Effetti del recettore ShRNA di tipo I dell'angiotensina II sulla pressione sanguigna e sul rimodellamento ventricolare sinistro nei ratti spontaneamente ipertesi

Astratto:

Questo studio è stato progettato per studiare gli effetti dello shRNA del recettore dell'angiotensina II di tipo I (AT1R) sulla pressione sanguigna e sul rimodellamento ventricolare sinistro nei ratti spontaneamente ipertesi. Dieci ratti Wistar Kyoto (WKY) sono stati usati come un normale gruppo di controllo della pressione sanguigna e 20 ratti ipertesi spontaneamente (SHR) sono stati divisi casualmente nei gruppi sperimentali e di controllo dell'ipertensione. Ai ratti del gruppo sperimentale è stato iniettato l'adenovirus ricombinante shRNA AT1R (Ad5-AT1R-shRNA) attraverso una vena della coda, mentre ai ratti degli altri due gruppi è stato iniettato l'adenovirus ricombinante (Ad5-EGFP ). La pressione arteriosa sistolica (SBP) nell'arteria caudalis del ratto è stata misurata prima e dopo l'iniezione e i tessuti del cuore, del rene, dell'aorta e del surrene sono stati prelevati due giorni dopo l'iniezione ripetuta per osservare la distribuzione di Ad5-AT1R- shRNA al microscopio a fluorescenza. Prima dell'iniezione di Ad5-AT1R-shRNA, la pressione sanguigna del gruppo sperimentale e del gruppo di controllo dell'ipertensione era significativamente superiore a quella del normale gruppo di controllo della pressione sanguigna (P<0.01). After two injections, the blood pressure in the experimental group decreased significantly, and the duration of blood pressure reduction reached 19 days. In the experimental group, the kidney, heart, aorta, and adrenal gland tissues showed vigorous fluorescence expression under the fluorescence microscope. Repeated administration of Ad5- AT1R-shRNA has a long-lasting hypotensive effect on SHR and can significantly improve ventricular remodeling.

Nello studio sperimentale sui ratti, abbiamo anche scoperto che Cistanche ha un effetto protettivo sui reni, che può prevenire danni ai reni e migliorare la funzionalità renale. Tra questi, Cistanche può ridurre la risposta allo stress ossidativo dei glomeruli e dei tubuli renali e ridurre il livello di radicali liberi nel tessuto renale. Inoltre, Cistanche può anche ridurre la risposta infiammatoria dei reni e promuovere la rigenerazione e la riparazione delle cellule renali.

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introduzione

Il rimodellamento ventricolare (o miocardico) è un concetto proposto nello studio della cardiomiopatia ischemica, della cardiopatia ipertensiva, della cardiomiopatia dilatativa e di altre forme di danno cardiaco, che sono principalmente caratterizzate dai cambiamenti dopo il danno miocardico, come l'ipertrofia dei cardiomiociti, l'ipertrofia dei non miociti proliferazione e fibrosi miocardica, e l'espansione della cavità cardiaca e l'aumento del peso del cuore su questa base [1]. L'ipertrofia cardiaca è il cambiamento patologico più comune nell'ipertensione, dove una serie di cambiamenti nella morfologia e nella struttura subcellulari appare spesso nel miocardio ipertrofico.

Uno studio precedente ha confermato che l'eccessiva attivazione del sistema RAS (sistema renina-angiotensina) svolge un ruolo cruciale nel processo patologico del rimodellamento ventricolare ipertensivo, dovuto alla funzione vasopressoria, alla crescita cellulare e all'effetto di promozione della proliferazione [2]. L'Ang II è il principale principio attivo della RAS e può esercitare effetti biologici attivando specificamente AT1R, che ha un'elevata affinità sulla superficie dei fibroblasti cardiaci [3]. Inoltre, l'Ang II ha anche un certo effetto simile a un fattore di crescita e può promuovere direttamente la sintesi di RNA e proteine ​​nei cardiomiociti per promuovere la proliferazione delle cellule fibrose, causando il rimodellamento ventricolare [4].

Inoltre, la tecnologia dell'interferenza dell'RNA si riferisce all'utilizzo di shRNA per produrre RNA attivo a breve interferenza (siRNA) nelle cellule e specificamente lega e degrada l'mRNA di geni bersaglio complementari, per inibire l'espressione del gene bersaglio [5]. Il vettore adenovirus ricombinante (Ad5-AT1R-shRNA), progettato sulla base del principio dell'interferenza dell'RNA, ha bloccato specificamente l'espressione di AT1R e ha esercitato un significativo effetto ipotensivo in precedenti studi antipertensivi condotti dai ricercatori [6-8]. Tuttavia, essendo una forma relativamente nuova di terapia genica per l'ipertensione, non è noto se influisca sul rimodellamento ventricolare causato dall'ipertensione e non sono stati segnalati gli effetti e gli effetti collaterali dell'iniezione endovenosa ripetuta.

Nel presente studio, ratti spontaneamente ipertesi (SHR) sono stati selezionati come soggetti sperimentali, la pressione sanguigna e il rimodellamento ventricolare di SHR sono stati osservati dopo l'iniezione ripetuta di Ad 5- AT1R-shRNA per studiare l'effetto del blocco genico di AT1R indotta da Ad5-AT1R-shRNA sul rimodellamento nell'ipertensione.

Materiali e metodi

Farmaci, reagenti e strumenti

L'Ad5-AT1R-shRNA e il vettore adenovirus ricombinante di controllo (Ad5-EGFP) che trasportano lo shRNA del recettore di tipo 1 dell'angiotensina II (AT1R) sono stati costruiti e sintetizzati da Benyuan-Zhengyang Gene Technology Co., Ltd . (Pechino, Cina). Il kit di rilevamento dell'idrossiprolina (HYA) è stato acquistato dal Nanjing Jiancheng Biological Engineering Institute. Lo strumento per la pressione sanguigna non invasivo per l'arteria della coda di topo (PowerLab, ADInstruments, New South Wales, Australia) è stato fornito dal Laboratorio di Cardiologia del nostro college. I 722 spettrofotometri a reticolo sono stati realizzati dalla Shanghai Third Analytical Instrument Factory (Shanghai, Cina). Il microscopio elettronico a trasmissione (microscopia elettronica a trasmissione di tipo Fei Tecnai G2 12, FEI Company, Hillsboro, OR, USA) è stato fornito dalla Electron Microscope Room del Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology. L'attuale studio è stato approvato dal comitato etico del Tian Jin Chest Hospital.

Raggruppamento e amministrazione degli animali

I ratti maschi adulti SHR e Wistar Kyoto (WKY) avevano tutti 12 settimane di età e pesavano 280-320 g. C'erano 3-5 ratti per gabbia, la temperatura della stanza era mantenuta a 24 ± 2 gradi e l'umidità relativa era mantenuta al 60-65%. È stato fornito un ciclo giorno e notte artificiale 12-h in cui 7:00 AM–7:00 PM indicava la parte illuminata del ciclo e 7:00 PM –7:00 AM indicava la parte oscura del ciclo. I topi potevano mangiare e bere liberamente. I gruppi di ratti includevano un gruppo di controllo della pressione sanguigna normale (gruppo WKY, n=10), un gruppo di controllo dell'ipertensione (gruppo SHR, n=10) e un gruppo sperimentale di ipertensione (gruppo sperimentale, n{ {20}}).

I ratti nel gruppo sperimentale sono stati iniettati per via endovenosa con 1 ml di Ad5-AT1R-shRNA con un titolo di TCID50 1.7 × 109 attraverso una vena della coda, e i ratti nei gruppi SHR e WKY sono stati iniettati per via endovenosa con 1 ml di Ad5-EGFP con un titolo di TCID50 1.7 × 109 attraverso una vena caudale. Il momento dell'iniezione ha avuto luogo all'inizio dell'esperimento e quando la pressione sanguigna era tornata allo stato iniziale dopo la prima iniezione.

Per tutti i ratti di ciascun gruppo sono stati prelevati circa 80-90 g di tessuto miocardico e l'operazione è stata eseguita rigorosamente secondo le istruzioni del kit di rilevamento dell'idrossico3ina.

Misurazione della pressione sanguigna e della frequenza cardiaca e osservazione di animali da esperimento

La pressione arteriosa sistolica (SBP) dell'arteria caudale e la frequenza cardiaca sono state misurate con il metodo tail-cuff in un ambiente tranquillo a 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 e 21 giorni dall'iniezione. La coda di quel topo è stata preriscaldata a circa 40 gradi e fissata in una posizione comoda. Il bracciale di compressione è stato posizionato alla radice della coda del ratto, gonfiato e pressurizzato. Quando la pressione ha raggiunto 270 mm Hg (1 mm Hg=0.133 kPa), la pressione è stata ridotta automaticamente e lentamente e la pressione sanguigna e la frequenza cardiaca sono state registrate dal sistema di esperimenti sulla funzione biologica Medlab collegato a un trasduttore di pressione e un amplificatore. Tutti i ratti sono stati misurati cinque volte continuamente e le medie sono state calcolate e utilizzate come SBP e frequenza cardiaca. L'appetito, l'attività, la temperatura corporea, il peso corporeo (BW) e altre reazioni degli animali sono stati osservati quotidianamente fino alla fine dell'esperimento.

Rilevazione della distribuzione del vettore adenovirus ricombinante nei principali tessuti

Gli animali nel gruppo sperimentale sono stati iniettati con Ad {{0}} AT1R-shRNA marcato con una proteina fluorescente. Due giorni dopo ripetute iniezioni di Ad5-AT1R-shRNA, i tessuti del cuore, del rene, dell'aorta e del surrene del gruppo sperimentale sono stati prelevati e quindi immediatamente preparati in sezioni congelate. L'espressione di fluorescenza è stata osservata al microscopio a fluorescenza. Quando la pressione sanguigna è stata ridotta, alcuni animali sono stati sacrificati e pesati. Gli animali sono stati iniettati per via peritoneale con 0,4 ml/100 g di pentobarbital per l'anestesia e il cuore, il rene, l'aorta e i tessuti surrenali sono stati rimossi rapidamente. Con una lama affilata, questi organi sono stati tagliati in piccoli pezzi di tessuto di 1 × 1 × 1 cm e sono stati inviati al Dipartimento di Patologia, dove sono stati preparati in sezioni congelate. Il loro spessore è stato misurato tra 5 e 8 µm e l'espressione della proteina di fluorescenza è stata osservata al microscopio a fluorescenza per valutare l'assorbimento di Ad5-AT1R-shRNA da parte dei principali organi.

Preparazione di campioni miocardici

Alla fine dell'esperimento, è stato misurato il peso corporeo dei ratti. I ratti sono stati iniettati per via peritoneale con {{0}}.4 ml/100 g di pentobarbital per l'anestesia. Dopo aver aperto il torace, il cuore è stato rapidamente rimosso, i vasi sanguigni circostanti sono stati tagliati, il sangue del cuore è stato asciugato con carta da filtro, è stato pesato l'intero peso umido del cuore (HW) e il rapporto tra peso del cuore e peso corporeo (HW/ BW) è stato calcolato [9, 10]. Alcuni pezzi di tessuto miocardico di 1- mm3 sono stati prelevati dalla regione apicale, sciacquati con 0,1 mol/l di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), quindi fissati inizialmente con glutaraldeide al 2,5% (pH 7,2). Sono stati quindi fissati con una soluzione di tetrossido di osmio all'1% (pH 7,2), disidratati mediante alcool a gradiente ascendente e acetoni, immersi e incorporati con resina epossidica e preparati in sezioni ultrasottili. Altri 60-100 g di miocardio ventricolare sinistro sono stati prelevati per la misurazione di HYA.

Indici di osservazione

Il SBP dell'arteria della coda in uno stato di veglia tranquilla è stato registrato prima dell'iniezione e in tutti i momenti dopo l'iniezione. Sono stati prelevati circa 80-90 g di tessuto miocardico e il contenuto di HYA nel tessuto miocardico è stato rilevato utilizzando un metodo biologico, secondo le istruzioni del kit di rilevamento HYA, e quindi convertito in contenuto di collagene, secondo la formula: collagene contenuto=contenuto HYA × 7,46 [11]. Sono stati registrati il ​​BW e l'HW dei ratti ed è stato calcolato il rapporto HW/BW. Le sezioni ultrasottili sono state colorate con acetato di uranile e citrato di piombo e osservate e fotografate al microscopio elettronico a trasmissione.

Rilevazione dell'espressione dell'mRNA AT1R mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa fluorescente in tempo reale (RT-qPCR)

Alla fine dell'esperimento, {{0}},5 g di tessuto del ventricolo sinistro sono stati prelevati da tutti i gruppi per rilevare l'espressione dell'mRNA AT1R. La sequenza del gene AT1R di ratto è stata selezionata su GenBank (numero di serie NM_030685) e i primer e le sonde sono stati progettati utilizzando Primer Premier 5.0 e sintetizzati da Sangon Biotech (Shanghai, Cina). Il primer a monte AT1R era 5'-ACG ATG CTG GTG GCC AAA GT -3', e il primer a valle era 5'-ATG ATA AGG AAA GGG AAC AAG AAG C -3'. La sequenza della sonda era 5'-ATT ATG AGT CTC GGAATT CGA CGC TCC CCA-3', e la modifica della sonda era 5'-FAM, 3'-TAMRA, 3'-PO4. Il primer -actina a monte era 5'-AGG GAA ATC GTG CGT GAC AT -3', e il primer a valle era 5'-CCA TAC CCA GGA AGG AAG GCT-3'. La sequenza della sonda era 5'-CAC TGC CGC ATC CTC TTC CTC CCT GG-3', e la modifica della sonda era 5'-FAM, 3'-TAMRA, 3'-PO4.

L'RNA totale è stato estratto dai tessuti utilizzando il metodo Trizol one-step e trascritto inversamente in cDNA dal sistema di trascrizione inversa Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV). La preparazione dei campioni della curva standard consisteva nel gene target e nel gene housekeeping (-actina) del campione che doveva essere amplificato mediante PCR (reazione a catena della polimerasi). Il prodotto è stato diluito con un gradiente per creare una curva standard. Il sistema di reazione PCR era costituito da 2 µl di 10 × tampone, 2 µl di MgCl2 e 0,5 µl di dNTP. C'erano {{10}},5 µl di primer a monte, 0,5 µl di primer a valle, 1 µl di sonda, 0,4 µl dell'enzima Taq e 2 µl di templato di reazione e sterilizzato deionizzato è stata aggiunta acqua fino a quando il volume ha raggiunto 20 µl. Il sistema PCR è stato collocato in un tubo PCR fluorescente, è stata eseguita l'amplificazione e i segnali di fluorescenza sono stati raccolti sul rivelatore PCR quantitativo a fluorescenza del gene Rotor. Le condizioni di reazione erano le seguenti: 95 gradi, 5 min; 94 gradi, 5 s; 60 gradi, 30 s per un totale di 45 cicli eseguiti. I segnali fluorescenti sono stati quindi raccolti e i risultati sono stati analizzati.

Per eliminare ulteriormente gli impatti della quantificazione dell'mRNA e dell'efficienza di reazione della PCR sui risultati dell'esperimento, è stata eseguita contemporaneamente la rilevazione quantitativa del numero assoluto di copie del controllo interno -actina, il rapporto tra il numero assoluto di copie di AT1R e -actina è stato utilizzato come espressione relativa del gene AT1R.

analisi statistica

L'analisi statistica dei dati è stata condotta utilizzando il software statistico SPSS 12.0. I dati di misurazione ripetuti tra i tre gruppi sono stati analizzati utilizzando l'analisi della covarianza. Tutti i set di dati hanno soddisfatto le ipotesi per l'esecuzione di ANCOVA. Il test Student-Newman-Keuls (SNK)-q è stato utilizzato per confronti multipli tra medie di più gruppi. I dati in tutti i gruppi sono stati espressi come media ± SD. P<0.05 was considered statistically significant.

Risultati

Ad5-AT1R-shRNA ha ridotto significativamente SBP in SHR

Prima dell'iniezione, la SBP era significativamente più alta nel gruppo sperimentale e quella del gruppo SHR era più alta che nel gruppo WKY (P<0.05). Twenty-four hours after the first injection, SBP was significantly lower in the experimental group than in the SHR group (P<0.01), and="sbp=" did=" not=" decrease=" significantly=" in=" the=" shr=" group=" wky=" p=">0.05). Dopo la prima iniezione di Ad5-AT1R-shRNA, l'effetto ipotensivo è durato per cinque giorni nel gruppo sperimentale e la pressione sanguigna è tornata al settimo giorno. Dopo la seconda iniezione, la pressione sanguigna è diminuita di nuovo in modo significativo e la durata è stata più lunga di quella dopo la prima iniezione, della durata di 14 giorni (Fig. 1). Le reazioni locali e sistemiche degli animali sono state osservate ogni giorno e non sono state riscontrate anomalie, come anoressia, perdita di peso e aumento della temperatura. Non ci sono stati cambiamenti significativi nella frequenza cardiaca nei tre gruppi e le differenze tra i tre gruppi non erano statisticamente significative.

Ad5-AT1R-shRNA riduce significativamente l'espressione dell'mRNA di AT1R nel tessuto cardiaco

Per verificare se Ad5-AT1R-shRNA ha l'effetto dell'interferenza dell'RNA sull'espressione dell'mRNA di AT1R nei tessuti, il 21° giorno dopo l'iniezione di Ad5-AT1RshRNA, l'RNA totale del tessuto cardiaco è stato estratti in tutti i gruppi. Dopo la trascrizione inversa in cDNA, il numero di copie dei geni è stato rilevato mediante PCR quantitativa in fluorescenza in tempo reale. I risultati della curva di amplificazione della PCR hanno rivelato che l'espressione dell'mRNA AT1R nel gruppo sperimentale era significativamente inferiore a quella del gruppo di controllo dell'ipertensione. Inoltre, la differenza era statisticamente significativa (P<0.05, Fig. 2).

Distribuzione di Ad5-AT1R-shRNA nei tessuti

L'adenovirus ricombinante marcato con fluorescenza è stato distribuito nel cuore, nei reni, nell'aorta e nei tessuti surrenali dopo 2 giorni di iniezione ripetuta di Ad 5- AT1RshRNA (Fig. 3). Poiché AT1R era ampiamente distribuito nel tessuto, i risultati di questo studio erano coerenti con la distribuzione in vivo di AT1R.

Ad5-AT1R-shRNA riduce significativamente l'ipertrofia miocardica in SHR

La condizione di ipertrofia miocardica nei ratti può essere riflessa misurando l'HW e il rapporto HW/BW. Misurando il peso cardiaco e il peso corporeo dei ratti, questo studio ha rivelato che HW e HW/BW erano significativamente più alti nel gruppo SHR rispetto a quelli del gruppo WKY (P<0.01). The result suggests that there was obvious myocardial hypertrophy in untreated SHR. On the 21st day after Ad5-AT1R-shRNA injection, HW and HW/ BW were lower in the experimental group than in the SHR group (P<0.05) (Fig. 4).

Ad5-AT1R-shRNA può ridurre il grado di fibrosi miocardica in SHR

I contenuti di HYA e collagene erano significativamente più alti nel gruppo SHR che nel gruppo WKY (P<0.01). These results suggest that obvious myocardial fibrosis has been found in the cardiac ventricle in the SHR group. The contents of HYA and collagen were significantly lower in the SHR group than in the SHR group (P<0.01) (Fig. 5).

Ad5-AT1R-shRNA migliora significativamente l'ultrastruttura miocardica di SHR

L'osservazione ultrastrutturale del miocardio mediante microscopio elettronico a trasmissione ha mostrato che nel gruppo WKY la membrana nucleare delle cellule miocardiche era intatta, le miofibrille erano pulite, la disposizione era ordinata, le linee trasversali erano chiare, i mitocondri erano chiari e la loro nessuna proliferazione di fibre di collagene nell'interstizio miocardico (Figg. 6A e B). Nel gruppo SHR, la membrana nucleare delle cellule del miocardio non era intatta, le miofibrille erano sfocate e la disposizione era irregolare, alcuni dei miofilamenti erano scomparsi. Si poteva vedere che le linee trasversali non erano chiare e che i mitocondri erano gonfi e accumulati. Inoltre, in esso si sono formati vacuoli e nell'interstizio miocardico sono stati osservati un gran numero di iperplasia del reticolo endoplasmatico e proliferazione di fibre di collagene (Figg. 6C e D). Rispetto ai gruppi WKY e SHR, nel gruppo sperimentale, la membrana nucleare delle cellule miocardiche era relativamente intatta, le miofibrille erano chiare, la disposizione era relativamente ordinata, le linee trasversali erano chiare ei mitocondri non erano gonfi. Tuttavia, il numero di mitocondri è aumentato nelle regioni locali e non vi è stata alcuna evidente proliferazione di fibre di collagene nell'interstizio miocardico (Figg. 6E e F).

Discussione

Nel presente studio, abbiamo scoperto che l'Ad5-AT1R-shRNA potrebbe ridurre significativamente la pressione sanguigna di SHR e ridurre l'espressione dell'mRNA di AT1R nel tessuto cardiaco. Il vettore adenovirus ricombinante ha un certo effetto di targeting, che può essere assorbito dal tessuto contenente AT1R dopo l'iniezione nella vena della coda. Inoltre, Ad5-AT1R-shRNA potrebbe ridurre l'ipertrofia miocardica in SHR, migliorare la fibrosi miocardica in SHR inibendo l'espressione di AT1R e migliorare i cambiamenti ultrastrutturali del miocardio in SHR.

Nei ratti normali, SBP è 110-120 mmHg, e in SHR, SBP può essere superiore a 200 mmHg. L'incidenza dell'ipertensione era del 100% e questi ratti indicavano anche una malattia cardiovascolare ipertensiva. Pertanto, questo tipo di ratto è adatto allo studio dell'ipertensione umana. I ratti spontaneamente ipertesi di solito iniziano a mostrare ipertrofia ventricolare sinistra all'età di 10 settimane, che si aggrava progressivamente con l'età, il contenuto di collagene nel miocardio aumenta in modo significativo e si verificano fibrosi miocardica e rimodellamento interstiziale miocardico [12, 13]. Il presente studio ha rivelato che rispetto ai ratti WKY di 16-settimane, HW, HW/BW, il contenuto di HPA e collagene nel miocardio aumentava significativamente nell'SHR di 16-settimane. L'aumento di HW e HW/BW riflette la proliferazione e l'ipertrofia dei cardiomiociti e l'aumento del peso cardiaco.

Inoltre, HYA è unico per le fibre di collagene e il suo contenuto può riflettere il contenuto di collagene e il grado di fibrosi. Inoltre, i risultati dell'esame al microscopio elettronico hanno rivelato che nel gruppo SHR la membrana nucleare delle cellule miocardiche non era intatta, le miofibrille erano sfocate, la disposizione era irregolare, alcuni dei miofilamenti erano scomparsi, le linee trasversali non erano chiare, i mitocondri erano gonfi e accumulato, e in esso si formarono dei vacuoli. Nell'interstizio miocardico sono stati osservati un gran numero di iperplasia del reticolo endoplasmatico e proliferazione di fibre di collagene. I risultati hanno rivelato che il rimodellamento ventricolare era evidente nell'SHR di 16-settimane.

Gli studi sulla terapia genica per l'ipertensione hanno rivelato che l'inibizione antisenso delle espressioni di AT1R e di altri membri del sistema RAS aveva ridotto la pressione sanguigna e migliorato i cambiamenti patologici del cuore in SHR [14, 15]. I risultati di studi precedenti hanno rivelato che lo shRNA era altamente espresso nei tessuti renali, cardiaci, epatici, aortici e surrenali. Questo è simile ai risultati di questo studio. Inoltre, l'Ad5-ACE-AT1R-shRNA può migliorare l'ultrastruttura dei cardiomiociti e ridurre la pressione sanguigna riducendo le espressioni di ACE e AT1R.

Allo stesso modo, la tecnologia di interferenza dell'RNA è stata utilizzata in precedenti esperimenti condotti da altri ricercatori [16], in cui l'espressione genica di AT1R è stata inibita dall'infusione nella vena caudale di Ad5-AT1RshRNA, che ha ridotto la pressione sanguigna. Abbiamo tentato di invertire l'ipertrofia ventricolare sinistra e la fibrosi miocardica attraverso la terapia genica. Il presente studio ha rivelato che dopo ripetute iniezioni di Ad5-AT1RshRNA, la pressione sanguigna in SHR non solo ha dimostrato un evidente effetto ipotensivo, ma ha anche avuto l'effetto di sovrapposizione, ovvero l'ampiezza e la durata dell'effetto ipotensivo dopo il secondo iniezione erano significativamente più alti di quelli dopo la prima iniezione. I risultati suggeriscono che l'effetto dell'iniezione ripetuta di Ad5-AT1R-shRNA è migliore. L'HW, l'HW/BW e il contenuto di HYA e collagene nel cuore erano significativamente inferiori nel gruppo sperimentale rispetto al gruppo SHR. I risultati dell'esame al microscopio elettronico hanno anche rivelato che il danno miocardico era significativamente più leggero nel gruppo sperimentale rispetto al gruppo SHR e l'espressione dell'mRNA AT1R era significativamente inferiore nel gruppo sperimentale rispetto al gruppo SHR.

Tutti questi risultati hanno rivelato che Ad5-AT1RshRNA ha prodotto l'effetto dell'interferenza dell'RNA, che ha bloccato una serie di effetti biologici della combinazione di Ang II e AT1R indotti dall'ipertensione e dal rimodellamento ventricolare, suggerendo che questa terapia genica può ridurre non solo la pressione sanguigna ma anche migliorare il rimodellamento ventricolare in SHR. Il livello plasmatico di angiotensina II aumenterebbe bloccando il gene del recettore di tipo 1 dell'angiotensina II. Gli effetti classici dell'angiotensina II sui suoi organi bersaglio sono principalmente mediati da due recettori di membrana, i recettori di tipo 1 (AT1R) e i recettori di tipo 2 (AT2R), che mediano funzioni diverse. È stato dimostrato che AT1R promuove la crescita e la proliferazione, come la vasocostrizione, l'aumento della pressione arteriosa e la contrattilità cardiaca, e media gli effetti dannosi, tra cui la disfunzione endoteliale, le malattie cardiovascolari e l'infiammazione.

Al contrario, si ritiene che AT2R induca effetti opposti, inibisca la crescita, promuova l'apoptosi, la vasodilatazione e l'ipotensione e prevenga il rimodellamento cardiovascolare [17]. Dopo ripetute iniezioni, il vettore adenovirus non ha prodotto reazioni avverse evidenti e l'effetto ipotensivo è stato più duraturo. Alla fine dell'esperimento, nel gruppo sperimentale, la pressione sanguigna è tornata sostanzialmente allo stato iniziale. Tuttavia, l'espressione di AT1R nel miocardio era inferiore a quella del gruppo SHR. Ciò non suggerisce che il cambiamento della pressione sanguigna sia direttamente correlato all'espressione di AT1R nel miocardio. Si ipotizza che il sistema RAS del tessuto locale sia principalmente coinvolto nel ruolo della fibrosi tissutale.

Una limitazione di questo studio era che la pressione sanguigna doveva essere misurata in modo invasivo con radiotelemetria, o almeno da un sistema collegato, ma a causa di problemi tecnici, potevamo usare solo misurazioni della pressione sanguigna con il polsino della coda, che non era molto affidabile.

Conclusione

La terapia genica che utilizza la tecnologia RNAi per inibire l'espressione di AT1R non solo può essere utilizzata come nuovo metodo per ridurre la pressione sanguigna, ma dovrebbe anche essere un nuovo metodo per migliorare il rimodellamento miocardico e l'insufficienza cardiaca. Tuttavia, al momento, questa nuova tecnologia è limitata alla ricerca sugli animali. La sicurezza e l'efficacia della sua applicazione nel trattamento umano devono essere ulteriormente studiate. Ad esempio, la sicurezza e l'efficienza del vettore di trasduzione e se questa strategia di terapia genica può essere applicata ad altri tipi di alterazioni miocardiche richiedono ulteriori studi.

Riferimenti

1. Suthahar N, Meijers WC, Silljé HHW, de Boer RA. Dall'infiammazione alla fibrosi: meccanismi molecolari e cellulari del rimodellamento del tessuto miocardico e prospettive sulle opportunità di trattamento differenziale. Curr Heart Fail Rep. 2017; 14: 235-250. [Linea mediana] [CrossRef]

2. Hasan HF, Radwan RR, Galal SM. Il fattore di potenziamento della bradichinina isolato dal veleno dello scorpione Leiurus quinquestriatus allevia la cardiomiopatia nei ratti irradiati attraverso il rimodellamento della via RAAS. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2020; 47: 263-273. [Linea mediana] [CrossRef]

3. Harvey A, Montezano AC, Lopes RA, Rios F, Touyz RM. Fibrosi vascolare nell'invecchiamento e nell'ipertensione: meccanismi molecolari e implicazioni cliniche. Può J Cardiol. 2016; 32: 659–668. [Linea mediana] [CrossRef]

4. Wu J, Montaniel KR, Saleh MA, Xiao L, Chen W, Owens GK, et al. Origine delle cellule produttrici di matrice che contribuiscono alla fibrosi aortica nell'ipertensione. Ipertensione. 2016; 67: 461-468. [Linea mediana] [CrossRef]

5. Lu M, Xing H, Xun Z, Yang T, Ding P, Cai C, et al. Consegna di piccoli RNA basati su esosomi: progressi e prospettive. Asiatico J Pharm Sci. 2018; 13: 1–11. [Linea mediana] [CrossRef]

6. Xiao C, Qiu L, Zen Q. Costruzione di shRNA mirata ai recettori di tipo 1 dell'angiotensina II di ratto e al suo RNAi nel citoplasma. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 2006; 26: 4–8. [Linea mediana] [CrossRef]

7. Xiao CS, Zhang JL, Qiu L. [Gli effetti dello shRNA mirato al recettore di tipo 1 dell'angiotensina II sulla pressione sanguigna e sull'espressione dell'mRNA AT1R nei ratti spontaneamente ipertesi]. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 2007; 35: 354–358 cinese. [linea mediana]

8. Zhang JQ, Sun HL, Ma YX, Wang DW. [Effetti dell'interferenza dell'RNA mirata al recettore dell'angiotensina 1a sulla pressione sanguigna e sull'ipertrofia cardiaca dei ratti con ipertensione 2K1C]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2006; 86: 1138–1143. [linea mediana]

9. Reaves PY, Wang HW, Katovich MJ, Gelband CH, Raizada MK. Attenuazione dell'ipertensione mediante somministrazione sistemica di vettore retrovirale contenente cDNA antisenso del recettore dell'angiotensina II di tipo I. Metodi. 2000; 22: 211–218. [Linea mediana] [CrossRef]

10. Guo K, Lan CZ, Yu TT, Huang LL, Wang XH, Pan C, et al. Effetti della formula Xin-Ji-Er-Kang sull'ipertensione indotta da 2K1C e sul rimodellamento cardiovascolare nei ratti. J Etnofarmaco. 2014; 155: 1227–1235. [Linea mediana] [CrossRef]

11. Paulis L, Matuskova J, Adamcova M, Pelouch V, Simko J, Krajcirovicova K, et al. Regressione dell'ipertrofia ventricolare sinistra e rimodellamento aortico in ratti ipertesi con carenza di NO: effetto della L-arginina e dello spironolattone. Acta Physiol (Oxf). 2008; 194: 45–55. [Linea mediana] [CrossRef]

12. Kang L, Ge CJ, Hu SJ. L'effetto benefico dell'atorvastatina sul rimodellamento ventricolare sinistro nei ratti spontaneamente ipertesi. Farmacologia. 2007; 80: 120–126. [Linea mediana] [CrossRef]

13. Bessa ASM, Jesus ÉF, Nunes ADC, Pontes CNR, Lacerda IS, Costa JM, et al. La stimolazione dell'asse ACE2/Ang-(1-7)/Mas nei ratti gravidi ipertesi attenua la disfunzione cardiovascolare nella prole maschile adulta. Ris. Hypertens. 2019; 42:1883–1893. [Linea mediana] [CrossRef]

14. Kimura B, Mohuczy D, Tang X, Phillips MI. Attenuazione dell'ipertensione e dell'ipertrofia cardiaca da parte del virus adeno-associato che fornisce l'antisenso dell'angiotensinogeno. Ipertensione. 2001; 37: 376-380. [Linea mediana] [CrossRef]

15. Zhou H, Bian YF, Li ML, Gao F, Xiao CS. [Effetti dell'interferenza dell'RNA mirata al recettore dell'angiotensina 1 e all'enzima di conversione dell'angiotensina sulla pressione sanguigna e sul rimodellamento miocardico nei ratti spontaneamente ipertesi]. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 2010; 38: 60-66 (in cinese). [linea mediana]

16. Raja MAG, Katas H, Amjad MW. Progettazione, meccanismo, consegna e terapia del siRNA canonico e del substrato Dicer. Asiatico J Pharm Sci. 2019; 14: 497–510. [Linea mediana] [CrossRef]

17. Dasgupta C, Zhang L. Recettori dell'angiotensina II e scoperta di farmaci nelle malattie cardiovascolari. Drug Discov oggi. 2011; 16: 22–34. [Linea mediana] [CrossRef]

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