS e immunofluorescenza per esaminare l'effetto dell'irradiazione sul reclutamento delle MDSC dopo che i topi avevano ricevuto l'irradiazione. La FACS è stata effettuata su sospensioni unicellulari preparate da tumori interi e milza dopo digestione e immunocolorazione per CD11b, Gr1 e LY6G con anticorpi monoclonali marcati con fluorescenza (BD PharMingen). La percentuale di MDSC è stata misurata mediante citometria a flusso multicolore con i suddetti anticorpi monoclonali. Gli anticorpi isotipo-specifici sono stati utilizzati come controlli negativi nel FACS.

2.8. Analisi statistica

I campioni sono stati analizzati utilizzando il test t di Student. I dati sono presentati come media ± errore standard della media (SD). Tutti gli esperimenti cellulari comprendevano tre repliche biologiche per condizione [24] e sono stati eseguiti almeno tre volte in modo indipendente. Per gli esperimenti in vivo sono stati utilizzati sei animali per gruppo e sono stati eseguiti almeno due esperimenti indipendenti. Per indicare la significatività statistica è stato preso un livello di probabilità pari a p < 0.05, salvo diversa indicazione.

3. Risultati:

3.1. Risposta dell'HCC al PT Risposta dell'HCC

Le cellule tumorali umane e murine sono state esposte a una singola dose PT di 0, 3, 6 o 9 Gy (RBE) e la morte cellulare a 48 ore e la frazione di sopravvivenza delle cellule che formano colonie sono state esaminate e confrontate con fotone-RT. Non vi è stata alcuna differenza significativa nella sopravvivenza cellulare con RBE equivalente tra PT e fotone-RT (Figura 2a,b). La formazione di p-H2AX è una risposta cellulare alle rotture del doppio filamento del DNA e la presenza di esposizione alla calreticulina e il gruppo ad alta mobilità Box 1 (HMGB1) fungono da segni distintivi della morte cellulare dell'immunogenicità indotta da RT [25-27]. Come mostrato nella Figura 2c, il PT ha migliorato l'espressione della calreticulina e dell'HMGB1 associata ad un aumento del danno al DNA 24 ore dopo la RT. Uno studio precedente [28] ha riportato che la RT fotonica sovraregola l'IL-6, il che è correlato alla resistenza dell'HCC alla RT. I dati (Figura 2c,d) rivelano che il PT ha sovraregolato il livello di IL-6 nelle cellule di cancro al fegato analizzate utilizzando IF e RT PCR in tempo reale a 24 e 48 ore dopo il PT. Per caratterizzare ulteriormente se l'aumento di IL-6 da parte di PT fosse collegato all'attività del promotore di IL6, abbiamo eseguito test di attività della luciferasi utilizzando cellule HepG2 e HuH7 trasfettate stabilmente con un vettore che esprime i costrutti del promotore di IL-6 (Figura 2e) . I dati quantitativi suggeriscono che PT ha aumentato l'attività del promotore di IL-6 a 48 ore dopo 6 Gy (RBE) rispetto alle cellule di controllo.

3.2. Risposta al trattamento PT nell'ospite immunocompetente

In vivo, i modelli tumorali animali sono strumenti essenziali per prevedere l’efficacia di nuove strategie antitumorali. Abbiamo utilizzato modelli di tumore murino singenico per studiare gli effetti del PT sul controllo del tumore HCC. Sulla base dell'osservazione dell'attività del tumore tramite il test di tomografia molecolare a fluorescenza (FMT) in situ e la misurazione delle dimensioni del tumore, abbiamo scoperto che l'attività di assorbimento del glucosio nel tumore era significativamente ridotta e tumori più piccoli 12 giorni dopo il PT rispetto alla sham-RT (Figura 3a, B). Per esaminare ulteriormente il meccanismo responsabile della risposta al PT, abbiamo eseguito analisi FACS e immunofluorescenza utilizzando tumori 3 giorni dopo il PT o l'irradiazione fittizia. È stato riportato che l’esposizione alla calreticulina è un indicatore immunogenico dell’apoptosi indotta da RT a dosi più basse e HMGB1 è collegato alla morte cellulare indotta da RT a dosi più elevate [29]. Inoltre, è stato segnalato che IL-6 svolge un ruolo nella modulazione immunitaria indotta da RT [30]. Abbiamo precedentemente riportato che l'espressione di IL-6 era sovraregolata dalla RT dei fotoni e che l'aumento di IL6 era correlato alla risposta alle radiazioni dei tumori al fegato [28]. Come mostrato nella Figura 3c,d, il PT ha aumentato la morte delle cellule tumorali associata ad un aumento del danno al DNA e all'espressione di IL6 e HMGB1 rispetto all'irradiazione fittizia.

3.3. Gli effetti immunomodulatori indotti dal PT

È stato segnalato che l'induzione della polarizzazione dei macrofagi M2 è la componente immunosoppressiva chiave nel microambiente tumorale irradiato [17,18]. Per verificare se il PT migliorasse la differenziazione dei monociti nelle cellule M2, abbiamo incubato i monociti THP-1 allo stadio di riposo (M0) nel mezzo condizionato per 72 ore per la polarizzazione M2. Abbiamo quindi analizzato i livelli del marcatore M2 nei macrofagi dei monociti mediante cocoltura nel surnatante di coltura con o senza cellule HuH7 irradiate con PT 24 ore prima della fine della polarizzazione dei macrofagi M2. Come mostrato nella Figura 4a, l'aggiunta di cellule tumorali irradiate con PT alla coltura dei macrofagi ha aumentato l'espressione del marcatore M2 CD163 nei macrofagi in vitro. Abbiamo studiato ulteriormente il ruolo del PT nella capacità delle cellule tumorali di indurre MDSC dai monociti nel sangue periferico dei donatori mediante cocoltura con cellule tumorali con o senza PT per 48 ore. Un nuovo sottoinsieme di MDSC è stato identificato dalle cellule CD14+HLA-DR nel PBMC. La Figura 4b rivela che l'irradiazione PT era associata a una frequenza più elevata di cellule mieloidi HLA-DR CD14+ rispetto al controllo. Inoltre, è stata riscontrata una maggiore espressione di iNOS, un marcatore funzionale dell'immunosoppressione mediata da MDSC, nel sottoinsieme di cellule che sono state coltivate in cocoltura con cellule tumorali irradiate da PT (Figura 4c). Inoltre, si conferma che CD163 è un marcatore fenotipico dei macrofagi M2 che può essere utilizzato per distinguere i macrofagi M2 e M1. Come mostrato nella Figura 4d,e, il PT ha portato all'aumento delle cellule CD163+ nei tumori irradiati da PT associati all'induzione di MDSC monocitiche nei topi portatori di tumore. È stato segnalato che la RT innesca la morte delle cellule immunogeniche e migliora l'infiltrazione delle cellule immunitarie. Per testare ulteriormente il ruolo del PT nelle conseguenze funzionali delle cellule tumorali sulla soppressione delle cellule T mediata dalle MDSC, la proliferazione delle cellule T CD8+ selezionate è stata valutata in presenza di cellule tumorali con o senza 6 Gy (RBE ) Irradiazione PT. I dati rivelano che le cellule MDSC-CD11b+ hanno diminuito la proliferazione delle cellule T e l'incubazione con cellule tumorali irradiate con PT ha invertito la proliferazione delle cellule T CD8+ dopo la stimolazione (Figura 4f).

Figura 2. Risposta dell'HCC al PT in vitro. Effetti del trattamento PT sulla morte cellulare delle cellule HuH7. (a) Selezione cellulare attivata dalla fluorescenza con colorazione con ioduro di propidio e annessina V 48 ore dopo il PT per la dose indicata (RBE) e (b) frazioni di sopravvivenza cellulare mediante test clonogenici presentati con il rapporto normalizzato dalla frazione di sopravvivenza in condizioni di controllo. I numeri di cellule nella piastratura per 0, 3, 6 e 9 Gy (RBE) erano rispettivamente 500, 1.000, 1.500 e 3.000 per pozzetto. (c) L'immunofluorescenza per il danno al DNA indotto dal PT e i marcatori per la morte cellulare dell'immunogenicità è mostrata da vetrini rappresentativi e dati quantitativi (DAPI, blu; pH 2AX e calreticulina, verde; HMGB1 e IL6, rosso). L'asse y rappresenta i cambiamenti relativi alle pieghe nelle espressioni della proteina bersaglio. (d) I livelli di IL-6 sono stati esaminati tramite RT-PCR in tempo reale 48 ore dopo il PT. (e) Trasfezione stabile di cellule HepG2 e HuH7 con plasmidi contenenti costrutti promotore-reporter IL-6. I valori sono rappresentati come attivazione dell'attività luciferasica del plasmide reporter nella condizione indicata. I dati sono presentati come medie ± errori standard della media. * p<0,05

Figura 3. Risposta al trattamento PT nei topi immunocompetenti. Immagini rappresentative e dati quantitativi sono stati determinati tramite analisi FMT dell'assorbimento di glucosio a 0, 3 o 12 giorni con o senza irradiazione PT (a). L'asse y rappresenta il rapporto normalizzato dal valore del tumore a 0 giorni con irradiazione fittizia. Vengono mostrate immagini rappresentative e dati quantitativi delle immagini del tumore (b) da topi portatori di tumori sc 12 giorni dopo 12 Gy (RBE) PT o irradiazione fittizia. L'asse y rappresenta la variazione relativa delle dimensioni del tumore al momento indicato dopo il PT. Il danno al DNA mediante IF (c) e la morte cellulare mediante FACS (d) sono stati valutati 3 giorni dopo il PT. L'asse y è la variazione relativa delle pieghe nell'espressione della proteina bersaglio e il tasso di morte cellulare a 3 giorni dopo il PT. I dati sono presentati come medie ± errori standard della media. * p < 0.05

3.4. Ruolo del PT nell'espressione del ligando di morte cellulare programmata 1 (PD-L1)

PD-L1 è un determinante critico dell’equilibrio nel microambiente tumorale immunitario [31]. Il PT ha aumentato l'espressione di PD-L1 nelle cellule tumorali del fegato e il livello di espressione era correlato positivamente con la dose RBE di PT in vitro (Figura 5a,b). Per convalidare ulteriormente gli effetti del PT su PD-L1 in vivo, abbiamo esaminato il livello di espressione di PD-L1 nei tumori HCC murini utilizzando IF e FACS. I dati nella Figura 5c,d rivelano un aumento significativo dell'espressione di PD-L1 nei tumori 3 giorni dopo il PT. Abbiamo anche esaminato se il PT regolasse l'espressione di PD-L1 nelle MDSC utilizzando cellule mieloidi CD11b+ selezionate provenienti da tumori. I risultati hanno indicato che il PT ha aumentato l'espressione di PD-L1 nelle cellule CD11b+ selezionate (Figura 5e,f).

3.5. Effetto di PD-L1 sulla risposta dell'HCC al PT in vivo

Per determinare se PD-L1 gioca un ruolo nella radiosensibilità dei tumori epatici al PT in ospiti immunocompetenti, la RT locale con PT 12 Gy (RBE) è stata somministrata a tumori impiantati per via sottocutanea nei topi con o senza trattamento anti-PD-L1. Come mostrato nella Figura 6a-c, l'anti-PD-L1 ha aumentato l'effetto di inibizione del tumore indotto dal PT associato alla ridotta proliferazione cellulare e all'aumento della morte cellulare dopo l'irradiazione. Inoltre, per convalidare gli effetti regolatori dell'anti-PD-L1 sul microambiente tumorale immunitario dopo PT, abbiamo esaminato la risposta immunitaria utilizzando un modello di tumore ortotopico di HCC murino. I dati mostrano che l'anti-PD-L1 ha attenuato il reclutamento delle MDSC e aumentato i TIL CD3+ associati a tumori più piccoli rispetto al solo PT (Figura 6d-f)

3.6. Il blocco di PD-L1 migliora l'effetto abscopal sul cancro al fegato dopo il PT

È stato riportato che le radiazioni inducono effetti abscopali su siti tumorali distanti e non trattati che vengono amplificati dall’uso di farmaci immunomodulanti [32-34]. Di conseguenza, abbiamo esaminato ulteriormente l’effetto abscopal indotto dalla PT sui tumori del fegato e l’impatto del trattamento combinato con l’anticorpo anti-PD-L1. Come mostrato nella Figura 7a, b e nella Figura S1 supplementare, l'applicazione del PT locale al solo tumore ha indotto tumori più piccoli con un metabolismo del glucosio inferiore nei tumori irradiati sulla coscia destra, ma non ha mostrato alcuna inibizione significativa del tumore sui tumori secondari non irradiati nella parte superiore della schiena , rispetto al gruppo sham-RT. Il trattamento combinato con l'anticorpo anti-PD-L1 immediatamente dopo il PT ha potenziato l'effetto tumoricida nel campo irradiato dal PT e ha portato alla regressione dei tumori secondari al di fuori del campo irradiato. L'analisi delle cellule immunitarie infiltranti il ​​tumore ha mostrato che l'anti-PD-L1 ha attenuato il reclutamento delle MDSC, aumentato i TIL CD3+ e diminuito la proliferazione cellulare nei tumori non irradiati (Figura 7c,d) di topi che hanno ricevuto PT locale su tumori primari. Questi risultati suggeriscono che l’anti-PD-L1 ha potenziato la risposta immunitaria antitumorale e aumentato l’effetto abscopale negli ospiti immunocompetenti in seguito all’irradiazione locale del PT

Figura 4. Risposta immunitaria associata al PT. L'espressione del marcatore CD163 nelle cellule alla fine della polarizzazione dei macrofagi M2 è stata analizzata tramite FACS (a) (I: controllo; II: + surnatante di coltura di cellule tumorali; III: + cellule tumorali; IV: +6 Gy (RBE) Supernatante di coltura di cellule tumorali irradiate con PT; V: +6 Gy (RBE) Cellule tumorali irradiate con PT). È stata analizzata la percentuale di cellule CD14+HLA-DR− provenienti da PBMC incubate con o senza cellule HuH7 irradiate con 0, 3 o 6 Gy (RBE) per 48 ore (b) e l'espressione di iNOS nelle cellule CD14+HLA-DR− selezionate è stato analizzato tramite IF (DAPI, blu; iNOS, rosso) (c). L'estensione delle cellule CD163+ nei tumori irradiati 12 giorni dopo il PT è stata esaminata tramite IF (DAPI, blu; CD163, rosso) (d) e l'effetto dell'irradiazione PT sul reclutamento di MDSC monocitiche è stato valutato tramite FACS ( e). Inoltre, il tasso di proliferazione delle cellule T è stato esaminato tramite FACS con o senza incubazione con cellule tumorali irradiate con PT. Vengono mostrate immagini rappresentative e dati quantitativi (f). Il trattamento indicava cellule T CD8+ con sfere di stimolazione anti-CD3/CD28 in presenza di MDSC combinate con cellule tumorali con o senza irradiazione PT. I dati sono presentati come medie ± errori standard della media. * p < 0.05.

Figura 5. Effetto del PT sull'espressione di PD-L1. I livelli di PD-L1 sono stati valutati utilizzando (a) IF (DAPI, blu; PD-L1, verde), (b) colorazione FACS per cellule tumorali del fegato umane e murine a 48 ore dopo il PT in vitro e (c) FACS, e (d) IF per tumori epatici murini ai tempi indicati dopo il PT per 12 Gy (RBE) in vivo. L'asse y è la variazione relativa della piega nell'espressione di PD-L1 alle condizioni indicate dopo il PT. I dati sono presentati come medie ± errori standard della media. * p < 0.05. Inoltre, l'espressione di PD-L1 nelle cellule CD11b+ murine in seguito all'irradiazione PT è stata valutata tramite analisi (e) IF e (f) FACS (cellule CD11b+, macchie blu)

Figura 6. Effetto del PD-L1 sulla risposta dell'HCC al PT in vivo. (a) L'effetto della terapia anti-PD-L1 sul ritardo della crescita del tumore. L'asse y è la variazione relativa delle dimensioni del tumore sottocutaneo indotta dall'anti-PD-L1 dopo il PT. I dati rappresentano la media degli esperimenti, * p < {{10}}.05. (b) Gli effetti in vivo dell'apoptosi indotta dal trattamento valutati utilizzando FACS con colorazione con annessina V-PI. L'asse y è la variazione relativa del tasso di morte cellulare dopo il PT. I dati sono presentati come medie ± errori standard della media. * p<0,05. (c) Immunoistochimica per il danno al DNA indotto da RT e Ki-67 nei tumori ai tempi indicati dopo PT per 12 Gy (RBE). (d) L'effetto della terapia anti-PD-L1 sull'inibizione del tumore è stato valutato in un modello di tumore ortotopico. Immagini rappresentative e dati quantitativi vengono mostrati 12 giorni dopo l'irradiazione PT locale o l'irradiazione fittizia. L'asse y è la variazione relativa delle dimensioni del tumore al fegato. I dati rappresentano la media degli esperimenti, * p <0,05. (e) L'estensione delle cellule ki67+, CD3+TIL e CD11b+ nei tumori irradiati 12 giorni dopo il PT è stata esaminata utilizzando IF (DAPI, blu; ki-67 e CD3, verde ; CD11b, rosso). (f) L'effetto dell'anti-PD-L1 combinato con l'irradiazione PT sul reclutamento delle MDSC è stato valutato utilizzando FACS

Figura 7. L'effetto abscopal sul cancro al fegato dopo il PT. La crescita dei tumori non irradiati sulla parte superiore della schiena è stata determinata tramite analisi FMT dell'assorbimento di glucosio (a) e delle immagini del tumore (b) nei tempi indicati da topi che hanno ricevuto PT per 12 Gy (RBE) al tumore primario solo sulla coscia destra ( PT (+): i topi hanno ricevuto 12 Gy (RBE) sul tumore primario sulla coscia destra, ma non sul tumore secondario sulla parte superiore della schiena). Immagini rappresentative e dati quantitativi dei tumori non irradiati sono mostrati a 0, 3 e 12 giorni dopo l'irradiazione PT con o senza terapia anti-PD-L1. L'asse y rappresenta la variazione relativa del valore di FMT e della dimensione del tumore al momento indicato dopo il PT. Inoltre, vengono mostrate immagini rappresentative del livello di ki-67 e dell'infiltrazione di cellule CD11b+ e cellule CD3+ in tumori secondari non irradiati 12 giorni dopo il PT locale utilizzando IF (DAPI, blu; ki{{16 }} e CD3, verde; CD11b, rosso) (c). L'accumulo di MDSC (d) nel tumore secondario non irradiato è stato analizzato utilizzando la citometria a flusso. L'asse y è la variazione relativa della piega. I dati rappresentano la media degli esperimenti, * p < 0.05

4. Discussione

I risultati di questo studio mostrano che la perdita di cellule formanti colonie indotta dalla PT è dose-dipendente e simile a quella causata dall'irradiazione di fotoni. Il livello di danno non riparato al DNA causato dalle radiazioni è un fattore determinante della risposta alle radiazioni tessuto-specifica. I nostri dati rivelano che la morte cellulare indotta dal PT era correlata all'aumento dei livelli dei marcatori di danno al DNA. È stato riportato che diverse citochine associate al tumore sono regolate dall'irradiazione e sono in grado di reclutare e polarizzare sottoinsiemi immunitari nel microambiente tumorale [35,36]. Abbiamo precedentemente riportato che l'espressione di IL-6 era sovraregolata dalla RT dei fotoni e che l'aumento di IL6 era correlato alla risposta alle radiazioni dei tumori al fegato [28]. Studi preclinici hanno dimostrato che esiste una regolazione differenziale dei fattori infiammatori dopo PT rispetto alla radiazione fotonica, incluso per IL-6 [6,7,37]. Utilizzando esperimenti cellulari abbiamo dimostrato che l'irradiazione con PT ha anche sovraregolato il livello di espressione di IL-6 in modo dose-dipendente. La risposta del tumore al trattamento è influenzata dalla proliferazione delle cellule tumorali e dal microambiente tumorale. L'utilizzo di modelli murini è una strategia ottimale per valutare la risposta al trattamento. A nostra conoscenza, fino ad ora poche serie precliniche hanno presentato la risposta dei tumori epatici alla PT. Nel presente studio sono stati dimostrati i dati in vivo sulla morte delle cellule tumorali e sul ritardo della crescita del tumore indotti dalla PT nei topi portatori di tumore al fegato. Oltre alla radiosensibilità cellulare intrinseca, la ricrescita del tumore dopo la radioterapia in vivo può essere sostanzialmente influenzata da diversi fattori infiammatori e stromali [38,39]. Una varietà di effetti a valle legati al sistema immunitario sono indotti dalla RT, inclusi effetti immunostimolanti e immunosoppressori. La RT stimola l’immunità antitumorale attraverso l’induzione della morte cellulare immunogenica, rilasciando nuovi antigeni ai componenti del sistema immunitario, portando successivamente a un migliore priming e all’attivazione delle cellule T effettrici. D'altra parte, la RT porta ad effetti immunosoppressivi, come il reclutamento di MDSC nel microambiente irradiato [39,40]. Il reclutamento delle MDSC è un determinante del microambiente tumorale immunosoppressivo dopo la RT. Le MDSC sono emerse come i principali regolatori delle risposte immunitarie nel cancro e in altre condizioni patologiche. Le prove supportano i contributi chiave delle MDSC alla progressione del tumore. Abbiamo precedentemente riportato che un aumento delle MDSC potrebbe essere innescato dalla RT e che l’aumento era associato alla resistenza alla RT in un modello animale di HCC [28]. Lo studio presentato ha dimostrato che il PT porta all'attivazione del reclutamento delle MDSC associato all'induzione di MDSC monocitiche nei topi portatori di tumore. Un nuovo sottoinsieme di MDSC identificate come MDSC monocitiche è definito come monociti CD14+HLA-DR− dal sangue periferico dei pazienti e CD11b+Ly6G- nei topi [20,23,41]. L'espressione di iNOS come marcatore funzionale dell'inibizione delle cellule T è il gold standard per la valutazione della funzione delle MDSC [42]. Esperimenti che utilizzano l'incubazione di PBMC con cellule tumorali hanno dimostrato che il PT ha migliorato la capacità delle cellule tumorali di indurre MDSC nei monociti e ha aumentato l'espressione di iNOS nel sottoinsieme di cellule. Inoltre, i nostri dati rivelano che la cocultura con cellule CD11b+ ha ridotto la proliferazione delle cellule T e il cancro irradiato con PT ha attenuato la capacità soppressiva delle cellule CD11b+ sulla proliferazione delle cellule T negli esperimenti di cocultura.

Si ritiene che la linea cellulare mieloide costituisca una rete di cellule immunosoppressive presenti nella maggior parte dei pazienti affetti da cancro e che inibiscono profondamente la generazione dell'immunità antitumorale. I macrofagi, le abbondanti cellule immunitarie nel microambiente tumorale, sono importanti regolatori dell’infiammazione cronica. È stato suggerito che i macrofagi possano essere polarizzati verso il fenotipo M2, che contribuisce al microambiente immunosoppressivo [43]. Le cellule mononucleate nei tumori probabilmente esistono in varie fasi di differenziazione da monociti/MDSC monocitiche a macrofagi M2 associati al tumore. Questa rete tra MDSC e macrofagi M2 associati al tumore rivela che M2 può essere distinto dalle MDSC monocitiche. Le prove suggeriscono che la RT svolge un ruolo regolatorio nei macrofagi con polarizzazione M1/M2 per modulare la risposta immunitaria [44,45]. Abbiamo dimostrato che la cocoltura con cellule irradiate con PT ha comportato una maggiore espressione di marcatori M2 in vitro e tumori irradiati con PT in vivo. L’attivazione delle risposte immunitarie antitumorali è fondamentale per l’efficacia della RT.

Cistanche tubulosa: migliora il sistema immunitario

Molteplici meccanismi immunitari sono importanti nello sviluppo e nella progressione dell’HCC e sono correlati alla prognosi. Gli inibitori del checkpoint mirati a PD1 e PDL1 sono attivi, tollerabili e clinicamente benefici contro l’HCC avanzato [46]. PD-L1, un importante biomarcatore cellulare, svolge un ruolo nell’evasione immunitaria, inclusa l’inibizione della sorveglianza immunitaria mediata dalle cellule T e la regolazione della polarizzazione dei macrofagi M2 [13,31,47]. È stato osservato che la sovraregolazione dell'asse PD-1/PD-L1 sopprime l'azione citotossica delle cellule T, che può essere la causa delle risposte immunitarie dell'ospite che eludono il tumore e dell'uccisione incompleta delle cellule tumorali dopo l'irradiazione. PD-L1 era ampiamente localizzato nelle cellule ematopoietiche, comprese le cellule T, i macrofagi e le cellule tumorali. PD-1/PD-L1 è un importante punto di controllo immunitario che porta all'anergia delle cellule T. Gli anticorpi contro PD-L1, un blocco del checkpoint immunitario, sono stati approvati per la terapia adiuvante di alcuni tumori e come promettente immunoterapia per i pazienti con HCC avanzato [48,49]. Gli inibitori PDL1 rappresentano una delle colonne portanti delle terapie sistemiche nella pratica clinica o in fase di sviluppo per l’HCC. Inoltre, gli effetti immunosoppressivi indotti dalla RT rivelano il potenziale per combinare con successo le radiazioni con varie forme di immunoterapia per abrogare questi effetti immunosoppressivi. Le MDSC possono contribuire alla resistenza del paziente all’inibizione del checkpoint immunitario. Abbiamo dimostrato che il PT sovraregola l'espressione di PD-L1 nei tumori e nelle MDSC in modo dose-dipendente in vitro e in vivo. Gli effetti immunosoppressivi indotti dalla RT rivelano il potenziale per combinare con successo le radiazioni con varie forme di immunoterapia per abrogare questi effetti immunosoppressivi. La ricerca preclinica ha dimostrato che la combinazione di RT fotonica e immunoterapia mostra un sinergismo terapeutico per migliorare il controllo del tumore [15]. Come sappiamo, la combinazione di RT e immunoterapia è ancora nelle fasi preliminari e non esistono specifiche ottimali sulla dose di RT, sui tipi di RT o sul sequenziamento per RT e immunoterapia. Per chiarire questo problema dell'irradiazione PT combinata con l'immunoterapia, abbiamo combinato la terapia anti-PD-L1 con l'irradiazione PT di tumori epatici in modelli di tumore singenico. Abbiamo scoperto che la combinazione con l'anticorpo anti-PD-L1 sensibilizzava il cancro al fegato all'irradiazione PT, come dimostrato da un tumore più piccolo associato ad una aumentata morte delle cellule tumorali. Inoltre, la terapia anti-PD-L1 ha inibito il reclutamento delle MDSC e aumentato la filtrazione delle cellule T CD3+ nei tumori irradiati con PT.

La RT è classicamente considerata una terapia locale, che uccide le cellule tumorali attraverso un danno intrinseco al DNA nel campo delle radiazioni. Inoltre, la risposta abscopale alle radiazioni è un fenomeno ben consolidato in cui anche i tumori al di fuori di un campo di radiazioni rispondono al trattamento. Si ritiene che l'effetto abscopal sia immunomediato. Una parte delle cellule tumorali all’interno di un tumore morirà per morte cellulare immunogenica quando le radiazioni vengono utilizzate a dosi terapeutiche. La morte delle cellule tumorali indotta dalla RT è associata alla generazione di segnali molecolari specifici e alla presentazione di più antigeni ai componenti del sistema immunitario. È stato riportato che la RT può innescare un effetto abscopale immuno-correlato, il che implica che la RT non solo ha un effetto tumoricida sul tumore bersaglio ma ha anche un effetto antitumorale su siti di cancro distanti e non trattati [32,50,51]. Tra i fattori indotti dalla RT, la capacità delle radiazioni di promuovere il riconoscimento delle cellule tumorali da parte delle cellule T è probabilmente di particolare importanza per l’effetto abscopale. Questo effetto è associato alla morte delle cellule tumorali per stimolare l’immunità antitumorale che può essere amplificata dall’uso di agenti immunomodulanti. Inoltre, pembrolizumab produce un tasso del 15-20% di remissioni oggettive associate a una sopravvivenza prolungata nell’HCC [46]. Un punto critico per quanto riguarda gli inibitori del checkpoint è la loro efficacia e sicurezza. È chiaro che l’immunoterapia non fornisce benefici per tutti i pazienti. Come superare la resistenza del tumore all’immunoterapia è una questione importante. Le potenziali cause della resistenza del tumore comprendono la resistenza intrinseca e lo sviluppo di anticorpi anti-farmaco che neutralizzano l'attività dell'immunoterapia. Per ottenere una forte stimolazione immunitaria si possono combinare in sequenza o contemporaneamente diverse terapie locali con l’immunoterapia sistemica. È probabile che l’immunoterapia si sinergizzi con gli interventi locali nell’HCC. L'HCC è spesso multifocale con potenziali aree precancerose che si sviluppano in modo metacrono. Qui, abbiamo ulteriormente esaminato se la combinazione di PT con anti-PD-L1 migliora l’effetto abscopale del PT per aumentare il controllo dei tumori epatici metacroni. I nostri dati rivelano che la combinazione di PT con anti-PD-L1 ha indotto dimensioni tumorali più piccole nei tumori secondari non irradiati rispetto a quelli indotti dal PT o dall'anti-PD-L1 da soli. I nostri dati mostrano anche che la combinazione con anti-PD-L1 era associata ad un aumento dei TIL e ad un reclutamento attenuato delle MDSC in tumori distanti non irradiati di topi che avevano ricevuto PT locale. Questi risultati suggeriscono che l’anti-PD-L1 ha aumentato l’immunità antitumorale, che ha mediato l’aumento delle attività di uccisione del tumore primario e l’effetto abscopale nei topi portatori di tumore che hanno ricevuto irradiazione PT locale.

Cistanche tubulosa: migliora il sistema immunitario

5. Conclusioni

La logica alla base della combinazione di radioterapia e immunoterapia è che le radiazioni potrebbero produrre un’immunità antitumorale sinergica e che l’immunoterapia supera le risposte di soppressione immunitaria nel microambiente tumorale irradiato. In sintesi, suggeriamo che oltre all’effetto biologico sulle cellule tumorali, il PT abbia anche un effetto di modulazione immunitaria sul microambiente tumorale. I nostri dati rivelano che l’anti-PD-L1 ha suscitato l’immunità antitumorale e successivamente ha aumentato la risposta dei tumori primari e distanti all’irradiazione PT. L'applicazione di anti-PD-L1 combinato con PT potrebbe rappresentare una strategia promettente per il trattamento dell'HCC.

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