Impiego di composti fenolici dalla vegetazione degli olivi Acqua nei polli da carne: effetti sul microbiota intestinale e sulla durata di conservazione dei filetti di petto Parte 3

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2.7. Ossidazione lipidica

L'ossidazione lipidica è stata studiata attraverso la misura del secondario (TBAR) e del primario (D232 e D270)ossidazionecomposti (Tabella 7). Non sono state rilevate differenze significative tra i tre gruppi sperimentali, anche se vale la pena notare un leggero aumento dei valori di TBAR per i polli nel gruppo L2 rispetto a quelli nei gruppi L1 e L0, mentre D232 ha mostrato la tendenza opposta. Questi due indicatori analitici erano significativamente correlati (TBAR vs. D232 r=-0.5,p<0.001 and="" tbars="" vs.="" d270r=""><0.05). the="" cooking="" treatment="" caused="" decreases="" in="" the="" primary="" oxidation="" products=""><0.01), which="" were="" followed="" by="" increases="" in="" the="" secondary="" ones="" (p=""><0.001). no="" interactions="" between="" diet="" and="" cooking="" were="" observed.="" on="" the="" contrary,="" [31]and="" [45]="" observed="" a="" significant="" reduction="" in="" tbars="" in="" the="" breasts="" from="" chickens="" whose="" diets="" were="" supplemented="" with="" either="" olive="" cake="" or="" omww.="" similarly,="" [46]="" observed="" a="" reduction="" in="" tbars="" in="" the="" quadriceps="" femoris="" of="" chickens="" whose="" diets="" were="" enriched="" with="" omww="" permeate="" and="" the="">

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Ok et al. [16] hanno aggiunto diversi volumi di estratto di foglie di olivo (5, 10 e 15 ml/litro) all'acqua da bere fornita ai polli da carne ceppo Abor acre, osservando un effetto significativo sulla riduzione dei livelli ematici di malondialdeide (MDA). Ibrahim et al. [42], hanno osservato una significativa riduzione della concentrazione di MDA nel petto di pollo ottenuta aggiungendo alla dieta livelli crescenti di sansa di oliva essiccata fermentata o fermentata enzimaticamente. A differenza di altri studi, in quello attuale non è stato osservato un effetto protettivo contro l'ossidazione del grasso muscolare nel tessuto muscolare. Ci sono molti fattori che generano variabilità e differenze tra gli studi. Oltre alla razza animale e alla durata del periodo di ingrasso, altri fattori come la composizione nutritiva della dieta, l'assunzione di mangime, la temperatura ambientale insieme ad altre condizioni stressanti possono portare a risultati molto diversi e spesso difficili da confrontare. Non ultimo il tipo di matrice con cui la dieta si arricchisce di fenoli (pannello, sansa di oliva, estratto di foglia di olivo, estratto di acqua di vegetazione, solo per citarne alcuni) per la concentrazione dei principi attivi e la presenza di sostanze aggiuntive con un'azione sinergica o protettiva presente nella stessa matrice, può influenzare significativamente l'azione antiossidante sia in vivo che nel tessuto della carne dopo la macellazione [47]. I potenziali benefici per la salute derivanti dall'integrazione di additivi antiossidanti nella carne fresca e nei prodotti a base di carne non sono sempre dimostrati [48]. Al contrario, molti composti di ossidazione lipidica e proteica primari e secondari, comeidroperossidi, epossidi,4-idrossinonenale, malonaldeidesono riconosciuti come potenziali cancerogeni o possono influenzare la trasduzione del segnale cellulare come nel caso dei composti carbonilici [49]. Nel caso della carne fresca, la possibilità di aumentare il potenziale antiossidante attraverso il razionamento degli animali è una prospettiva molto suggestiva, soprattutto nell'uso di sostanze naturali piuttosto che di sintesi. Infatti, a differenza dei prodotti a base di carne dove la tecnologia offre diverse possibilità di intervento per aumentare il potenziale antiossidante, nella carne fresca l'unica alternativa all'intervento attraverso la dieta degli animali è quella di un trattamento mirato alla superficie del prodotto che però deve essere coerente con la normativa vigente. È improbabile che la quantità residua di fenoli misurata nella carne del petto del presente studio provochi benefici diretti per la salute, ma indirettamente può farlo. La cottura della carne, ad esempio, provoca una netta perdita delle difese antiossidanti tissutali, quindi l'arricchimento dei tessuti della carne di composti ancora attivi anche dopo il trattamento termico, come nel casofenoli, è di grande interesse applicativo in vista di un aumento della shelf life e della sicurezza del prodotto stesso. Il motivo per cui non sono stati osservati né in video né ex video effetti come conseguenza della prova di alimentazione con CPC, merita ulteriori indagini sperimentali, soprattutto per quanto riguarda l'interazione trapolifenoli dieteticie il microbiota intestinale del pollo su cui sfrutta una parte significativa dei potenziali effetti biochimici dei fenoli [9,10].

3. Materiali e metodi 3.1. Strutture sperimentali

La sperimentazione è stata condotta nel pollaio dell'Azienda Sperimentale dell'Università di Padova (Legnaro, Padova, Italia) dopo 6 mesi di fermo. Il pollaio era dotato di impianto di raffrescamento, ventilazione forzata, riscaldamento radiante e impianto di illuminazione controllata. Sono stati utilizzati in totale 12 recinti in rete metallica (2,5×2,4 m;6 m2), ciascuno dotato di cinque abbeveratoi per capezzoli (distanza: 20 cm) e un alimentatore circolare (diametro: 30 cm) per la distribuzione manuale del mangime. Ogni recinto aveva un pavimento in cemento ricoperto di lettiera per trucioli di legno (profondità 5 cm, 2,5 kg/m).

La luce è stata fornita 24 ore al giorno per i primi 2 giorni dopo l'arrivo dei polli al pollaio. Quindi, il numero di ore di luce è stato progressivamente ridotto fino a raggiungere un fotoperiodo 18L:6D, che è stato poi mantenuto dai 12 giorni di età in poi.

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3.2. Animali, gruppi sperimentali e registrazioni in vivo

Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale (Organismo per la Protezione del Benessere Animale; OPBA) dell'Università di Padova (progetto 17/2016; n. 154392 del 10 maggio 2016). Tutti gli animali sono stati trattati secondo i principi della direttiva 2010/63/UE[50] relativa alla protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali e ad altri fini scientifici. I ricercatori coinvolti nella manipolazione degli animali erano specialisti degli animali (dottorato o master in scienze animali) e/o veterinari.

Un totale di 144 1-pulcini di un giorno (Ross 308) sono stati consegnati da un camion commerciale, in conformità al regolamento (CE) n. 1/2005 del Consiglio [51], alle strutture sperimentali dell'Università. Tutti i pulcini erano stati vaccinati contro la malattia di Marek, la bronchite infettiva e la malattia di Newcastle presso l'incubatoio. I pulcini sono stati pesati individualmente il giorno del loro arrivo, identificati da un contrassegno della zampa, assegnati casualmente tra i 12 recinti (12 capi per recinto e 10 capi/m²）,e poi pesato una volta alla settimana per misurare il loro peso vivo fino alla macellazione commerciale. Il consumo di mangime per penna è stato misurato quotidianamente durante lo studio. Durante lo studio sono state somministrate tre diete commerciali in forma crumble (Martini SpA Longiano, Forlì-Cesena, Italia): dieta P1 da 0a 23 giorni, dieta P2 da 24 a 37 giorni e dieta P3 da 38 giorni fino a macellazione a 48 giorni (vedi Materiali supplementari per i dati analitici, Tabella S1). Il concentrato fenolico grezzo (CPC) è stato ottenuto come descritto da [12], brevemente, gli OVW sono stati trattati utilizzando enzimi con attività pectinasi ed emicellulosica e quindi sottoposti a microfiltrazione, ultrafiltrazione e osmosi inversa. Il CPC è stato aggiunto alle diete come segue:( i)L0 Dieta di controllo (P3), (ii)L1 Dieta di controllo più CPC(220 mg/kg di mangime come fenoli totali teorici), (i) L2 Dieta di controllo più CPC(440 mg/kg di mangime come teorico fenoli totali). Il contenuto effettivo dei singoli composti fenolici del CPC e delle diete è stato riportato nella Tabella S2. Ciascuna dieta è stata replicata in quattro penne (omogenee per peso vivo iniziale e variabilità). Il CPC è stato fornito da 24 giorni (d) di età fino alla macellazione commerciale a 48 giorni (vedi Materiale supplementare per la composizione fenolica del CPC). Tutti gli animali sono stati nutriti ad libitum durante lo studio e le diete integrate sono state preparate settimanalmente.

Per determinare la composizione della comunità microbica intestinale sono stati raccolti tamponi cloacali (4 animali/recinto) a 23,34 e 44 giorni di età per un totale di 12 animali (4 per dieta) che sono stati testati tre volte (36 tamponi campioni raccolti in totale).

3.3. Macellazione commerciale e registrazione della qualità di carcasse e carni

A 48 giorni di età, dopo il prelievo di mangime e acqua (rispettivamente per 7 e 2 ore), tutti i polli sono stati macellati in un macello commerciale. I polli sono stati pesati individualmente prima dell'imballaggio. Tutti i polli da un recinto sono stati caricati in una gabbia di trasporto (altezza, 62,5 cm × 160 cm × 25,0 cm; superficie del pavimento, 1 m²）. Il carico e il trasporto dalle strutture sperimentali al macello commerciale e alla stabulazione prima della macellazione hanno richiesto circa 3 ore. I polli venivano macellati secondo le pratiche standard del macello commerciale. Le carcasse sono state recuperate dopo 2 h di refrigerazione a 2 gradi e pesate individualmente per misurare la percentuale di condimento alla macellazione [52].

Ventiquattro ore dopo la macellazione, le carcasse sono state sezionate per ottenere i muscoli pettorali maggiori separati dal seno [53].

Durante il processo, è stata registrata una perdita del 17,4% (25 polli) a causa della mortalità. Delle 119 carcasse,72 sono state assegnate ad analisi microbiologiche durante il periodo di conservabilità (Sezione 2.4 spiega la determinazione della composizione del microbiota mammario con metodi coltura-dipendenti e indipendenti), mentre le restanti 47 sono state congelate (-40 grado ) e successivamente utilizzati per la valutazione delle composizioni prossime e dei tassi di ossidazione lipidica delle carni crude e cotte (paragrafo 3.5).

3.4.Valutazione della durata di conservazione

3.4.1.Preparazione del petto di pollo confezionato

I muscoli principali P sono stati confezionati singolarmente in vassoi di polietilene a bassa densità avvolti in una pellicola di PVC spessa 12 μm（Weigel,KOEX412,Gruppo Fabbri,Vignola,modenese,Italia) e conservato a 4±1 gradi .in un armadio refrigerato (Majolo" Plus 100 Controllore di stagionatura, Majolo, Cadoneghe, Padova, Italia). L'esposizione alla luce è stata fissata da 8:00 alle 20:00 utilizzando una lampada fluorescente da 36 W [54]. Le impostazioni di conservazione sono state progettate con l'intento di imitare le condizioni di refrigerazione durante la vendita. Le confezioni sono state campionate casualmente a 24, 72, 120, 180, 216 e 264 h dal data di macellazione

3.4.2. Analisi sensoriale

È stata eseguita una valutazione sensoriale del seno fresco secondo [37]utilizzando un sistema di punteggio di demerito 3-(1=non accettabile,{3}}accettabile, 3=di buona qualità). L'indice sensoriale sintetico (SI) è stato calcolato come [(2 × punteggio odore più 2 × punteggio colore più 1 × punteggio texture)/5], con un punteggio di 1,8 che funge da soglia per definire i campioni viziati. L'analisi sensoriale è stata eseguita da otto relatori addestrati.

3.4.3.Analisi microbiologica della carne del seno durante il periodo di shelf-life

Le analisi microbiologiche sono state eseguite secondo le procedure descritte da [38]. I muscoli pettorali maggiori (circa 2 cm di lunghezza × 1 cm di profondità × 2 cm di larghezza) sono stati asportati in modo asettico lungo ciascun seno per ottenere un campione rappresentativo di 25 per seno. I campioni sono stati miscelati in una sacca stomacher con 225 ml di acqua peptonata tamponata e analizzati dopo le diluizioni appropriate. Per l'estrazione del DNA, 1 mL di ciascun omogenato è stato raccolto in provette Eppendorf da 2 mL e centrifugato a 13.500 × g per 1 minuto (centrifuga Eppendorf 5425, Amburgo, Germania). Quindi, il supernatante è stato scartato e il pellet è stato congelato a -80 gradi . Sono stati studiati diversi target microbici per descrivere la dinamica della popolazione microbica durante il periodo di shelf-life come segue: La conta totale vitale (TVC) e la conta psicotrofica totale (TPC) sono state valutate su Plate Count Agar (Biokar Diagnostics, Beauvais, Francia) e le piastre sono state incubate a 30 gradi per 72 ore o a 4 gradi per 10 giorni. Le Enterobacteriaceae sono state enumerate con Violet Red Bile Glucose Agar (Biokar Diagnostics, Beauvais, Francia) a 37 gradi per 24 ore. I batteri dell'acido lattico (LAB) sono stati analizzati su De Man, Rogosa e Sharpe Agar (Biokar Diagnostics, Beauvais, Francia) in condizioni anaerobiche a 30 gradi per 48 ore. Lo Pseudomonas spp. il conteggio è stato valutato su Pseudomonas Agar Base integrato con cetrimide, fucidina e cefaloridina a 25 gradi per 48 ore (Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, Regno Unito). La conta dei batteri produttori di H2S (presunta Shewanella spp.) è stata effettuata su ferro agar (Lyngby, Laboratorios Conda, Torrejon de Ardoz, Spagna) a 25 gradi per 48 ore. I risultati sono riportati come log10 UFC/g di carne.

3.4.4.pH e perdita di gocciolamento

Un pHmetro (Portamess 910, Knick, Berlino, Germania), dotato di un elettrodo specifico (Mettler Toledo, Milano, Italia), è stato utilizzato per misurare i valori di pH mediante inserimento nei muscoli pettorali maggiori in triplicato sul lato ventrale. La perdita di gocciolamento è stata valutata secondo il metodo presentato da [55] utilizzando il metodo del sacco. Fette di circa 2,5 cm tagliate dalla superficie del seno dorsale sono state inserite in sacchi di polietilene e sospese per una notte a 2±1 gradi C. La perdita di gocciolamento (percentuale) è stata calcolata dalla seguente equazione: [(peso iniziale - peso finale)/peso iniziale ].

3.4.5. Concentrazione di fenolo nella dieta e nel muscolo mammario

L'estrazione dei fenoli è stata condotta su 5 g di campione dietetico tritato mescolato con 50 mL di metanolo/acqua (soluzione 80/20(o/o) contenente 20 mg/L di idrossi-toluene butilato (BHT), la miscela è stato omogeneizzato utilizzando un dispersore a bastoncini (IKA, T50 Ultra-Turrax, Werke, Staufen, Germania) per 1 min a 7000 rpm, centrifugato a 9327 × g per 10 min e il supernatante recuperato. La procedura è stata ripetuta due volte e l'estratto raccolto è stato quindi concentrato da un evaporatore rotante (Buchi Rotavapor, R-210, Svizzera) fino a raggiungere un volume finale di 20 ml. Una cartuccia SPE Bond Elut Jr-C18,1 g (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA ), precedentemente attivato con 10 mL di metanolo e 10 mL di acqua, è stato caricato con 1 mL di estratto acquoso l'eluizione è stata eseguita con 50 mL di metanolo Dopo rimozione del solvente sotto vuoto, l'estratto fenolico è stato solubilizzato in 1 mL di una soluzione composto da metanolo/acqua (50:50 v/v) e filtrato attraverso un filtro per siringa (0,2 mm) al fluoruro di polivinilidene (PVDF). l'analisi qualitativa e quantitativa dei composti fenolici dell'estratto è stata condotta secondo [31] di

HPLC (Mod. 1100 Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), dotato di una colonna C18 (dimensione delle particelle Spherisorb ODS-1(250 mm × 4,6 mm)5 um, fornita da Waters SpA(Milano, Italia) . I composti fenolici sono stati rilevati utilizzando il DAD impostato a 280 nm. La quantificazione dei polifenoli è stata determinata utilizzando curve di calibrazione singole per ciascun composto e i risultati sono espressi come mg kg-1. L'idrossitirosolo (3,{{ 10}}DHPEA) è stato ottenuto da Cabru SpA (Milano, Italia), il tirosolo p-HPEA è stato acquistato da Merck Life Science Srl (Milano, Italia) e il verbascoside è stato prelevato da Extrasynthese (Genay, Francia). La forma dialdeide del La de-carbossimetil oleuropeina aglicone (3,4-DHPEA-EDA) è stata estratta dall'olio di oliva vergine secondo la procedura riportata da [56].

Un totale di 10 grammi di carne sono stati mescolati con 50 ml di metanolo e acqua（80/20,o/ø）contenente acido formico {{0}},2 percento e 20 mg/L di BHT. La soluzione è stata omogeneizzata utilizzando un dispersore a bastoncini (IKA, T50 Ultra-Turrax, Werke, Staufen, Germania) per 1 minuto a 7000 giri/min, centrifugata a 4146 × g per 10 minuti e il surnatante è stato recuperato. L'operazione è stata ripetuta due volte e le due aliquote dell'estratto sono state raccolte e il metanolo è stato rimosso mediante evaporatore rotante (Buchi Rotavapor, R-210, Svizzera). Venti mL dell'estratto acquoso sono stati caricati su cartucce SPE Bond Elut HF Mega BE-C18,5g (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), precedentemente attivate con 20 mL di metanolo e 20 mL di acqua; l'eluizione è stata eseguita con 50 mL di metanolo. Dopo rimozione del solvente sotto vuoto, l'estratto fenolico è stato recuperato con 0,5 ml di una soluzione composta da metanolo/acqua（50∶50 o/ø）e filtrato attraverso un fluoruro di polivinilidene（PVDF）filtro per siringa (0,2 mm). Le analisi HPLC degli estratti fenolici sono state condotte secondo [56] con la stessa attrezzatura sopra riportata. L'idrossitirosolo è stato rilevato utilizzando il rivelatore a fluorescenza (FLD) operato a una lunghezza d'onda di eccitazione di 280 nm e un'emissione di 313 nm. La quantificazione dell'idrossitirosolo è stata effettuata utilizzando la curva di calibrazione ei risultati sono espressi come ug/kg.

3.5. Composizione prossima, perdita di cottura e analisi degli acidi grassi

La composizione prossimale, il profilo degli acidi grassi e la stabilità ossidativa sono stati valutati sia su campioni crudi (lato destro P. major) che cotti (lato sinistro P. major). Dopo lo scongelamento, la perdita di cottura è stata valutata secondo[53] con le seguenti modifiche: la metà sinistra di ciascun petto è stata pesata, confezionata sottovuoto e cotta a bagnomaria a 80 gradi per 45 min. Successivamente i petti sono stati abbattuti fino a 4 gradi e tenuti in frigorifero (4 gradi) per 72 h prima di essere disimballati e pesati nuovamente per calcolare la perdita di cottura come [(peso carne cruda peso carne cotta)/peso carne cruda ]×100). Il muscolo, sia crudo che cotto, è stato macinato finemente (due volte 2500 giri/min × 10 s, Retsch, Dusseldorf, Germania) e sottoposto ad analisi di umidità, proteine ​​grezze e ceneri [57], mentre il contenuto di grassi grezzi è stato determinato utilizzando il metodo presentato di [58]. In breve, 200 ml di miscela diclorometano/metanolo 1:1 sono stati aggiunti a 5 g del campione, omogeneizzati a 11,{17}}/min per 1 minuto (Ultraturrax T25 Basic, Ika Werke. Staufen, Germania) e incubati a 60°C in forno (sistema PID, strumenti M120-VF, MPN, Bernaggio, MB, Italia) per 20 min. Successivamente sono stati aggiunti altri 100 ml di diclorometano e dopo omogeneizzazione(11,{25}}/min per 1 min) il campione è stato filtrato (carta da filtro rapida) e al permeato sono stati aggiunti 100 ml di KCl 1 M. Dopo centrifugazione (AvantiJ-E, Beckman Coulter, Brea, CA, USA) a 1000 × g per 30 m a 4 gradi, il surnatante è stato scaricato e l'estratto organico è stato filtrato attraverso solfato di sodio anidro. Un'aliquota (circa 10 g) è stata utilizzata per la determinazione gravimetrica della percentuale di grasso, il resto è stato distillato (Rotavapor"R-210, Büchi, Essen, Germania) e il grasso anidro è stato utilizzato per ulteriori analisi. gli esteri metilici (FAME) sono stati preparati pesando 0,015 g di grasso anidro in una provetta di vetro con tappo a vite [39], che è stata solubilizzata con 1 mL di HCl metanolico 3 M (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) e incubato per 2 ore a 60 gradi Quindi, è stato aggiunto 1 mL di acqua deionizzata e,dopo la miscelazione,i FAME sono stati recuperati in 1 mL di n-esano. FAME（1 μL）sono stati analizzati da un gascromatografo (Shimadzu Italia Srl, modello 2014, Milano, Italia) dotato di un rivelatore a ionizzazione di fiamma (impostato a 250 gradi) e un iniettore split-splitless (impostato a 280 gradi). La camera termica, che conteneva la colonna capillare (Supelco SP-2560; 100 m × 0,25 mm × 0,2 um), è stata mantenuta a 60 gradi per 8 min. La temperatura è stata quindi aumentata a 120 gradi per 1 minuto ad una velocità di 10 gradi/min, e poi da 120 a 240 gradi ad una velocità di 2,5 gradi C/min. L'isoterma finale è stata mantenuta a 240 gradi per 20 min. Gli acidi grassi sono stati identificati utilizzando una miscela standard esterna (37 Component FAME Mix, Supelco, Germania). Le analisi sono state eseguite in duplice copia.

3.6. Ossidazione lipidica

I composti di ossidazione primaria sono stati determinati come dieni coniugati mediante analisi spettrofotometrica nel campo ultravioletto utilizzando una versione modificata del metodo indicato nell'allegato del Reg.EU/2015/1833 del Consiglio [59]. In breve,0.01±0,001 g di fatwa anidra pesato in un matraccio tarato da 10 ml e sciolto con cicloesano di grado spettrofotometrico fino alla tacca. Uno spettrofotometro UV/Vis (Mod. 7800 Jasco UV/VIS, Oklahoma City, OK, USA) è stato utilizzato per determinare i valori di estinzione specifici a 232 (dieni coniugati) e 270 nm (trieni coniugati) utilizzando lo stesso solvente del riferimento. I prodotti secondari dell'ossidazione lipidica sono stati determinati secondo il metodo presentato da [60] con modifiche, come segue: in una provetta da centrifuga, 8 mL di una soluzione acquosa di acido tricloroacetico al 5 percento (m/v) e 5 mL di n-esano sono stati aggiunti a circa 2 g del campione omogeneizzato. Dopo omogeneizzazione con Ultraturrax per gli anni '30 ad alta velocità. il campione è stato centrifugato per 3 minuti a 3000 × g a 4C (Eppendorf 5810R; Eppendorf, Amburgo, Germania) e il surnatante è stato rimosso. Il campione è stato filtrato attraverso un filtro di carta rapido e 2,5 ml del filtrato sono stati aggiunti a 2,5 ml di una soluzione acquosa di acido tiobarbiturico 0,02 M e incubati per 35 minuti a 95 gradi C in un bagno termostatato (lavoro ED{{31} }; Seelbach, Baden-Württemberg, Germania). Dopo il raffreddamento, l'assorbanza è stata rilevata utilizzando uno spettrofotometro impostato su una lunghezza d'onda di 532 nm. I dati sono espressi in milligrammi di malondialdeide per chilogrammo di carne. Le misurazioni sono state eseguite in duplicato sia sui petti di pollo cotti che crudi.

3.7.Estrazione del DNA e preparazione della libreria NGS

Il DNA è stato estratto utilizzando un kit di isolamento del DNA DNeasy PowerSoil (Qiagen, Hilden, Germania). I pellet omogeneizzati della carne del petto sono stati scongelati con 600 ul di tampone di lisi fornito dal kit. I tamponi cloacal sono stati tagliati con forbici sterili, inseriti in una microprovetta contenente 600 ul di tampone di lisi e 6 ul di 2- mercaptoetanolo (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Le provette sono state miscelate bene usando il vortice per 5 minuti e i tamponi sono stati rimossi. Sia per i campioni cloacali che per il pellet di carne del seno è stato aggiunto un totale di 100 mg di perline sterili da 0,1 mm (BioSpec, Bartlesville, OK, USA) ed è stato utilizzato un mulino a perline (TissueLyser, Qiagen, Hilden, Germania) per eseguire l'interruzione in fasi di scuotimento ad alta velocità (2×30 s a 30 Hz). Un totale di 40 ul di proteinasi K (Qiagen, Hilden, Germania) è stato aggiunto e incubato a 56 gradi per 90 minuti. Dopo questo passaggio, sono state seguite le istruzioni del produttore del kit di isolamento DNeasy PowerSoil9DNA. La concentrazione e la purezza del DNA sono state analizzate utilizzando uno spettrofotometro (NanoDrop ND-1000, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA).

Un approccio di amplificazione in due fasi è stato utilizzato per costruire la libreria del DNA 16S. I campioni sono stati amplificati in 20-reazioni μL,ciascuno composto da 5 μL di DNA diluito,{{0}}.4 uM di ciascun primer (Tabella 1), 0,25 mM di deossinucleotide (dNTP), 1 × tampone Phusion HF e 1 U Phusion High-Fidelity DNA polimerasi (New England BioLabs, Inc., Ipswich , MA, USA). La PCR è stata condotta in un termociclatore 2720 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) con 25 cicli di 95 gradi per 30 s, 60 gradi o 49 gradi C per 30 s, 72 gradi C per 45 secondi e un'estensione finale di 7 minuti a 72 gradi. Sono stati eseguiti tre replicati PCR per campione.

I prodotti sono stati purificati utilizzando il kit di purificazione SPRIselect (Beckman Coulter Life Sciences, Indianapolis, IN, USA) e, dopo la purificazione delle microsfere, la banda target è stata confermata utilizzando gel di agarosio all'1,8%. I codici a barre sono stati introdotti da una seconda analisi PCR con primer contenenti codici a barre specifici della piattaforma. Ogni 50-reazione uL PCR conteneva il prodotto PCR, 0,2 μM di ciascun primer（Tabella 1）,0.3 mMdNTP,1 × Buffer HF a emissione,e 1UPhusion DNA polimerasi ad alta fedeltà. Sono stati eseguiti dieci cicli del profilo PCR sopra descritto.

I prodotti della PCR sono stati purificati utilizzando il kit di purificazione SPRIselect (Beckman Coulter Life Sciences, Indianapolis, IN, USA). Dopo la purificazione finale, ogni campione è stato quantificato utilizzando un Qubit 2.0 Fluorometro (Invitrogen, Life Technologies, Monza, Italia). La qualità della libreria di ampliconi è stata testata utilizzando un bioanalizzatore Agilent 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Le biblioteche sono state sequenziate utilizzando la piattaforma Illumina MiSeq con un ciclo 300- paired-end (Macrogen Inc., Seoul, Corea).

4. Conclusioni

L'arricchimento delle diete dei polli con fenoli ottenuti dalla filtrazione e concentrazione dell'acqua di vegetazione del frantoio per 24 giorni non è stato associato a differenze nella crescita degli animali, nel tasso di conversione del mangime o nella resa della carcassa. Lo studio del microbiota intestinale ha mostrato un effetto significativo del tempo di alimentazione ma non della dieta di per sé sull'alternanza dei gruppi microbici. D'altra parte, la composizione del microbiota della carne durante il periodo di shelf-life ha mostrato una maggiore crescita di Pseudomonas nei campioni di polli che hanno consumato mangime arricchito con fenoli. Infine, non sono state osservate differenze tra le diete per quanto riguarda i marcatori analitici (TBAR e dieni coniugati) del processo di ossidazione dei lipidi. Invece, l'idrossitirosolo è stato identificato nel tessuto muscolare dei campioni di polli che hanno consumato mangime con aggiunta di fenoli, mostrando un assorbimento intestinale dose-dipendente. Poiché il processo ossidativo avviene principalmente nella struttura della membrana delle cellule muscolari, sono necessari ulteriori studi per comprendere meglio la distribuzione dell'HT nei compartimenti cellulari ed extracellulari.

Questo articolo è estratto da Molecules 2021, 26, 4307. https://doi.org/10.3390/molecules26144307 https://www.mdpi.com/journal/molecules