Effetti di un nutraceutico a base di frutta e verdura sui biomarcatori dell'infiammazione e dello stato ossidativo nel plasma di una popolazione sana: uno studio clinico controllato con placebo, in doppio cieco e randomizzato
Feb 22, 2022
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Astratto: Esistono prove scientifiche dell'effetto positivo dipolifenolidai cibi vegetali in poiinfiammazione eossidativostato. Lo scopo del presente studio era di indagare se il trattamento con un nutraceutico ad alto contenuto polifenolico riduca la concentrazione plasmatica di alcuniossidativoeinfiammatoriobiomarcatori in una popolazione sana. Centotto soggetti sono stati selezionati e stratificati per sesso nel gruppo di intervento (n {{0}}) e nel gruppo placebo (n=55). Novantadue soggetti hanno completato lo studio dopo due periodi di trattamento di 16-settimane separate da un periodo di washout di quattro settimane. I risultati hanno rivelato differenze statisticamente significative nei soggetti trattati con l'estratto polifenolico rispetto al placebo: una diminuzione di omocisteina, lipoproteina a bassa densità ossidata (OxLDL), TNF-, sTNFR1 e proteina C-reattiva (CRP). La diminuzione più significativa è stata osservata per OxLDL (da 78,98 ± 24,48 a 69,52 ± 15,64; p < 0.05)="" e="" crp="" (da="" 1,50="" ±="" 0.="" da="" 33="" a="" 1,39="" ±="" 0,37;="" p="">< 0,05),="" entrambi="" mostrano="" differenze="" significative="" rispetto="" al="" placebo="" (p="">< 0,001).="" inoltre,="" le="" catecolamine="" sono="" aumentate="" dopo="" la="" somministrazione="" del="" prodotto="" in="" esame,="" soprattutto="" nel="" caso="" della="" dopamina="" (da="" 15,43="" ±="" 2,66="" a="" 19,61="" ±="" 5,73;="" p="">< 0,05).="" pertanto,="" il="" consumo="" di="" un="" nutraceutico="" a="" base="" di="" frutta="" e="" verdura="" ad="" alto="" contenuto="" di="" polifenoli="" sembra="" migliorare="" i="" parametri="" relativi="" ai="" benefici="" per="" la="" salute="">ossidativoeinfiammatoriobiomarcatori), compresi notevoli cambiamenti nell'espressione delle catecolamine.
Parole chiave: polifenolo; biomarcatori; lo stress ossidativo; frutta; verdura; nutraceutico
1. Introduzione
La letteratura scientifica ha documentato il ruolo della dieta nella prevenzione delle malattie non trasmissibili come l'obesità, le malattie cardiovascolari, il cancro e tutte le cause di morte, soprattutto attraverso il consumo di frutta e verdura per il loro alto contenuto di composti bioattivi, principalmente polifenoli [1 ,2]. Esiste una relazione inversa tra la dieta mediterranea, caratterizzata da un elevato consumo di prodotti ricchi di polifenoli, attraverso il consumo di cibi e bevande ricchi di polifenoli come frutta, verdura, cacao, tè e caffè, e il rischio di tutte le cause mortalità [3,4]. Nonostante sia stato dimostrato che il consumo di 800 g/giorno di frutta e verdura riduce il rischio di malattie cardiovascolari e mortalità per tutte le cause, e 600 g/giorno riduce il rischio di cancro, l'OMS e diverse linee guida dietetiche continuano a consigliare 400 g/giorno [5]. Tuttavia, la maggior parte della popolazione non raggiunge nemmeno il minimo stabilito dalle autorità sanitarie, che equivale a cinque porzioni di frutta e verdura al giorno [6,7]. I benefici legati a uno stile di vita sano sono conosciuti in tutto il mondo, con l'emergere di nuovi prodotti che offrono la possibilità di incorporare i suddetti composti bioattivi attraverso integratori/nutraceutici, il che aiuta a raggiungere le raccomandazioni nutrizionali [8].
Inoltre, a causa del progressivo invecchiamento della popolazione, tra altri fattori come dieta e stile di vita, si registra un aumento accelerato delle malattie neurodegenerative, con AD come principale esponente, la cui prevalenza raddoppia ogni 20 anni. Per l'impatto e il costo sociale che genera, molti studi sono stati condotti sul rapporto tra il consumo di frutta e verdura come apporto di antiossidanti che riduconoossidativodanno a livello cerebrale [9].
I polifenoli sono prodotti come metaboliti secondari delle piante come meccanismo di difesa contro condizioni avverse (parassiti, clima o inquinamento, tra gli altri) [10] e formano un ampio gruppo di sostanze fitochimiche bioattive, inclusi acidi fenolici, stilbeni, lignani, alcoli fenolici e flavonoidi [11,12]. Forniscono potenziali effetti nella prevenzione e nel trattamento di diverse patologie, come malattie cardiovascolari, cancro, diabete mellito, invecchiamento e malattie neurodegenerative [13] attraverso diverse bioattività (attività cardioprotettiva, anti-infiammatorioattività, attività antietà, attività antiossidante, attività antitumorale, effetti antimicrobici, effetti neuroprotettivi, effetti protettivi per i polmoni, effetti protettivi sui reni, prevenzione dell'osteoporosi e protezione contro i raggi UV) [14]. I polifenoli si attenuanoinfiammazionesopprimendo pro-infiammatoriofattori di trascrizione dall'interazione con le proteine coinvolte nell'espressione genica e nella segnalazione cellulare [15]. La capacità vasodilatatrice, vasoprotettrice, antitrombotica, antilipemica, antisclerotica, antinfiammatoria e antiapoptotica dei polifenoli è una conseguenza delle loro proprietà salutari [12], considerando che i polifenoli sono la principale fonte di antiossidanti (10 volte superiore alla vitamina C e 100 volte superiore alla vitamina E e ai carotenoidi) [16]. Infatti, quercetina, miricetina e kaempferolo sono flavanoli, i flavonoidi con la più alta capacità di neutralizzazione dei radicali liberi, poiché la loro struttura di gruppo fenolico è in grado di catturare gli elettroni spaiati dei ROS, generando specie reattive neutralizzate [17]. Tuttavia, la concentrazione di polifenoli nel plasma è fortemente dipendente dalla struttura chimica e dalla fonte dietetica, quindi è consigliabile un'assunzione a lungo termine per ottenere tutti i relativi benefici [12].
L'obiettivo della presente sperimentazione clinica era di valutare se il consumo a lungo termine di un'elevata varietà di polifenoli attraverso un nutraceutico a base di frutta e verdura è in grado di migliorare i biomarcatori legati allainfiammazioneeossidativostato in soggetti sani che non consumano le quantità raccomandate di frutta e verdura. Inoltre, la popolazione sana non anziana è stata oggetto di pochi studi di intervento che mettono in relazione il consumo di frutta e verdura e i livelli di catecolamine come variabili legate alla cognizione [27,28,34].
2. Risultati
2.1. Popolazione di studio
In questo studio sono stati inclusi un totale di 108 soggetti (la tabella 1 mostra i loro dati demografici), divisi in due gruppi omogenei (N1 e N2). Infine, dopo il crossover e la perdita al follow-up, 92 soggetti (N1=48, N2=44) hanno completato l'intervento e sono stati inclusi nell'analisi statistica finale, come illustrato nella Figura 1.
2.2. Biomarcatori plasmatici
Le medie e le deviazioni standard di tutti i biomarcatori analizzati in tutti i soggetti, sia al basale che alla fine dell'intervento dopo l'assunzione di estratto polifenolico (EXT) o l'assunzione di placebo (PLA), sono illustrati nella Tabella 2.
Per quanto riguarda il profilo lipidico, la variazione del colesterolo lipoproteico ad alta densità (HDL) a seconda del tipo di prodotto consumato è stata notevole. I valori di HDL si sono ridotti significativamente dopo il consumo di PLA (∆4,52mg/dL;p<0.05),while increased="" significantly="" in="" the=""><0.05).additionally, the="" difference="" between="" both="" groups="" was="" also="" statistically="" significant="" at="" the="" end="" of="" the=""><0.05). finally,="" total="" cholesterol="" and="" triglycerides="" values="" did="" not="" show="" significant="" differences="" throughout="" the="" intervention="" after="" pla="" or="" ext="">
Regarding the vitamins analyzed, a slight increase in vitamin B12 was observed in both groups, as well as small non-significant variations in vitamin E values, as shown in Table2(p>0.05). Ad esempio, la vitamina B12 variava dopo il trattamento di assunzione in entrambi i gruppi PLA ed EXT; tuttavia, non sono state trovate differenze significative (p=0.43 e p=0.20, rispettivamente). Nel caso della vitamina E, i valori variavano nei gruppi PLA(p=0.98) ed EXT(p=0.91).Inoltre, confrontando i gruppi alla fine dell'intervento, non differenze significative sono state osservate sia per la vitamina B12(p=0.205) che per la vitamina E (p=0.974).
Per quanto riguarda i valori delle catecolamine, il reperto principale è stato il significativo aumento della dopamina (∆4,18pg/mL;p<0.001)after consumption="" of="" ext="" with="" respect="" to="" pla="" (p="0.22)," showing="" significant="" differences="" between="" groups="" at="" the="" end="" of="" the="" intervention=""><0.001). a="" significant="" increase="" in="" norepinephrine="" values="" was=""><0.05), with="" an="" increase="" of="" ∆="" 39.21="" pg/ml="" in="" the="" ext="" group,="" not="" observed="" in="" the="" pla="" group="" (p="0.72)." there="" was="" no="" signifificant="" difference="" between="" the="" groups="" at="" the="" end="" of="" the="" study.="" analyzing="" the="" cortisol="" and="" adrenaline="" values,="" no="" signifificant="" differences="" were="" observed="" in="" any="" group="" during="" the="" intervention,="" nor="" at="" the="" end="" of="" the="">
La funzione tiroidea è stata determinata dagli ormoni T3, T4 e TSH. Durante l'intervento, è stato osservato che i valori dell'ormone T3 sono diminuiti significativamente in entrambi i gruppi (p < 0.05).="" i="" valori="" dell'ormone="" t4="" variavano="" in="" modi="" diversi,="" aumentando="" significativamente="" nel="" gruppo="" pla="" (∆="" 0.57="" mcg/l;="" p="">< 0.001)="" e="" diminuendo="" in="" modo="" non="" significativo="" nel="" gruppo="" ext="" (∆="" 0,47="" mcg="" ).="" nel="" frattempo,="" i="" valori="" dell'ormone="" tsh="" sono="" rimasti="" costanti="" dopo="" il="" consumo="" di="" entrambi="" i="" prodotti.="" confrontando="" l'evoluzione="" dei="" tre="" ormoni="" tra="" i="" gruppi="" alla="" fine="" dello="" studio,="" non="" sono="" state="" osservate="" differenze="" significative="" per="" t3="" (p="0.195)," t4="" (p="0.195)" o="" tsh="" (p="">
Per determinare la sicurezza dei prodotti in esame, sono state analizzate le transaminasi (GOT, GPT e GAMMA GT) al fine di valutare la funzionalità epatica dei soggetti, non osservando variazioni significative (p > {0}}.05) in nessun dei suddetti enzimi epatici dopo il consumo del prodotto o del placebo. Pertanto, si può presumere che l'assunzione dei prodotti sia sicura.
3. Discussione
Come commentato sopra, i dati ottenuti nel presente manoscritto riflettono alcune differenze tra i trattamenti. Tuttavia, in condizioni basali, non sono state osservate differenze significative tra i gruppi, il che rafforza i cambiamenti significativi ottenuti dopo il consumo del prodotto.
L'omocisteina plasmatica è considerata un indicatore di rischio cardiovascolare che può essere modificato attraverso l'esercizio e la dieta. Inoltre, il suo elevato effetto neuroprotettivo è ben noto [35,36]. Tuttavia, sembra che il cibo fornisca un apporto costante di nutrienti per mantenere un metabolismo ottimale dell'omocisteina [37]. Nel nostro studio, l'omocisteina è diminuita significativamente dopo il consumo del prodotto, come in studi precedenti [22,38]. Pertanto, il consumo di polifenoli in dosi elevate aiuta a ridurre l'omocisteina, che potrebbe essere considerata una capacità cardioprotettiva. A loro volta, il profilo lipidico, il colesterolo totale e i trigliceridi non sono stati influenzati durante l'intervento. Tuttavia, è stato degno di nota il fatto che il colesterolo plasmatico HDL è aumentato significativamente dopo il consumo del prodotto e è diminuito dopo il consumo del placebo. Questi cambiamenti nelle lipoproteine plasmatiche rafforzano l'idea della capacità cardioprotettiva del prodotto in esame.
Il principale risultato della presente ricerca è stata la significativa diminuzione delle OxLDL, insieme all'incremento del colesterolo HDL dopo il consumo cronico dell'estratto ricco di polifenoli rispetto al placebo. Questi risultati sono in accordo con studi precedenti a sostegno del fatto che i polifenoli mostrano protezione contro l'aterosclerosi, inibendo così la proliferazione della muscolatura liscia vascolare [12,39,40]. L'OxLDL è uno dei pochi parametri riconosciuti dall'Autorità europea per la sicurezza alimentare (EFSA), nell'ambito delle indicazioni di funzione, e sembra essere una variabile di risultato appropriata per la fondatezza delle indicazioni sulla salute relative alla riduzione del danno ossidativo dei lipidi [ 41,42]. Inoltre, OxLDL promuove l'adesione dei monociti alle cellule endoteliali attraverso un meccanismo indipendente dall'espressione di ICAM-1 e VCAM{7}}, generando cellule schiumose [43]. Tuttavia, questo non si verifica con LDL [44]. Questo legame viene eseguito attraverso alcuni recettori, come il CD36. OxLDL è un ligando per PPAR e sovraregola l'espressione di CD36, favorendo l'assorbimento di OxLDL ai macrofagi [45] e di conseguenza contribuendo allo sviluppo dell'aterosclerosi attraverso l'attivazione del sistema immunitario [46]. È interessante notare che l'OxLDL promuove la disfunzione endoteliale e l'aterosclerosi, diminuendo così il rischio cardiovascolare [47,48].
A sua volta, il trattamento con il prodotto in esame ha portato alla riduzione plasmatica della CRP, una proteina di fase acuta sintetizzata nel fegato, mediata da altre citochine, in particolare IL-1 e IL{2}} [49]. Alti livelli di PCR sono correlati con un aumentato rischio di eventi cardiovascolari, anche in individui sani [50]. Diversi studi hanno trovato un'associazione tra le concentrazioni di CRP ed eventi cardiovascolari come infarto miocardico acuto, ictus e progressione della malattia occlusiva arteriosa periferica [51,52]. Sebbene i livelli ottenuti in CRP siano all'interno degli intervalli normali per una persona sana, la diminuzione di questi livelli mostra la validità dei polifenoli a questo riguardo.
Inoltre, il marker immuno-infiammatorio TNF- è stato significativamente ridotto dopo il consumo dell'estratto. Il TNF- è una citochina pro-infiammatoria che è significativamente espressa nel tessuto adiposo, così come nei leucociti, nelle cellule endoteliali e nelle cellule muscolari [53], partecipando alla disregolazione endoteliale, stimolando la migrazione di monociti e macrofagi e inducendo l'espressione di molecole di adesione [54]. Infatti, un aumento del TNF- può verificarsi in una dieta a bassa concentrazione di caroteni, il che può spiegare la riduzione osservata nei livelli di TNF- [55]. Pertanto, ha senso che nel nostro studio diminuisca il suo valore dopo il consumo del prodotto a causa dell'elevata presenza di caroteni nel prodotto.
L'estratto polifenolico utilizzato per la presente indagine è stato testato in diversi studi di intervento, con diversi tempi di consumo e in diversi gruppi di popolazione, portando a risultati incoerenti. In una {{0}} settimana di intervento su uomini addestrati appartenenti alle forze di polizia speciali austriache, sono state segnalate riduzioni significative (p < 0,001)="" della="" concentrazione="" di="" gruppi="" carbonilici="" nelle="" proteine="" e="" nel="" tnf-="" nella="" 16a="" e="" 28a="" settimana="" .="" una="" differenza="" con="" il="" nostro="" studio="" era="" che="" nel="" loro="" studio="" i="" campioni="" sono="" stati="" ottenuti="" alle="" settimane="" 4,="" 8,="" 16="" e="" 28.="" in="" particolare,="" i="" valori="" sono="" aumentati="" fino="" alla="" settimana="" 8="" e="" sono="" diminuiti="" dalla="" settimana="" 16="" in="" poi="" [56].="" in="" un="" intervento="" di="" otto="" settimane="" in="" soggetti="" sovrappeso="" e="" obesi="" di="" età="" superiore="" ai="" 40="" anni,="" sono="" state="" riportate="" riduzioni="" significative="" del="" colesterolo="" totale,="" del="" colesterolo="" ldl="" e="" del="" tnf-,="" che="" non="" sono="" state="" ottenute="" con="" il="" placebo;="" tuttavia,="" non="" sono="" state="" riscontrate="" differenze="" significative="" in="" crp,="" stnfr1="" o="" oxldl="" [57].="" entrambi="" i="" risultati="" sembrano="" confermare="" che="" l'assunzione="" di="" polifenoli="" a="" lungo="" termine,="" come="" nel="" nostro="" studio="" (16="" settimane),="" è="" associata="" a="" una="" maggiore="" efficacia="" contro="" l'infiammazione.="" in="" un="" altro="" intervento="" di="" otto="" settimane="" in="" donne="" obese,="" sono="" stati="" osservati="" miglioramenti="" significativi="" in="" diversi="" marcatori="" di="" ossidazione="" proteica="" come="" proteine="" carboniliche,="" oxldl="" (p="0.015)" e="" ossidazione="" lipidica="" totale="" di="" tutti="" i="" lipidi.="" per="" quanto="">infiammatoriomarcatori, sono state notate riduzioni significative di TNF- (p=0.011). Al basale, i valori di TNF erano al di sopra dell'intervallo stabilito nel gruppo placebo ed estratto; al termine dell'intervento, sono rimasti elevati nel gruppo placebo e sono scesi ai valori normali nel gruppo che ha consumato il prodotto [58]. Infine, l'efficacia dell'estratto è stata testata anche in soggetti non sani, riportando una riduzione delle OxLDL dopo un periodo di consumo di tre mesi da parte dei forti fumatori [59].
Per quanto riguarda le catecolamine, sono stati osservati aumenti significativi della noradrenalina e, soprattutto, della dopamina dopo il consumo del prodotto in esame. Tuttavia, non sono stati osservati cambiamenti significativi per il cortisolo e l'adrenalina in nessun gruppo. Nonostante alcuni studi precedenti abbiano riportato una riduzione del cortisolo nel plasma [60] o nella saliva [61] dopo l'assunzione di polifenoli, questo non è normale e i valori raramente mostrano cambiamenti significativi [62-64] per quanto riguarda l'assunzione di polifenoli. Il fatto che sia i valori di adrenalina che di cortisolo non siano aumentati implica che non si sia sviluppata una risposta adrenergica legata al consumo del prodotto. Anche la noradrenalina e la dopamina sono aumentate nei pazienti anziani con malattie neurodegenerative [65,66] e sono correlate all'ansia [67] e al potenziamento cognitivo [68]. Inoltre, la noradrenalina è strettamente correlata all'attenzione e alla vigilanza [69,70]. I risultati ottenuti nel presente studio in termini di dopamina e noradrenalina potrebbero essere correlati ai miglioramenti a livello cognitivo osservati in un'altra pubblicazione [71]. Possiamo affermare che il consumo di polifenoli, quindi, aumenta i livelli di vigilanza e attenzione, che si correlano con i risultati a livello di test cognitivi [71]
Una limitazione del presente studio clinico, come descritto da Di Lorenzo et al. [10] in uno studio sistematico sulla biodisponibilità dei polifenoli, è che l'inclusione di soggetti sani negli studi clinici rende difficile valutare differenze significative nei biomarcatori, che sono alterati in condizioni patologiche. Altre limitazioni di questo studio includono il fatto che i metaboliti dei composti fenolici nel prodotto non sono stati determinati oltre il contenuto di vitamina E o la risposta individuale, il che potrebbe influenzare la biodisponibilità e la bioattività dei polifenoli [72].
È importante ricordare che i volontari del presente studio sono soggetti sani e che i biomarcatori di infiammazione che abbiamo determinato sono compresi tra i valori normali nel plasma. Pertanto, le differenze osservate all'interno del range dei valori normali per questi biomarcatori, pur essendo statisticamente significative, non sono eclatanti dal punto di vista clinico. Tuttavia, se il prodotto in studio ha ottenuto cambiamenti statisticamente significativi nelle persone sane, questi cambiamenti potrebbero essere ancora maggiori nei pazienti con valori anormali [73,74], poiché i polifenoli nel prodotto aiuterebbero a combattere almeno in parte l'agente che causa questa interruzione di livello plasmatico [75].
Pertanto, la ricerca futura potrebbe concentrarsi sulla considerazione di questi aspetti sia nelle popolazioni sane che in quelle non sane.
4. Materiali e metodi
4.1. Progettazione di prova
Questo studio consisteva in uno studio clinico randomizzato, cross-over, in doppio cieco, stratificato per sesso e controllato con placebo per valutare l'efficacia del consumo quotidiano di un nutraceutico incapsulato (Juice Plus plus Premium®, The Juice Plus plus Company, Collierville , TN, USA) sulla base di diversi tipi di frutta e verdura sui biomarcatori plasmatici di infiammazione e stato ossidativo. L'intervento ha avuto una durata di 36 settimane, due periodi di 16 settimane separati da un periodo di washout di 4 settimane. Durante l'intervento i soggetti si sono recati in laboratorio quattro volte (all'inizio e alla fine di ogni fase), prelevando campioni di sangue a digiuno. All'inizio di ogni fase, il prodotto (EXT o PLA) veniva consegnato ai soggetti e, alla fine di ogni fase, i soggetti dovevano restituire i pacchi affinché i ricercatori potessero quantificare i prodotti rimanenti.
Ciascun soggetto ha firmato un documento di consenso informato ed è stato assegnato un codice numerico in ordine di arrivo; successivamente, un ricercatore esterno ha effettuato la randomizzazione utilizzando un generatore computerizzato (Epidat v4.1 Epi-dat, Spagna) assegnando i soggetti a uno dei gruppi. Né i ricercatori né i soggetti sapevano a quali gruppi appartenessero i soggetti. Sia il prodotto che il placebo sono stati contrassegnati con codici forniti dall'azienda distribuita e classificati in A e B, e solo alla fine dello studio i ricercatori sono stati informati di quale codice corrispondeva al prodotto e quale al placebo. Il protocollo è stato approvato dal Comitato di Revisione Istituzionale dell'Università Cattolica San Antonio di Murcia (UCAM) (data: 24 novembre 2017; codice: CE111072). Questo studio è stato condotto seguendo gli standard di buona pratica clinica ed è stato condotto secondo la Dichiarazione di Helsinki. La sperimentazione è stata registrata su www.clinicaltrials.gov (accesso 11 giugno 2020) (identificatore CFE/JU/44-17). Lo studio è stato condotto presso il Dipartimento di Farmacia della Facoltà di Scienze della Salute dell'Università Cattolica San Antonio da Murcia (UCAM). La vigente normativa europea in materia di protezione dei dati personali è stata rispettata (Regolamento (UE)2016/679).
4.2. Partecipanti
I soggetti dovevano soddisfare tutti i criteri di inclusione (firmare il modulo di consenso informato, BMI compreso tra 18,5 e 35 kg/m2, non avere una malattia cronica, non consumare più di tre porzioni di frutta e verdura al giorno, ed età compresa tra 18 e 65 anni) e non soddisfano nessuno dei criteri di esclusione (essere in cura o in trattamento farmacologico, assumere multivitaminici, allergia a frutta o verdura, essere a dieta, essere vegetariani o vegani, fumare, consumare più di 3 bicchieri di alcol ( vino o birra) al giorno, essere incinta, aver subito un intervento chirurgico importante negli ultimi tre mesi, avere problemi di sonno e aver donato 0,5 L di sangue negli ultimi tre mesi). Dopo aver verificato i criteri di inclusione/esclusione, hanno iniziato lo studio un totale di 108 soggetti di entrambi i sessi. La verifica è stata intrapresa per garantire che i soggetti continuassero a soddisfare i criteri durante tutte le visite all'unità mediante un'indagine sull'indice di stile di vita mediterraneo (MEDLIFE) per valutare le abitudini alimentari e l'attività fisica [76]. Durante l'intervento, 16 soggetti sono stati persi al follow-up, quindi il
il numero di soggetti che hanno completato lo studio è stato 92, i cui dati demografici sono riportati nella tabella 1.
4.3. Supplemento al test
Il prodotto in esame e il placebo avevano le stesse caratteristiche ed entrambi sono stati prodotti e forniti da The Juice Plus Plus Company, Collierville, TN, USA. La presentazione era sotto forma di prodotti farmaceutici incapsulati bianchi, forniti in flaconi differenziati solo da un codice. Una volta completato lo studio, agli sperimentatori è stato fornito quale codice apparteneva al prodotto e quale al placebo. Le differenze nel prodotto commerciale erano che consisteva nell'assunzione di tre diversi tipi di capsule al giorno: due di frutti di bosco misti, due di frutti misti e due di verdure miste, ciascuno fornito in una bottiglia separata. Per questo motivo, e per poter fabbricare un prodotto simile e un placebo, si è deciso di fabbricare capsule contenenti una miscela delle tre capsule summenzionate (bacche, frutta e verdura), per cui il consumo giornaliero per questo studio era di sei capsule: tre prima di colazione e tre a metà pomeriggio, accompagnate da acqua.
Il prodotto in esame era fornito in capsule di colore bianco opaco e conteneva polvere e polpa di succo di frutta, verdura e bacche di mela, arancia, ananas, mirtillo rosso, pesca, acerola, barbabietola, prugna secca, dattero, mango, carota, prezzemolo, cavolo riccio, broccoli, cavoli, spinaci, crusca di riso, pomodoro, foglie di carciofo, mirtilli, more, ribes nero, mirtilli, mirtilli rossi, uva concord, bacche di sambuco, estratto di semi d'uva, estratto di tè verde, radice di zenzero, lamponi, cacao, melograno, miscela di tocoferolo naturale ( , δ, , -tocoferoli, girasole -tocoferolo), miscela di carotenoidi naturali (luteina, -carotene, licopene, astaxantina), pectina di agrumi, bioflavonoidi di agrumi, scorza di limone, carbonato di calcio, aglio in polvere, spirulina, miscela di enzimi naturali, biossido di silicio , magnesio stearato di origine vegetale, tangeretina e Lactobacillus acidophilus. Una dose giornaliera di 6 capsule forniva 2,91 mg di -carotene, 18,7 mg di vitamina E, 159 mg di vitamina C, 318 µg di folato, 6,1 mg di luteina, 1 mg di licopene e 0,15 mg di astaxantina. Il placebo consisteva in cellulosa microcristallina, amido di riso, capsula vegetale (cellulosa), magnesio stearato e coloranti artificiali (FD&C giallo n. 6 e FD&C blu n. 1).
La caratterizzazione polifenolica del prodotto è stata effettuata in un precedente studio di Bresciani et al. attraverso UHPLC-QqQ-MS, mostrando un totale di 119 composti polifenolici di diverse famiglie fenoliche, inclusi flavonoli come kaempferol e quercetina, antociani e flavoni [77]. Per quanto riguarda la biodisponibilità, la conoscenza della quantità biodisponibile di polifenoli è più interessante della quantità totale, poiché, in molte situazioni, i polifenoli più abbondanti non sono i più attivi per l'organismo [78]. Per questo motivo Bresciani et al. valutato la biodisponibilità del prodotto, riscontrando che delle 92 molecole monitorate, nel plasma sono stati identificati solo 20 metaboliti circolanti, tutti come resti di solfato, glucuronide o glicina, che compaiono in momenti diversi nel plasma a seconda della posizione di assorbimento nel tratto digerente [79].
4.4. Studiare le variabili
Tutte le variabili sono state analizzate quattro volte durante lo studio: all'inizio e alla fine di ogni 16-fase settimanale di consumo del prodotto. Durante lo studio, ai soggetti non è stato permesso di iniziare o modificare alcun trattamento ormonale, né apportare modifiche significative alla dieta o all'attività fisica che potessero influenzare le variabili dello studio.
Misurazioni di campioni di sangue
I soggetti dovevano arrivare dopo un periodo di digiuno di 12 ore, consentendo l'assunzione di acqua solo nelle 3 ore precedenti. L'esercizio di intensità moderata non era consentito 24 ore prima dell'estrazione. I campioni di sangue sono stati raccolti dalla vena antecubitale in una provetta di raccolta del sangue k3E/K3EDTA (3 mL) e provette di raccolta del sangue con gel di siero e attivatore di coaguli (5 mL) *3. Prima di essere inviate al laboratorio (Laboratorios MUNUERA SL Murcia, Spagna), sono state centrifugate solo le provette per il prelievo di sangue con gel di siero e attivatore di coaguli (4500 rpm, 5 min, 4 ◦C). I biomarcatori analizzati per ciascuna variabile erano: (a) Biomarcatori pro-infiammatori: OxLDL (ng/mL) mediante test ELISA in campioni di siero, TNF- (pg/mL) e sNTFR1 (ng/mL) mediante test ELISA competitivo (marchio diagnostico DRG), CRP (mg/L) mediante saggio immunologico turbidimetrico (PETIA) e omocisteina (pg/mL) su un analizzatore BN ProSpec® (secondo il protocollo fornito nel kit Siemens N Latex HCYOPAX 03); (b) vitamine: vitamina E (mcg/mL) mediante HPLC con un cromatografo JASCO (PU-980 IntelligentPLC-Plus) e una colonna Betasil-C18 (dimensione delle particelle 5 µm, 250 × 4,6 mm) collegata a una flfluorescenza JASCO rivelatore (FP-920 Intelligent Fluorescense Detector) e vitamina B12 (pg/mL) mediante chemiluminescenza con saggi immunologici commerciali utilizzando apparecchiature automatizzate Centaur XPSiemens Diagnostics (Siemens Healthcare SA); (c) catecolamine: cortisolo (mcg/L) utilizzando la tecnica della chemuminescenza con il test immunologico Immulite 2000 (DPC, Gwynedd, RU) e noradrenalina (pg/mL), adrenalina (pg/mL) e dopamina (pg/mL) di HPLC con un flusso di 0,5 mL/min, Tº di 35 ◦C, la sensibilità di 20, il potenziale di 0,7, una fase mobile di acetonitrile-acqua e una fase inversa di C18 utilizzando un rivelatore elettrochimico n; (d) ormoni tiroidei: T3 (mcg/L), T4 (mcg/L) e TSH (mU/l) utilizzando l'apparecchiatura automatizzata CentaurXP Siemens Diagnostics (Siemens Healthcare SA); (e) stato immunitario: IgA (mg/L) utilizzando la tecnica della turbidimetria con il test Monolab. Come reagenti, sono stati usati tampone Tris (20 mmol/L), PEG 8000 e pH 8,3 come diluente e siero di capra, IgA anti-umana e pH 7,5 come anticorpo.
4.5. Analisi statistica
Le variabili continue sono presentate come media ± deviazione standard (DS) al basale e nella loro evoluzione, applicando il test di Kolmogorov-Smirnov per verificare la distribuzione normale dei dati discontinui. L'analisi è stata eseguita per tutti i soggetti che hanno partecipato allo studio, sia nel periodo di assunzione del prodotto che del placebo. Per le variabili quantitative è stato eseguito un confronto del test t di Student tra i due rami dello studio. Per analizzare le differenze tra i gruppi (EXT e PLA) nell'evoluzione delle diverse variabili, è stata eseguita un'analisi della varianza a misure ripetute con il tempo come fattore intrasoggetto. In questo modo sono state stabilite differenze per ciascuna variabile analizzata, tenendo conto di questi fattori. Per l'analisi post-hoc è stato effettuato un test Bonferroni. Sono state confrontate differenze significative (con la possibilità di assumere o meno l'uguaglianza della varianza). Nell'insieme dei test statistici, il livello di significatività scelto era 0.05. L'analisi statistica è stata eseguita con il software SPSS 24 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA).
5. Conclusioni
La nostra ricerca ha mostrato che il consumo cronico di un estratto polifenolico a base di bacche, frutta e verdura in una popolazione sana che non mangia le quantità raccomandate di frutta e verdura al giorno migliora lo stato ossidativo e l'infiammazione attraverso un miglioramento di diversi biomarcatori del sangue, in particolare OxLDL, CRP e colesterolo HDL, migliorando anche i valori delle catecolamine, in particolare della dopamina.
Contributi dell'autore: acquisizione di finanziamenti, MPZ e JM; indagine, RA e JM; metodologia, RA, J.Á.C., RX-M., BC, DV, MPZ e JM; amministrazione del progetto, JM; supervisione, JM; convalida, JM; scrittura: revisione e modifica, RA, J.Á.C. e JM Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto.
Finanziamento: questo studio è stato finanziato dalla Juice Plus Company. In nessun momento l'azienda ha collaborato alla progettazione o gestione dei dati ottenuti.
Dichiarazione dell'Institutional Review Board: Questo studio è stato condotto secondo le linee guida della Dichiarazione di Helsinki, approvata dal Comitato Etico dell'Università Cattolica San Antonio di Murcia (UCAM) (data: 24 novembre 2017; codice: CE111702).
Dichiarazione di consenso informato: il consenso informato è stato ottenuto da tutti i soggetti coinvolti nello studio.
Dichiarazione sulla disponibilità dei dati: non necessaria.
Ringraziamenti: Gli autori ringraziano i soggetti per aver partecipato allo studio, così come la JuicePlus Company per il supporto e la promozione della ricerca.
Conflitti di interesse: Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi in merito al presente manoscritto.
Disponibilità del campione: non applicabile.
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