Effetti dei flavonoidi sulla pelle in base alle loro caratteristiche strutturali: una rassegna

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Astratto:Sfondo: durante l'infarto del miocardio (IM), si perdono miliardi di cardiomiociti. La terapia ottimale dovrebbe sostituire efficacemente i cardiomiociti danneggiati, possibilmente con cellule staminali in grado di innestare e differenziarsi in cardiomiociti funzionali adulti. Pertanto, le cellule staminali dell'appendice atriale cardiaca (CASC) sono candidati idonei. Tuttavia, la presenza di livelli elevati di prodotti finali della glicazione avanzata (AGE) nelle regioni cardiache in cui vengono trapiantati i CASC può influenzare il loro potenziale rigenerativo. In questo studio, esaminiamo se e come gli AGE alterano le proprietà dei CASC in vitro. Metodi e risultati: I CASC in coltura sono stati esposti a concentrazioni di AGE variabili (da 50 ug/mL a 400 ug/mL). La sopravvivenza, la proliferazione e la capacità di migrazione dei CASC erano significativamente diminuite dopo 72 ore di esposizione agli AGE. L'apoptosi è aumentata significativamente con l'aumento della concentrazione di AGE. Gli effetti dannosi di questi AGE sono stati parzialmente attenuati dalla pre-incubazione con un recettore per gli AGE (RAGE) inibitore (25μM FPS-ZM1), indicando il coinvolgimento di RAGE negli effetti negativi osservati. Conclusione: gli AGE hanno un effetto negativo dipendente dal tempo e dalla concentrazione sulla sopravvivenza, proliferazione, migrazione e apoptosi dei CASC in vitro, parzialmente mediato dall'attivazione di RAGE. Se le terapie anti-AGE siano un trattamento efficace nell'ambito della terapia con cellule staminali dopo l'infarto del miocardio merita un ulteriore esame.

Parole chiave:cellule staminali; aldeide deidrogenasi; CASC; proteine ​​glicate; prodotti finali di glicazione avanzata; proliferazione; apoptosi; migrazione; RAGE inibizione

1. Introduzione

La malattia coronarica (CHD) rimane la principale causa di mortalità e morbilità in tutto il mondo, con l'infarto del miocardio (IM) che è la forma più comune di CHD [1]. L'IM deriva dall'occlusione completa o parziale di un'arteria coronaria. Nell'area ischemica, ossigeno e nutrienti sono limitati, con conseguente morte delle cellule del miocardio. La dimensione dell'infarto dipende da molteplici fattori, come la dimensione dell'area ischemica a rischio, la posizione e la durata dell'occlusione coronarica e la quantità di flusso sanguigno collaterale residuo[1,2]. Poiché i cardiomiociti adulti hanno proprietà rigenerative minime, la riparazione intrinseca del tessuto danneggiato rimane sfuggente. Trovare un approccio terapeutico che sostituisca efficacemente la cicatrice miocardica con il tessuto contrattile funzionale è l'unica opzione per recuperare il tessuto cardiaco perso.quanta cistanche prendereMolti sforzi di ricerca sono stati profusi per svelare il potenziale terapeutico e i meccanismi della terapia cellulare con cellule del midollo osseo (BMC). Il midollo osseo contiene cellule staminali ematopoietiche (HSC), cellule progenitrici endoteliali (EPC) e cellule staminali mesenchimali (MSC)[3]. Gli studi clinici con BMC e MSC mononucleati non sono riusciti a fornire miglioramenti significativi nella funzione cardiaca post-IM. Poiché le BMC e le MSC mononucleate non si differenziano in cardiomiociti, è probabile che i limitati miglioramenti osservati siano attribuiti a meccanismi paracrini[4,5]. Per migliorare significativamente la funzione cardiaca post-IM, il focus della ricerca si è spostato sulle cellule staminali cardiache (CSC) residenti come c-kit plus , Sca-1 plus , Isl-1 plus -cells e cardiospheres, che potrebbero essere preprogrammati per diventare cardiomiociti. Tuttavia, il loro successo nella rigenerazione cardiaca è scarso [6].

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Negli ultimi anni, il nostro gruppo di ricerca ha scoperto un nuovo tipo di cellule staminali cardiache denominate "cellule staminali atriali cardiache" (CASC). A differenza di altre cellule staminali, le CASC mostrano straordinarie proprietà di differenziazione cardiomiogenica, rendendole un candidato promettente per la rigenerazione cardiaca [4]. L'isolamento di questa popolazione di cellule staminali dalle appendici atriali si basa sull'elevata attività dell'aldeide deidrogenasi (ALDH). Un'elevata attività dell'ALDH è stata segnalata anche in altri tipi di cellule staminali, come MSC, HSC e cellule staminali neurali e tumorali, tra gli altri[7-9]. Poiché l'ALDH si è dimostrato cardioprotettivo e promuove la sopravvivenza cellulare in condizioni di stress, l'utilizzo di una popolazione di cellule staminali ALDH più in condizioni ischemiche può essere, in questo contesto, benefico [4,10]. I CASC possono essere espansi fino a numeri clinicamente rilevanti, senza perdere caratteristiche fondamentali, come l'attività dell'ALDH, il profilo dell'antigene di superficie e la capacità di differenziazione cardiomiogenica [11]. Questo dato è cruciale per la traduzione di questo approccio terapeutico alla clinica. Inoltre, abbiamo dimostrato che il trapianto autologo di CASC si traduce in un miglioramento della funzione ventricolare sinistra, risultante da un adeguato attecchimento di cellule staminali e un'ulteriore differenziazione dei CASC [4,12].

Nei pazienti con IM, i livelli di prodotti finali della glicazione avanzata (AGE) sono aumentati [13] Gli AGE sono proteine ​​e/o lipidi che sono irreversibilmente danneggiati dalla glicazione, un processo in cui gli zuccheri riducenti reagiscono non enzimaticamente con i gruppi amminici nei lipidi o nelle proteine . Oltre alla glicazione, lo stress ossidativo porta anche alla formazione di AGE attraverso l'ossidazione di proteine ​​e/o lipidi [14]. Gli AGE si formano in modo endogeno e si accumulano naturalmente nel corpo con la senescenza o in situazioni patologiche come l'IM quando i livelli di stress ossidativo sono aumentati [15-17].cos'è una cistancheInoltre, ricerche precedenti hanno dimostrato che gli AGE influenzano diversi tipi di cellule staminali in vitro [18-20]. La capacità delle cellule staminali di proliferare è ridotta dagli AGE e il tasso di apoptosi aumenta con l'applicazione degli AGE. Questi effetti potrebbero essere eseguiti attraverso diversi meccanismi, tra cui l'attivazione della via apoptotica, la RAGE o l'eccessiva formazione di ROS [20]. Resta sconosciuto se gli AGE influiscano anche sulle proprietà dei CASC. Questi risultati sollevano la questione se gli AGE possano influenzare negativamente l'efficacia terapeutica dei CASC, che sono usati come trattamento per l'IM. Lo scopo di questo studio è quindi quello di esaminare gli effetti in vitro degli AGE e la potenziale attivazione del suo recettore RAGE sulla proliferazione, sopravvivenza e migrazione dei CASCS.

2. Materiali e metodi

2.1. Esperimenti sugli animali

Gli studi sugli animali sono stati condotti in conformità con la Direttiva UE 2010/63/UE per gli esperimenti sugli animali e approvati dal Comitato Etico Locale per la Sperimentazione Animale (UHasselt, Belgio, Diepenbeek; ID 201919K). Tutti gli animali sono stati tenuti in un ambiente a temperatura controllata (21 gradi ,60% di umidità) con un ciclo luce-buio di 12 ore-12. Sono stati alimentati con una dieta a pellet standard con acqua disponibile ad libitum. In totale sono state utilizzate 62 femmine di ratto Sprague-Dawley (Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, Francia).

2.2. Isolamento ed espansione dei CASC di ratto

I CASC sono stati raccolti dalle appendici atriali destre, come descritto prima [4]In breve, ai ratti è stata iniettata eparina (1000 unità/kg, per via intraperitoneale (ip) e sono stati sottoposti a eutanasia con un sovradosaggio di sodio pentobarbital (Dolethal, Vetoquinol, Aartselar Belgium, 200 mg/kg, ip). I cuori sono stati raccolti, perfusi con una normale soluzione di Tyrode (137mMNaCl,5.4mMKCl,0.5mMMgClz,1mMCaClz,11.8mMNa-HEPES,10mMglu-case,20mM taurina ,pH7.4), e sono state raccolte le appendici atriali destre.Il tessuto dell'appendice atriale destra estratto è stato tritato in pezzi di ~ 1 mm³, lavato con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e dissociato enzimaticamente per 30 minuti in soluzione salina bilanciata di Hank contenente 0,6 WU/mL collagenasi NB 4 (Serva, Heidelberg, Germania) e 20 mM Carly.bioflavonoidiLe cellule ALDHt sono state colorate secondo il kit Aldefluor (STEMCELL Technologies, Evergem, Belgio). Le cellule ALDHt sono state definite come CASC e sono state selezionate per flusso (BD FACS Aria) in X-VIVO 15 media (Lonza, Basilea, Svizzera) integrate con il 20% di siero fetale di vitello (FCS) e il 2% di penicillina/streptomicina (P/S) . I CASC isolati sono stati seminati in 6-piastre a pozzetti a una densità di 60,{7}} cellule per pozzetto e incubate a 37 gradi in un'incubatrice umidificata con un'atmosfera di CO2 al 5%. Il mezzo è stato cambiato ogni 2 o 3 giorni. Quando i CASC hanno raggiunto l'80% di confluenza, sono stati raccolti usando la tripsina. Per tutti gli esperimenti sono stati utilizzati i CASC del passaggio 1.

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2.3.Età Preparazione

Gli AGE sono stati preparati come descritto in precedenza [21]. In breve, l'albumina sierica bovina (BSA;7 mg/mL) è stata incubata con dimeri di glicolaldeide (90 mM; Sigma-Aldrich, Diegem, Belgio) in PBS sterile (pH7,4) per 5 giorni a 37 gradi. Questa soluzione è stata dializzata contro PBS, due volte per 2 ore e per una notte a 4 gradi per rimuovere la glicolaldeide non reagita (cut-off di 3,4 kDa. Gli AGE sono stati filtrati (filtro da 0,2 um, Sarstedt, Anversa, Belgio). BSA incubata in PBS (7 mg/mL). ) è stato utilizzato come soluzione di controllo.

2.4. Saggio di proliferazione e sopravvivenza

Sono stati eseguiti saggi di proliferazione e sopravvivenza, con un saggio di ioduro di propidio (PI) come descritto in precedenza da Gervois et al. e Lo Monaco et al.[22,23]. In breve, i CASC sono stati seminati in una 96-piastra a pozzetti in mezzo X-VIVO con il 10% di FCS e il 2% di P/S. Per i test di proliferazione, sono state seminate 5000 cellule per pozzetto. Per i test di sopravvivenza, sono state seminate 100 cellule per pozzetto. Dopo 24 ore, al mezzo sono state aggiunte cinque diverse condizioni: 400 ug/mL di BSA, 50 ug/mL, 100 ug/mL, 200 ug/mL e 400 ug/mL di AGEs. Per misurare la proliferazione, BSA o AGE sono stati aggiunti al terreno X-VIVO con il 2% di FCS e il 2% di P/S.comprare cistanchePer misurare la sopravvivenza, BSA o AGE sono stati aggiunti al terreno X-VIVO con il 0 percento di FCS e il 2 percento di P/S. Dopo tre diversi punti temporali (24,48 e 72 h), il mezzo è stato sostituito con tampone di lisi A100 (ChemoMetec, Kaiserslautern, Germania), seguito da una uguale quantità di tampone stabilizzante B (ChemoMetec) integrato con PI(10 ug/ ml, Sigma). Dopo un periodo di incubazione di 15 minuti al buio, la fluorescenza è stata misurata utilizzando il lettore di piastre Fluostar Optima (BMG Labtech, Ortenberg, Germania) a un'eccitazione di 540 nm, lunghezza d'onda di emissione di 612 nm e un guadagno di 2000. Sono stati eseguiti esperimenti in triplice copia. I dati sono stati normalizzati ai dati ottenuti con 400 ug/mL di BSA.

2.5. Saggio di migrazione

I CASC sono stati seminati in una piastra di {{0}}pozzetti a una densità di 5000 cellule per pozzetto in mezzo X-VIVO con l'10 percento di FCS e il 2 percento di P/S. Cinque condizioni sono state aggiunte al mezzo: 400 ug/mL di BSA, 50 ug/mL, 100 ug/mL, 200 ug/mL e 400 ug/mL di AGEs. Dopo un periodo di incubazione di 72 ore, i CASC condizionati sono stati raccolti utilizzando tripsina e utilizzati per un test di migrazione transwell. Nei ThinCerts (Greiner Bio-One, Vilvoorde, Belgio) con una membrana porosa di 8 um di dimensione dei pori, 100.000 cellule per condizione sono state seminate in terreno X-VIVO con lo 0% di FCS e il 2% di P/S. I ThinCert sono stati posti su 24-piastre a pozzetti contenenti X-VIVO medium con 2% FCS e 2% P/S. Dopo 24 ore di migrazione, i ThinCert sono stati fissati con 4% di paraformaldeide (PFA) per 15 minuti e incubati con 0,1 percento di viola cristallino per 30 min. Le celle che non migravano sono state rimosse nella parte superiore dei ThinCert, dopodiché la quantità di CASC trasmigrati è stata quantificata con il software AxioVision 4.6 (Carl Zeiss, Zaventem, Belgio). I dati sono stati normalizzati ai dati ottenuti con 400 ug/mL di BSA.

2.6.Saggio di apoptosi

I CASC sono stati seminati in una 96-piastra a pozzetti a una densità di 10,{2}} cellule per pozzetto in mezzo X-VIVO con il 2% di FCS e il 2% di P/S. Per studiare l'apoptosi, è stato eseguito un test della caspasi utilizzando IncuCyte8 Caspase-3/7 Green Apoptosis Assay Reagent (diluito 1/100, Sartorius, Schaarbeek, Belgio). Cinque condizioni sono state aggiunte al mezzo: 400 ug/mL di BSA, 50 ug/mL, 100 ug/mL, 200 ug/mL e 400 ug/mL di AGEs.CASC coltivate in mezzo X-VIVO senza FCS e 2% di P/ S sono stati usati come controllo positivo. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato. Le immagini sono state acquisite dopo 24,48 e 72 ore di incubazione utilizzando il sistema di analisi IncuCyte@S3Live-Cell (Sartorius, Schaarbeek, Belgio). L'analisi dell'area occupata dalle cellule apoptotiche è stata eseguita utilizzando il sistema di analisi delle cellule vive IncuCyte* SX1 (Sartorius, Schaarbeek, Belgio). I dati sono stati normalizzati al controllo positivo (più, mezzo X-VIVO senza FCS).

2.7.Inibizione di RAGE in vitro

RAGE è stato inibito per valutare il contributo dell'attivazione di RAGE nella proliferazione, sopravvivenza e migrazione dei CASC. In breve, i CASC sono stati pre-incubati a 37 gradi in un incubatore di CO2 al 5% con l'antagonista RAGE FPS-ZM1 (10 e 25 uM, Calbiochem/Merck, Overijse, Belgio). Dopo 2 ore di pre-incubazione, sono stati aggiunti 400 ug/mL di AGEs.cistanche AustraliaDopo 24 48 e 72 ore, la proliferazione e la sopravvivenza sono state valutate come descritto sopra. Dopo 72 ore di incubazione, i CASC precondizionati sono stati raccolti e utilizzati per un test di migrazione transwell come descritto sopra.

2.8.Statistiche

Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software GraphPad Prism 9.0.{2}}.cistanciaLa normale distribuzione dei dati è stata valutata con il test di Shapiro-Wilk. I dati normalmente distribuiti sono stati sottoposti a un test ANOVA unidirezionale con misurazioni ripetute, seguito dal test di confronto multiplo di Holm-Sidak. Quando i dati non erano distribuiti normalmente, è stato utilizzato il test di Friedman non parametrico seguito dal test di confronto multiplo di Dunn. Tutti i dati sono espressi come media ± errore standard della media (SEM).Un valore di p<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Risultati

3.1. L'esposizione agli AGE influenza negativamente la proliferazione e la sopravvivenza dei CASC

Come mostrato nella Figura 1, gli AGE hanno ridotto significativamente e gradualmente la proliferazione dei CASC nel tempo. Anche l'impatto negativo degli AGE sulla proliferazione dei CASC era dipendente dalla concentrazione. Dopo 72 h, le concentrazioni di 100 ug/mL, 200 ug/mL e 400 ug/mL di AGE hanno ridotto significativamente la proliferazione dei CASC rispetto alla BSA (Figura 1C; 80% ±7n100ug/mL, 74% ±3in 200 ug/mL, e 65 percento ± 4 in 400 ug/mL AGEs). L'applicazione della sola BSA non ha influenzato la capacità proliferativa dei CASC (Figura Sl nei materiali supplementari). Come mostrato nella Figura 2, l'aumento delle concentrazioni di AGE ha influenzato negativamente la sopravvivenza del CASC nel tempo. Effetti significativi degli AGE sono stati osservati dopo 48 (Figura 2B) e 72 ore (Figura 2C; 85% ±3 in 100 ug/mL, 73% ±3 in 200 ug/mL e 64% ±4in 400 ug/mL AGEs) .L'applicazione della sola BSA non ha influito sulla capacità di sopravvivenza dei CASC (Figura S1).

3.2. L'aumento delle concentrazioni di AGE aumenta l'apoptosi dei CASC

Per chiarire l'effetto di diverse concentrazioni di AGE (50,100,20 e 400 ug/mL) sull'apoptosi dei CASC, è stato eseguito un test della caspasi. La percentuale di cellule che esprimono la caspasi 3/7 è stata misurata in diversi punti temporali: 24 (Figura 3A), 48 (Figura 3B) e 72 (Figura 3C) h. Il tasso apoptotico è aumentato gradualmente nel tempo con l'aumento delle concentrazioni di AGE (Figura 3C,72h; 77% ±17 in 400 ug/mL AGEs vs.18% ±3in BSA).

3.3. L'esposizione agli AGE diminuisce la capacità di migrazione dei CASC

La capacità di migrazione dei CASC è stata valutata con un test di migrazione transwell dopo 72 ore di incubazione con diverse concentrazioni di AGE. Nella Figura 4-E sono presentati esempi rappresentativi della migrazione dei CASC dopo l'incubazione con BSA e diverse concentrazioni di AGE (50,100, 200 e 400 ug/mL). La quantificazione della migrazione è mostrata nella Figura 4F. Rispetto alla BSA, è stata osservata una significativa riduzione della migrazione quando i CASC sono stati incubati con 400 ug/mL AGEs (Figura 4E, F;75% ±5in 400 ug/mL AGEs).

3.4. Gli effetti deleteri degli AGE nei CASC sono mediati dall'attivazione di RAGE

Per valutare il contributo dell'attivazione di RAGE negli effetti deleteri osservati degli AGE, sono state valutate la proliferazione, la sopravvivenza e la migrazione dei CASC dopo l'incubazione con l'antagonista RAGE FPS-ZM1. Prima dell'esposizione a 400 ug/mL di AGE, le CASC sono state pre-incubate per 2 ore con 10 o 25 uM FPS-ZM1. L'applicazione del solo FPS-ZMl (10 e 25 uM) non ha influenzato la capacità proliferativa né la sopravvivenza dei CASC (Figura S2). La proliferazione dei CASC (Figura 5A-C) è stata valutata dopo 24 (A), 48 (B) e 72 (C) h. Come mostrato nella Figura 1, l'impatto negativo sulla proliferazione dei CASC da parte degli AGE è significativamente attenuato dopo la pre-incubazione con 25 uM FPS-ZM1 (Figura 5A-C). Infatti, dopo 24 e 48 ore, la proliferazione dei CASC è stata significativamente migliorata, con un'esposizione di 400 ug/mL AGEs (24 ore, Figura 5A; 104% 士8 in 25 μM FPS-ZM1 contro 79% ±5 in 400 ug/mL AGEs); 48 ore, Figura 5B;95% ±5in 25 μM FPS-ZM1 vs.70% ±4in 400 ug/mL AGEs）. Dopo 72 ore, è stata osservata la stessa tendenza. La proliferazione tendeva a migliorare quando la RAGE veniva inibita （Figura;80% ±8in25μMFPS-ZM1 vs.67% ±5in 400 ug/mL AGEs,p=0.06）. La sopravvivenza (Figura 6A-C) è stata valutata dopo 24 (A), 48 (B) e 72 (C) h. L'impatto negativo sulla sopravvivenza dei CASC da parte degli AGE (Figura 2) è significativamente migliorato dopo la pre-incubazione con 25 uM FPS-ZM1 (Figura 6A-C). Dopo 24 ore, la sopravvivenza è notevolmente migliorata (Figura 6A; 104% ±7 in 25 μM FPS- ZM1 rispetto a 91 percento ±4 in 400 μM di AGEs）.Questa tendenza è stata osservata anche dopo 48 ore (Figura 6B; 91 percento ±5 in 25 μM FPS-ZM1 vs.81 percento ±5in 400 ug/mL AGES,p =0.07). Esempi rappresentativi di migrazione dei CASC dopo 72 ore di incubazione con 400 ug/mL di AGE e FPS-ZMl sono presentati in Figura e quantificati nella Figura. La pre-incubazione dei CASC con 25 uM FPS-ZMI potrebbe impedire la ridotta capacità di migrazione dei CASC osservata con l'esposizione di AGEs ( Figura 7B;98% ±6 in 25 uM FPS-ZM1 vs.7% ±8in 400ug/mL AGEs,p=0.07）.

4. Discussione

Il nostro studio è il primo a dimostrare che gli AGE influenzano le proprietà dei CASC, vale a dire sopravvivenza, proliferazione, migrazione e apoptosi in vitro. I nostri dati dimostrano che questi effetti sono parzialmente mediati dall'attivazione di RAGE in modo dose-dipendente.

4.1.Il ruolo degli AGE nel MI

I livelli di AGE circolatori sono significativamente elevati nei pazienti con infarto miocardico acuto [24,25] Tuttavia, il modo in cui sono coinvolti nella fisiopatologia dell'infarto miocardico rimane poco chiaro. Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono i principali contributori coinvolti nella sintesi degli AGE. Lo stress ossidativo può indurre la formazione di composti carbonilici reattivi e la glicoossidazione dei prodotti Amadori nella reazione di Maillard. In quanto tali, gli AGE si formano e si accumulano irreversibilmente nel cuore dopo un infarto miocardico e si ritiene che possano potenzialmente peggiorare ulteriormente il fenotipo cardiaco avverso [26,27]. Inoltre, i neutrofili ei macrofagi attivati, coinvolti nel processo infiammatorio dell'IM, contribuiscono in modo determinante alla sintesi degli AGE[28,29]. Queste cellule immunitarie secernono AGE e sono segnalate come induttori chiave della formazione di AGE nell'IM. 4.2. Rilevanza fisiologica delle concentrazioni di AGE

Nel nostro studio, abbiamo testato un'ampia gamma di concentrazioni di AGE (da 50 a 400 ug/mL) La concentrazione di AGE utilizzata in altri studi in vitro che studiano l'effetto degli AGE sulle cellule staminali, varia da 15 a 500 ug/mL 【20】. Vi è una significativa variabilità delle concentrazioni utilizzate, ma livelli di AGE più elevati generalmente riflettono i livelli plasmatici fisiologici riscontrati nei pazienti affetti da più malattie. In effetti, è stato dimostrato che la concentrazione di AGEs-albumina nei pazienti diabetici varia da 50 a 400 ug/mL[30]. I livelli di AGE possono salire a concentrazioni fino a 200 ug/mL in pazienti affetti da malattie cardiovascolari [31,32]. Nei pazienti con malattia di Alzheimer allo stadio iniziale, sono riportate anche concentrazioni di AGE più basse nell'intervallo della nanoscala [33]. Tuttavia, a causa dei diversi metodi analitici utilizzati per misurare gli AGE e l'eterogeneità dei diversi tipi di AGE, la stima di concentrazioni affidabili di AGE in vivo rimane tecnicamente impegnativa ed è probabilmente una sottostima [34].

4.3. Gli AGE hanno un impatto negativo sulle proprietà dei CASC

Anche se il trapianto di CASC mostra un potenziale promettente per la rigenerazione cardiaca post-MI, la sopravvivenza e la capacità rigenerativa delle cellule rimangono un problema. Le aree ischemiche sono note per essere un ambiente ostile con livelli aumentati di stress ossidativo, infiammazione e fibrosi combinati con livelli aumentati di tessuto AGEs. Non era noto se gli AGE avrebbero influenzato la capacità rigenerativa dei CASC, ma potrebbe essere una conoscenza importante nel contesto della rigenerazione cardiaca e delle promettenti capacità rigenerative dei CASC[12]. Nel nostro studio, dimostriamo che gli AGE compromettono la sopravvivenza, la proliferazione e la migrazione dei CASC in vitro, in modo dipendente dalla concentrazione e dal tempo. Inoltre, l'esposizione agli AGE porta ad un graduale aumento dell'apoptosi dei CASC. I nostri dati sono in linea con gli studi che esaminano l'effetto degli AGE su più tipi di altre cellule staminali, in cui la capacità proliferativa è alterata e l'apoptosi è aumentata [20]. Infatti, Zhu et al. hanno dimostrato una significativa diminuzione della proliferazione delle EPC dopo l'esposizione a diverse concentrazioni di AGE[16]. Lo stesso effetto è stato valutato da Sun et al. anche nelle EPC, dove un aumento del tasso apoptotico è stato mediato dall'attivazione della via p38 MAPK [35]. Le NSC esposte agli AGE hanno determinato una riduzione dose-dipendente della proliferazione delle cellule staminali, mediata dalla via PPARy [36]. Nelle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC), un aumento dell'attivazione della caspasi 3 porta ad un aumento del tasso apoptotico [37]. Yang et al. hanno riportato minori capacità di proliferazione e migrazione nelle MSC, in un modo dipendente dalla concentrazione di AGE. Questo effetto è stato mediato da un'eccessiva produzione di ROS[18]. Resta da determinare se gli effetti deleteri sui CASC, una popolazione di cellule staminali di origine cardiaca molto diversa, siano mediati anche da un'eccessiva produzione di ROS.

È stato dimostrato che i meccanismi sottostanti in cui gli AGE eseguono i loro effetti negativi sulla funzione degli organi sono dipendenti e/o indipendenti dall'attivazione del recettore RAGE [15]. Studi su molti tipi di cellule staminali mostrano che gli AGE mediano i loro effetti principalmente attraverso l'attivazione di RAGE o altre vie apoptotiche[20]. L'attivazione di RAGE da parte degli AGE provoca l'attivazione di MAPK, che porta alla fosforilazione di JNK e p38. Queste proteine ​​​​fosforilate aumentano la trascrizione di diversi fattori di trascrizione pro-apoptotici nel nucleo, portando ad un aumento dell'apoptosi. Inoltre, le vie delle caspasi possono essere attivate, causando l'apoptosi indotta da AGEs[39]. Restano necessari studi di follow-up per svelare i meccanismi molecolari mediante i quali gli effetti a valle degli AGE vengono indotti nei CASC. Tuttavia, abbiamo dimostrato che dopo il blocco di RAGE da parte di FPS-ZM1, gli effetti osservati degli AGE sui CASC sono stati attenuati. Pertanto, i nostri dati indicano fortemente che gli AGE mediano i loro effetti sui CASC probabilmente attraverso il legame e l'attivazione di RAGE. Resta da identificare ulteriormente se siano coinvolti Jak/STAT, PI3K/Akt, MAPK, un'eccessiva produzione di ROS o altre vie di segnalazione. I nostri dati sono anche in linea con il lavoro descritto da Zhang et al., dove FPS-ZMl ha anche invertito gli effetti negativi degli AGE nelle ADSC bloccando RAGE, confermando ulteriormente l'importante ruolo dell'attivazione di RAGE come mediatore degli effetti deleteri causati da ETÀ[40].

4.4. Prospettive future per le terapie anti-AGE per le malattie cardiovascolari e le attuali limitazioni

La conferma in vivo dell'uso delle terapie anti-AGE e del loro potenziale valore aggiunto al trapianto di cellule staminali dopo infarto miocardico deve essere confermata in un modello animale prima che questo possa essere tradotto in clinica. È stato dimostrato in numerosi studi in vitro che l'inibitore PPARy rosiglitazone [41,42], gli inibitori MAPK [18,35,43] o gli antiossidanti [4] possono attenuare gli effetti mediati dagli AGEs sulle cellule staminali. Tuttavia, la loro influenza in vivo come intervento terapeutico in combinazione con il trapianto di cellule staminali non è mai stata affrontata finora. Esistono diverse strategie per abbassare i livelli di AGE nel corpo. La piridossamina (PM) è un inibitore della formazione di AGE diminuendo la conversione da Amadori ad AGE e eliminando i composti carbonilici. L'efficacia, così come la sicurezza del trattamento con PM, è stata dimostrata in studi clinici con pazienti diabetici [45]. Tuttavia, una sperimentazione clinica di NephroGenex nel 2014, che ha testato la piridrina [(ie, PM) come terapia antidiabetica, è stata interrotta a causa di problemi finanziari [46]. Nessun altro studio clinico sta attualmente studiando il PM come terapia. Tuttavia, l'inibizione della formazione di AGE con il PM potrebbe essere una strategia per migliorare il potenziale delle cellule staminali per scopi rigenerativi cardiaci. Inoltre, altri inibitori della formazione di AGE, come l'aminoguanidina, potrebbero essere utilizzati in futuro per abbassare i livelli di AGE dopo un infarto del miocardio. Lo studio clinico ACTION II ha mostrato l'efficacia dell'aminoguanidina nei pazienti diabetici. Sebbene l'aminoguanidina non sia riuscita a ridurre significativamente l'endpoint primario di raddoppiare il tempo per raggiungere i livelli massimi di creatinina sierica in questi pazienti, sono stati mostrati altri effetti clinicamente importanti sulle complicanze del diabete, come la riduzione della proteinuria e delle concentrazioni di lipidi circolatori. Tuttavia, a causa di effetti avversi reversibili come l'induzione di autoanticorpi, sintomi simil-influenzali e anemia, questo studio è stato interrotto e la traduzione nella clinica rimane limitata [47,48]. Inoltre, l'uso di antiossidanti come la N-acetil-L-cisteina (NAC) o il glutatione come supplemento alla nostra dieta potrebbe fornire alcuni risultati benefici per la terapia con cellule staminali, poiché aumentano la stabilità genomica, migliorano l'adesione e stimolano la proliferazione delle cellule staminali. 49]. Tuttavia, le azioni specifiche delle cellule differiscono tra i tipi di cellule staminali e sono necessari studi clinici dose-risposta per valutare la loro efficacia terapeutica se usati in combinazione con il trapianto di cellule staminali. Un'altra opzione è abbattere gli AGE con la terapia ALT-71. ALT-711 è in grado di scindere i legami carbonio-carbonio tra i carbonili, rompendo così i legami incrociati nelle molecole di AGE. Tuttavia, diversi studi clinici non hanno potuto confermare gli effetti benefici dell'ALT-711 osservati negli studi sugli animali. Inoltre, gli inibitori di RAGE (come FPS-ZM1) o gli inibitori delle molecole a valle nella via RAGE possono interferire nell'asse di segnalazione delle cellule AGEs/RAGE, bloccando così gli effetti mediati dagli AGE nelle cellule staminali. L'efficacia di diversi tipi di piccole molecole e inibitori nel bloccare gli AGE nelle cellule staminali è stata dimostrata in numerosi esperimenti in vitro [18,35,44] ma non è mai stata testata prima su modelli animali. Pertanto, possiamo solo ipotizzare che questi inibitori siano efficienti nel bloccare gli AGE in una situazione in vivo, ma sono necessari esperimenti di concetto di prova. Infine, un'altra opzione per bloccare gli AGE in combinazione con la terapia con cellule staminali è la modifica genetica delle stesse cellule staminali. È noto che la sovraespressione di sRAGE migliora lo scavenging degli AGE (e altri ligandi di RAGE come l'amiloide-) per migliorare l'efficacia della terapia cellulare. Ciò è stato dimostrato nelle MSC secernenti sRAGE come terapia per il morbo di Alzheimer[50,51], l'artrite [52] e il morbo di Parkinson [53]. Le MSC secernenti sRAGE sono sopravvissute più a lungo, hanno migliorato la capacità di migrazione, sono state protette meglio dall'apoptosi e hanno proprietà antinfiammatorie. Inoltre, la downregulation di RAGE, desensibilizzando così le cellule staminali per gli AGE, potrebbe essere un'opzione per migliorare la funzionalità delle cellule. Resta da indagare se queste strategie possano essere applicabili anche nell'ambito dell'IM e della riparazione cardiaca. Per riassumere, tutte queste strategie mirano ad affrontare gli AGE per migliorare la funzionalità e la ritenzione delle cellule staminali. Tuttavia, queste opzioni terapeutiche rimangono ipotetiche e devono essere studiate in vivo in combinazione con la terapia CASC prima che possano essere tradotte nel contesto clinico. 5. Conclusioni

Abbiamo scoperto che gli AGE avevano un effetto graduale, dipendente dal tempo e dalla concentrazione, sulle proprietà dei CASC, aumentando l'apoptosi e riducendo la sopravvivenza, la proliferazione e la migrazione in vitro. I meccanismi di lavoro alla base di questi effetti devono essere ulteriormente studiati, sebbene abbiamo dimostrato che l'attivazione di RAGE è un importante contributo a questi effetti negativi correlati agli AGE. Resta da studiare ulteriormente se il targeting degli AGE in vivo possa migliorare la capacità terapeutica dei CASC dopo l'infarto miocardico.

Questo articolo è tratto da J. Clin. Med. 2021, 10, 2964. https://doi.org/10.3390/jcm10132964 https://www.mdpi.com/journal/jcm