ASSISTＲATTO

Obiettivo: chiarire se generalecistanosidi(GC) miglioradisfunzione cognitivatopi che invecchiano rapidamente (SAMP8) mediando specifici recettori degli androgeni (AＲ) nelregolazione dell'espressione delle proteine ​​sinaptiche． 

Metodi: un totale di topi SAMP8 maschi di 76 7- mesi di età sono stati divisi casualmente nel gruppo modello, gruppo GC, gruppo GC + flutamide (F), gruppo GC + fulvestrant (ICI), gruppo F e gruppo ICI． Le funzioni di apprendimento e memoria dei topi di ciascun gruppo sono state testate con il labirinto acquatico Morris. Per testare il test sono stati utilizzati Western blotting e RT-PCRlivello di espressione della sinaptofisina(SYN), densità postsinaptica － 95 ( PSD － 95) e il fattore neurotrofico derivato dal cervello ( BDNF) dei topi in ciascun gruppo．

Risultati: i GC hanno migliorato significativamente l’apprendimento e la funzione cognitiva dei topi SAMP8．

Rispetto al gruppo GC, la funzione di apprendimento e memoria dei topi nel gruppo GC + F e nel gruppo GC + ICI era significativamente ridotta． I risultati del Western blotting e della RT-PCR hanno mostrato che il livello di espressione di BDNF, SYN e PSD－ 95 era significativamente aumentato a livello di proteine ​​e di geni nel gruppo GC rispetto al gruppo Modello ( P ＜ 0． {{ 11}}5) ． Il livello di espressione di SYN era aumentato nel gruppo GCs + F e GCs + ICI, e i livelli di espressione di BDNF e PSD － 95 erano significativamente diminuiti nel gruppo GCs + F e GCs + ICI rispetto al gruppo GCs (P ＜ 0． 05) ．

Conclusione: i GC possono mediare specificamente AＲ per migliorare la plasticità sinaptica nei topi SAMP8, che a sua volta migliora l’apprendimento e la funzione cognitiva．

PAROLE CHIAVE:Cistanosidi generali; Recettore degli androgeni; Plasticità sinaptica; Topi SAMP8

Integratore Cistanche Miglioramento delle funzioni cognitive Integratore alimentare PhGs75% Ech 30% Act 12%

Il morbo di Alzheimer(AD) è un comunemalattia neurodegenerativa, clinicamente caratterizzato da un progressivo declino della funzione cognitiva e da cambiamenti nello stato mentale e psicologico [1]. Gli studi hanno scoperto che i livelli di testosterone nei pazienti maschi con AD sono significativamente più bassi rispetto agli uomini normali.

ILfunzione cognitiva dei pazientiè stato migliorato a vari livelli dopoterapia sostitutiva chetonica[2], il che indica che le diminuzioni legate all'età dei livelli di androgeni possono essere un fattore di rischio per l'AD negli uomini anziani.

Glicosidi totali della Cistanche deserticola (cistanosidi generali, GC) sono uno dei principali estratti di Cistanche deserticola, che possono migliorare l'apprendimento e l'apprendimento legati all'ADdisfunzione cognitiva[3]. Inoltre, la somministrazione di GC mediante sonda gastrica ha aumentato significativamente i livelli di testosterone negli animali [4]. I GC hanno anche la funzione di promuovere lo yang e possono esercitarlo

Effetti farmacodinamici androgeni-simili. Studi precedenti hanno riferito che il testosterone può migliorare l’apprendimento e le funzioni cognitive degli animali modello di AD, e questo processo si basa su specifici recettori degli androgeni (recettori degli androgeni, AR) mediati [5].

È noto che la disfunzione cognitiva nei pazienti con AD è strettamente correlata alla plasticità sinaptica. Tuttavia, il meccanismo specifico attraverso il quale i GC regolano la plasticità sinaptica e quindi migliorano l’apprendimento e le funzioni cognitive non è ancora chiaro. Questo studio mirava a esplorare se i GC mediano ARＲ specifici per influenzare la plasticità sinaptica e quindi migliorare l’apprendimento e le funzioni cognitive nell’AD.

1 Materiali e metodi

1.1 Animali e attrezzature da esperimento

Topi SAMP8 maschi di 3-mesi di età sono stati acquistati dalla Scuola di Medicina dell'Università di Pechino (SCXK [Beijing] 2016-0010) e sono stati allevati fino all'età di 7 mesi. Gli animali sono stati tenuti in un ambiente pulito a (24 ± 1) grado e

Agli animali è stata fornita illuminazione naturale, libero accesso a cibo e acqua e sono state fornite cure umanitarie in conformità con i principi 3R per l'utilizzo di animali da esperimento. Questo studio sperimentale è stato approvato dal Comitato etico animale sperimentale del Baotou Medical College (Baotou Medical College n. 20201102).

I principali reagenti dell'esperimento sono:Glicosidi totali della Cistanche deserticola(GC, Xi'an Ciyuan Biological Co., Ltd.); Antagonista del recettore degli androgeni-flutamide (Sigma Company, USA); antagonista del recettore degli estrogeni-fulvestrante (ICI 182780, USA) Med Chem Express); Anticorpo BDNF anti-topo di coniglio,

anticorpo PSD-95, anticorpo SYN, anticorpo -actina (Proteintech Company degli Stati Uniti); soluzione per elettroforesi proteica, soluzione di trasferimento proteico, TEMED, tampone di acrilammide, persolfato di ammonio, Tris (Beijing Solebao Technology Co., Ltd.); Kit di sintesi del cDNA, rilevazione quantitativa della fluorescenza di Talent

Kit di reagenti (Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd.), ecc. La principale attrezzatura sperimentale comprende un serbatoio per elettroforesi a piastra verticale, un apparecchio per elettroforesi, un serbatoio di trasferimento, un agitatore di decolorazione (Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.), un sistema di analisi di imaging di gel proteico (Shanghai Tanon Technology Co., Ltd.), strumento PCR quantitativo a fluorescenza in tempo reale (USA Roche) ecc.

1.2 Raggruppamento e amministrazione

Due topi sono morti naturalmente durante il processo di alimentazione e i restanti 78 topi sono stati divisi casualmente in gruppo modello, gruppo GC, gruppo GC + flutamide (F), gruppo GC + fulvestrant (ICI), gruppo F, ICI

Gruppi di 13 animali ciascuno. Ad eccezione del gruppo modello, del gruppo F e del gruppo ICI, agli altri gruppi sono stati somministrati in modo continuo GC alla dose di 50 mg/(kg·d) per 30 giorni.

A partire dal 24° giorno dopo la somministrazione di GC, al gruppo GC + flutamide (F) e al gruppo GC + fulvestrant (ICI) è stata somministrata un'iniezione intraperitoneale di F (5 mg/kg/giorno) 30 minuti dopo la somministrazione di GC tramite sonda gastrica. ), ICI (1 mg/kg/die), iniezione continua per 7 giorni. Regolare la concentrazione di dosaggio per garantire che il volume gastrico massimo dei topi sia 0,5 mL, 1 volta/giorno.

1. 3 Test del labirinto acquatico di Morris

I topi si sono adattati all'ambiente acquatico con un giorno di anticipo. Il labirinto acquatico di Morris è durato 6 giorni. I primi 5 giorni sono stati il ​​test di posizionamento e navigazione. I topi sono stati addestrati una volta al giorno in ciascuno dei quattro quadranti per 1 minuto ogni volta. Ogni intervallo di allenamento era di 15 minuti e le registrazioni venivano registrate contemporaneamente. Latenza di fuga del test di posizionamento e navigazione dell'animale; il 6° giorno, rimuovi la piattaforma dall'acqua ed effettua un test di esplorazione spaziale. Registra il numero di attraversamenti della piattaforma e la percentuale di tempo trascorso nel quadrante di destinazione del mouse. il quadrante target) e la traiettoria di nuoto dell'esplorazione spaziale (traiettoria di nuoto del test della sonda spaziale) e altri indicatori.

1. 4 Rilevamento Western blot

Espressione delle proteine ​​correlate alla sinapsi SYN, PSD-95 e BDNF. Dopo il test del labirinto acquatico di Morris, tutti i topi sono stati anestetizzati di routine, le loro teste sono state decapitate, il loro cervello è stato rimosso e i loro ippocampi sono stati strappati via. Il tessuto dell'ippocampo è stato sottoposto a lisi proteica, interrotto mediante ultrasuoni a 4 gradi, lasciato in ghiaccio per 30 minuti e centrifugato a 12,000 giri/min per 15 minuti a 4 gradi. È stato prelevato il surnatante e la concentrazione proteica è stata misurata utilizzando il metodo BCA. Dopo aver caricato la proteina, eseguire l'elettroforesi su gel di impilamento a una tensione costante di 80 V, l'elettroforesi su gel di separazione a una tensione costante di 120 V e il trasferimento a umido a un flusso costante di 300 mA; estrarre la membrana in PVDF, bloccarla con latte scremato al 5% per 80 minuti a temperatura ambiente e lavare la membrana tre volte con TBST. 15 minuti/ora, l'anticorpo primario è stato incubato durante la notte su una tavola vibrante a 4 gradi; il giorno successivo la membrana è stata lavata 3 volte con TBST.

15 minuti/ora, l'anticorpo secondario è stato incubato a temperatura ambiente per 2 ore, quindi è stato eseguito lo sviluppo del colore ECL e l'imaging è stato eseguito con un sistema di imaging in chemiluminescenza. -actina è stata utilizzata come riferimento interno e il valore di densità ottica della banda è stato analizzato utilizzando il software Image J.

1. 5ＲRT－PCRＲRilevamento

L'espressione dell'mRNA di SYN, PSD-95 e BDNF è stata estratta dall'RNA totale del tessuto ippocampale secondo il metodo di estrazione Trizol e il cDNA è stato generato dopo la trascrizione inversa. Il kit di rilevamento quantitativo della fluorescenza Talent è stato utilizzato per il rilevamento quantitativo della fluorescenza relativa. L'esperimento è stato ripetuto tre volte e i risultati sono stati convertiti in 2 - È stato analizzato ΔΔCT. I primer di actina di topo, SYN, PSD-95 e BDNF sono stati progettati dalla Shanghai Sangon Company e le sequenze di primer sono mostrate nella Tabella 1.

1.6 Analisi statistica

Tramite il software statistico SPSS 25. 0 per l'elaborazione, il software Graphpad Prism 8 è stato utilizzato per disegnare grafici statistici e l'ANOVA unidirezionale è stata utilizzata per confrontare le medie a coppie di più campioni. P < 0. 05 significa che la differenza è statisticamente significativa.