Effetti di diverse parti estratte di Cistanche Deserticola sugli effetti ipoglicemizzanti dei topi neri Db/Db Ⅱ

2 Metodi sperimentali

2.1 Preparazione dei prodotti trasformati di Cistanche deserticola Cistanche deserticola:

Prendere il materiale medicinale Cistanche deserticola, lavare via le impurità, cuocere a vapore in una pentola a pressione normale per 2 ore, tagliare in pezzi di 6 mm e asciugare a 70 gradi. Cistanche deserticola: prendere pezzi di decotto di Cistanche deserticola, aggiungere la quantità adeguata di vino di riso, mescolare bene, inumidire per 8 ore (vino di riso giallo: acqua=1:1), cuocere a vapore ad alta pressione per 4 ore e asciugare a 70 gradi. (Utilizzare 30 ml di vino di riso per ogni 100 g di Cistanche deserticola).

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2.2 Arricchimento di diverse parti estratte di Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

Prendere 30 g di polvere di Cistanche deserticola/Tamarococcus deserticola, aggiungere 10 volte la quantità di acqua, scaldare e rifluire per l'estrazione due volte, 2 ore ogni volta, unire gli estratti, concentrare, aggiungere etanolo fino a quando la gradazione alcolica raggiunge il 60%, precipitare a a bassa temperatura per 12 ore e filtrare con aspirazione. , il precipitato è la parte grezza del polisaccaride. Concentrare il surnatante ad una concentrazione appropriata, applicarlo alla resina di adsorbimento macroporosa D101 ed eluirlo in sequenza con acqua ed etanolo di diverse concentrazioni. Raccogliere l'eluato di acqua e concentrarlo sotto pressione ridotta fino a ottenere una pasta densa, che costituisce la frazione oligosaccaridica totale; lavare con etanolo al 40%. Deliquidare, concentrare ed essiccare a pressione ridotta la frazione glicosidica totale di Cistanche deserticola.

2.3 Determinazione del contenuto di diverse parti estratte di Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

2.3.1 Determinazione del contenuto totale di polisaccaridi di Cistanche deserticola/Cistanche deserticola.

Pesare il campione di glucosio 20. 00 mg in un matraccio tarato da 50 mL per ottenere 0. Per una soluzione standard di glucosio da 4 mg·ml-1, pipettare rispettivamente 3, 4, 5, 6 e 7 ml in un matraccio tarato da 50 ml, diluire a volume con acqua e pipettare 2,0 ml di ciascuna soluzione di glucosio in gradiente di concentrazione in una provetta. Prendere un'altra quantità uguale di acqua distillata come controllo in bianco, aggiungere 1 ml di fenolo al 5% in ciascuna provetta, agitare bene, aggiungere rapidamente 5 ml di acido solforico concentrato, lasciare agire per 10 minuti, immergere il tutto in un bagnomaria a 40 gradi per 15 minuti, estrarlo, raffreddarlo rapidamente a temperatura ambiente e misurare il valore di assorbanza a 490 nm, prendere l'assorbanza (A) come ordinata e la concentrazione di glucosio (C) come ascissa, tracciare una curva standard e ottenere il equazione di regressione Y=8.37X-0.162 8 (R2=0.994 6). Pesare accuratamente 1,0 g della polvere totale di polisaccaridi delle materie prime e dei prodotti, collocarli rispettivamente in matracci tarati da 50 ml, aggiungere acqua per sciogliere e regolare il volume fino alla tacca, aspirare accuratamente 2,0 ml in una provetta e misurare nella stessa modo come il metodo di preparazione della curva standard. , questo è tutto.

2.3.2 Determinazione del contenuto di betaina in Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

2.3.2.1 Preparazione della soluzione di riferimento:

Pesare accuratamente 1,17 mg della soluzione di riferimento di betaina, metterla in un matraccio tarato da 5 mL, aggiungere il 50% di metanolo per sciogliere e diluire a volume ed è pronto.

2.3. 2． 2 Condizioni cromatografiche

La colonna cromatografica è Ecosil {{0}}AMINO (4,6 mm×250 mm, 5 μm), fase mobile: acetonitrile-acqua (99,5 ∶ 0,5) , temperatura della colonna: 30 gradi, lunghezza d'onda di rilevamento: 194 nm, portata: 0,6 mL·min-1, volume di iniezione 10 μL, cromatogramma mostrato nella Figura 1. 2.3.2.3 Preparazione della soluzione test Precisely pesare la polvere della frazione oligosaccaridica totale dei prodotti grezzi e finiti 1,0 g, rispettivamente posta in un matraccio tarato da 5 mL, aggiungere acqua distillata per sciogliere e diluire a volume, agitare bene, passare attraverso 0,45 μL di membrana filtrante microporosa ed è pronto.

2.3.2.4 Determinazione del contenuto del campione

Assorbire con precisione la soluzione di prova dell'oligosaccaride totale in Cistanche deserticola grezza e preparata, misurarla secondo le condizioni riportate in "2.3.2.2" e calcolare il contenuto di betaina nel campione.

2.3.3 Determinazione del contenuto di echinacoside, verbascoside ed eterocimicifugarina in Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

2.3.3.1 Preparazione della soluzione di riferimento

Pesare con precisione 4,50 mg di echinacoside, 4,80 mg di verbascoside e 5,05 mg di comimicina eterologa in matracci tarati da 5 ml, aggiungere metanolo al 50% per sciogliere e diluire fino alla tacca e prelevare ciascun controllo Mettere 200 μL della soluzione campione nell'iniezione fiala, aggiungere 400 μL di metanolo al 50% e mescolare bene per ottenere una soluzione di riferimento mista, agitare bene ed è pronta.

2.3.3.2 Condizioni cromatografiche

La colonna cromatografica è Ecosil C18 (4,6 mm×250 mm, 5 μm), metanolo è la fase mobile A, 0.1% acido formico è la fase mobile B, eluizione con gradiente, {{ 12}}~45 min, 30% A→ 70% A, la portata è 1,0 ml·min-1, la temperatura della colonna è 30 gradi, la lunghezza d'onda di rilevamento è 330 nm, il volume di iniezione è 10μL e il cromatogramma è mostrato nella Figura 2.

2.3.3.3 Preparazione della soluzione di prova

Pesare esattamente 1,0 g della polvere totale di glicosidi delle materie prime e dei prodotti, collocarli in matracci tarati da 100 ml, aggiungere il 50% di metanolo per sciogliere, regolare il volume fino alla tacca e agitare BENE. Prelevare con precisione 5 mL di ciascun campione in un matraccio tarato da 10 mL, aggiungere il 50% di metanolo per ripristinare il volume, agitare bene e passare attraverso una membrana filtrante microporosa da 0,45 μm per ottenere.

2.3.3.4 Determinazione del contenuto del campione

Prelevare con precisione il campione di glicosidi totali di Cistanche deserticola e misurarlo secondo le condizioni riportate al punto "2.3.3.2". Calcolare il contenuto di echinacoside, verbascoside e complice eterologo nel campione.

2.4 Raggruppamento di animali, modellizzazione e somministrazione di farmaci

La stanza degli animali ha 12 ore di luce e 12 ore di buio, un'umidità relativa dal 50% al 70% e una temperatura ambiente compresa tra 18 e 22 gradi. Topi neri db/db e topi neri db/m (gruppo di controllo normale) sono stati alimentati normalmente con mangime normale e l'esperimento è iniziato a 9 settimane di età. Ad eccezione del gruppo di controllo normale, i restanti topi neri db/db sono stati selezionati casualmente in base ai livelli di zucchero nel sangue e al peso corporeo. Diviso in 8 gruppi, vale a dire gruppo modello, gruppo di controllo positivo, gruppo Cistanche deserticola polisaccaridi totali, gruppo Cistanche deserticola oligosaccaridi totali, gruppo Cistanche deserticola glucosidi totali, gruppo Tartschistanche deserticola polisaccaridi totali, gruppo Tarthouse deserticola oligosaccaridi totali, gruppo gruppo Tartschistanche deserticola glucosidi totali. Fatta eccezione per il normale controllo

Ad eccezione del gruppo modello e del gruppo modello, ai ratti degli altri gruppi è stata somministrata la somministrazione intragastrica alla dose di 2 ml/100 g per 4 settimane consecutive. La concentrazione del liquido era 4,1 g·kg-1. Il gruppo di controllo normale e il gruppo modello sono stati trattati allo stesso modo. Somministrare allo stomaco una certa quantità di soluzione salina.

2.5 Effetti di diverse parti estratte di Cistanche deserticola sui livelli di glucosio nel sangue di topi neri db/db

2.5.1 Test di tolleranza al glucosio orale (OGTT).

Dopo 26 giorni di somministrazione, sono stati a digiuno per 12 ore e, 60 minuti dopo la somministrazione del giorno successivo, ai topi neri di ciascun gruppo sono stati somministrati 2,0 g·kg-1 glucosio rispettivamente a 0, {{10}}.5, 1.0 e 2. .0 h è stato prelevato sangue dalla vena della coda per misurare il valore della glicemia. Con il valore della glicemia come ordinata e il tempo come ascissa, è stato creato un grafico delle variazioni della glicemia e l'area sotto la linea della curva della glicemia di ciascun gruppo sperimentale è stata calcolata secondo la formula (AUC, hmmoL·L{ {13}}) [19]. AUC=A × {{20}}.25 + B × 0.50 + C × 0.75 + D. Nella formula: A, B, C e D sono i valori della glicemia a 0, 0,5, 1,0 e 2,0 h rispettivamente.

2.5.2 Calcolo dell'indice di resistenza all'insulina e dell'indice di arteriosclerosi

L'indice di resistenza all'insulina è stato calcolato secondo il metodo della letteratura [20]: HOMA-IR=Glucosio × Insulina / 22. 5. HOMA - =20 × Insulina / (Glucosio - 3.5) × 100%. IR è la resistenza all'insulina e (%) è la funzione cellulare. L'unità molare del glucosio è mmoL·L-1

. L'insulina viene somministrata in mU·L-1. I valori di glucosio e insulina vengono misurati durante il digiuno. L'indice di arteriosclerosi (indice aterogenico) è stato calcolato secondo il metodo descritto da Zheng et al. [21]. Metodo di calcolo: indice aterogenico=(TC-HDL-C) / HDL-C.

2.5.3 Effetti di diverse parti estratte di Cistanche deserticola/Cistanche deserticola su INS sierici e HbA1c di topi neri db/db

Prelevare i campioni di siero congelati e portarli a temperatura ambiente prima di utilizzarli per i test con i kit di dosaggio immunoenzimatico INS e HbA1c. Seguire scrupolosamente i metodi e i passaggi indicati nelle istruzioni del kit.

2.6 Effetti di diverse parti estratte di Cistanche deserticola/Cistanche deserticola sul livello di stress ossidativo del fegato di topi neri db/db

Prelevare i campioni di siero congelati e portarli a temperatura ambiente prima di utilizzarli per i test con i kit di dosaggio immunoenzimatico MDA e SOD. Seguire scrupolosamente i metodi e i passaggi indicati nelle istruzioni del kit.

2.7 Effetti di diverse parti estratte di Cistanche deserticola/Cistanche deserticola sul metabolismo dei grassi epatici di topi neri db/db

I livelli di TG, TC, HDL-C e LDL-C nel siero di ratto sono stati misurati utilizzando i kit pertinenti. Per le fasi di misurazione specifiche, fare riferimento alle istruzioni del kit.

2.8 Effetti di diverse parti estratte di Cistanche deserticola/Ratiana canfora su UA, Cr e mALB nel plasma e nelle urine di topi neri db/db

Prelevare campioni di plasma e urina congelati e portarli a temperatura ambiente prima di utilizzarli per testare i kit di dosaggio immunoenzimatico UA, Cr e mALB. Seguire scrupolosamente i metodi e i passaggi indicati nelle istruzioni del kit.

2.9 Osservazione di sezioni patologiche pancreatiche e renali mediante colorazione HE

I tessuti del pancreas e dei reni immersi nel fissativo di paraformaldeide al 10% per 24 ore sono stati rimossi, lavati con acqua distillata e conservati in etanolo al 70%. I campioni di tessuto sono stati rimossi, disidratati con etanolo graduato, purificati, inclusi in paraffina, sezionati e quindi colorati con ematossilina ed eosina (colorazione H&E). Dopo che la colla della sezione si è asciugata, utilizzare un sistema di imaging digitale ad alta risoluzione per osservare e scattare foto delle sezioni.

2.10 Determinazione del collagene di tipo IV del tessuto renale mediante immunoistochimica

Per l'espressione, le sezioni renali sono state deparaffinate in acqua e quindi sottoposte al recupero dell'antigene. Sono stati bloccati con siero di capra al 10% e incubati con l'anticorpo primario a 4 gradi durante la notte. Dopo il lavaggio, l'anticorpo secondario è stato incubato. La soluzione attuale era DAB per lo sviluppo del colore. Il lavaggio, la disidratazione e la sigillatura sono stati eseguiti al microscopio ottico. Osservare l'espressione della proteina del collagene di tipo IV nel tessuto renale.

2.11 Metodi statistici

Utilizzo del software GraphPad Prism versione 5.01 (2007, GraphPad Software re inc) per analizzare i dati e i risultati

Il risultato è media±SEM Indica che la differenza tra i due gruppi è unidirezionale

Metodo ＡＮＯＶＡ( ｏｌｌｏｅｄｅＢｏｎｅｒｒｎｎ′ test di una coppia di colonne), P<0.05 is a significant difference and has statistical significance.