Valutazione dell'esposizione all'azoto ammoniacale nelle difese immunitarie presenti sulla milza e sul rene della testa di Wuchang (Megalobrama Amblycephala) Ⅱ
Nov 14, 2023
3. Discussione
Il modo in cui il sistema immunitario dei pesci risponde ai diversi tipi di inquinanti ambientali è diventato un argomento scottante [34–37]. Essendo una sostanza tossica onnipresente, l'ammoniaca può avere un impatto inaspettato sulla salute degli animali acquatici poiché i pesci spesso soffrono di stress cronico da ammoniaca in situazioni realistiche. Il nostro presente studio ha chiarito le influenze dell’esposizione a lungo termine all’ammoniaca sull’immunità dei pesci e il suo meccanismo.
Nel nostro presente esperimento, il cortisolo sierico è aumentato significativamente con l'aumento della concentrazione di esposizione all'ammoniaca, indicando la presenza di stress nell'orata di Wuchang. Risultati simili sono stati osservati nel rombo (Scophthalmus ma. imus), nella carpa comune (Cyprinuscarpio) e nell'orata giovanile (Megalobrama). amblycephala) [32,38,39. In questo studio l'esposizione cronica all'ammoniaca ha portato anche a diminuzioni significative del lisozima sierico, del complemento e del C4. Il lisozima, come indicatore della funzione immunitaria innata, è il principale enzima immunitario per combattere le infezioni (40). Il sistema del complemento, essendo uno dei ponti tra l'immunità innata e l'immunità acquisita, svolge un ruolo essenziale nell'eliminazione dei complessi immunitari e nell'uccisione delle malattie che causano batteri e virus [41,42). Alcuni studi precedenti hanno riportato che lo stress acuto da ammoniaca può inibire le attività del lisozima (17,43] e diminuire i livelli di proteine e mRNA di C3 e C4 nei pesci (44-46). Pertanto, i nostri risultati attuali hanno rivelato che lo stress cronico da ammoniaca ha sovvertito l'attività immunità innata dei pesci.Nel presente studio, sono stati riscontrati aumenti concentrazione-dipendenti delle concentrazioni di ammoniaca sia nella milza che nella testa del rene, ma una differenza significativa è stata rilevata solo nella milza. Aumenti simili sono stati riscontrati nella milza e nella testa del rene.indici testa-rene, indicando che lo stress da ammoniaca ha causato gravi danni a due principali organi immunitari. I risultati istologici hanno inoltre rivelato che l'accumulo di ammoniaca potrebbe essere la causa principale di lesioni patologiche a livello della milza e dell'uterotesta del rene, che erano caratterizzati da un aumento dei centri melanoma-macrofagici e da vacuolizzazione del citoplasma. I centri melano-macrofagici sono noti come aggregati di macrofagi e le loro funzioni principali consistono nell'immagazzinamento di fosfolipidi e ferro di derivazione cellulare in seguito all'eritrofagocitosi, nella deposizione di agenti patogeni resistenti e nell'elaborazione dell'antigene nelle risposte immunitarie [47-51]. L’aumento delle dimensioni e della frequenza dei centri melano-macrofagici spesso indica che i pesci stanno subendo stress o danni o stanno invecchiando [36,48,52]. La ricerca di Kwon e Chang ha riportato che un'esposizione all'ammoniaca di 5-giorni (4,0~10,4 mg/l di azoto ammoniacale totale) ha indotto una grave deposizione di emosiderina e un aumento dei macrofagi di melanina nella milza dell'orata nera [ 53]. Un simile assemblaggio melano-macrofagico è stato osservato nella milza di Pelteobagrus vachellii esposta a 1 e 5 mg/L di azoto ammoniacale totale [17]. Inoltre, la valutazione quantitativa delle alterazioni istopatologiche ha mostrato che il grado di danno patologico causato dallo stress persistente da ammoniaca era maggiore nella milza che nella testa del rene.
ESTRATTO DI CISTANCHE ORGANICHE CON 25% ECHINACOSIDE E 9% ACTEOSIDE PER INFEZIONI RENALI
Il danno agli organi immunitari nei pesci è sempre associato ad alterazioni delle molecole immunitarie [35]. Nelsistema immunitario innato, ILcitochine infiammatorie IL-1e TNF- sono gli importanti regolatori dell'inizio e della modulazione della risposta infiammatoria [54-57]. Livelli ridotti di molecole di citochine (TNF-, IL-1) rappresentano una riduzione della funzione immunologica cellulare, che alla fine si traduce in un alto tasso di infezione in presenza di fattori di stress esterni [58-60]. Studi limitati hanno documentato che l'esposizione acuta a 40 mg/L di azoto ammoniacale totale può aumentare i livelli trascrizionali di citochine come IL-1 e TNF- nel rombo (Scophthalmus maximus), mentre l'esposizione cronica ad alti livelli di ammoniaca (50 mg/L azoto ammoniacale totale) ha indotto la tendenza opposta nel carassio (Carassius auratus) [14,60]. I nostri risultati attuali hanno mostrato che l'esposizione cronica all'ammoniaca ha causato marcate diminuzioni dei livelli proteici e trascrizionali di IL-1 splenico e del TNF-, che sono stati ulteriormente supportati dall'analisi di correlazione di Spearman tra le concentrazioni di ammoniaca e i livelli di IL{{15} splenico. } e TNF- . Risultati simili sono stati riscontrati anche nel rene della testa. I nostri dati attuali indicano che l’esposizione cronica all’ammoniaca ha interrotto la difesa immunitaria innata inibendo la trascrizione e la sintesi proteica delle molecole infiammatorie IL-1 e TNF- in due organi immunitari, la milza e la testa del rene.
Oltre al sistema di difesa immunitaria innata, anche l’immunità adattativa svolge un ruolo cruciale nella difesa immunitaria dei pesci. L'IgM è il primo anticorpo secreto dalla risposta immunitaria adattativa ad una nuova infezione o ad un antigene estraneo, che sono espressi principalmente nella milza e nella testa del rene dei pesci [61,62]. Livelli più bassi di IgM possono essere associati a una debole immunità adattativa [63]. Nel presente studio, sono state rilevate diminuzioni significative dei livelli proteici e trascrizionali di IgM nella milza ma non nella testa del rene, indicando che l'esposizione all'ammoniaca ha un effetto inibitorio sulla produzione di IgM spleniche. Qin et al. hanno riferito che l’esposizione a 1 mg/L di azoto ammoniacale totale per 48 ore e 96 ore ha ridotto significativamente i livelli trascrizionali di igm nella milza di Pelteobagrus vachellii, ma non nella testa del rene [17]. Livelli di IgM diminuiti sono stati riscontrati anche nelle branchie, nella milza e nel cervello di Rhynchocypris lagowski esposto a 0,99 mg/L di ammoniaca non ionizzata per 96 ore [18]. La nostra analisi di correlazione di Spearman ha inoltre mostrato che la concentrazione di esposizione all'ammoniaca era significativamente correlata negativamente con le IgM spleniche, ma non significativamente correlata con le IgM della testa del rene. Pertanto, il nostro studio ha suggerito che lo stress cronico da ammoniaca ha ridotto l’immunità adattativa solo nella milza. Ciò potrebbe suggerire che la milza sia più vulnerabile allo stress da ammoniaca ambientale rispetto alla testa del rene. Una ragione di questa ipotesi potrebbe essere la discrepante compromissione della struttura della milza e della testa del rene indotta dallo stress da ammoniaca nel nostro presente studio.
I TLR ampiamente distribuiti nelle cellule immunitarie sono sensori primari degli agenti patogeni invasori. Nel presente studio, sono stati rilevati livelli trascrizionali ridotti di TLR nella milza e nella testa del rene dell'orata di Wuchang, il che implica che l'ammoniaca potrebbe causare effetti negativi attraverso la via di segnalazione dei TLR. Infatti, l’inibizione dei TLR potrebbe essere correlata all’aumento del cortisolo sierico indotto dall’esposizione all’ammoniaca. Carrizo et al. hanno dimostrato che il trattamento con cortisolo ha ridotto i livelli di mRNA dei TLR (tlr1/5 m/9/22) nei miotubi di Oncorhynchus mykiss [64]. Susarla et al. hanno scoperto che il cortisolo potrebbe ridurre i livelli trascrizionali delle citochine (VEGF, CCL5, IFN-, CXCL-10, IL-8 e GCSF) dopo la stimolazione di uno o entrambi i TLR3 e TLR4 dei fibroblasti corneali umani primari [65]. Inoltre, l'inibizione dei TLR potrebbe implicare un blocco delle vie di segnalazione dei TLR. Il percorso dipendente da MyD88- è regolato da tutti i TLR e il percorso indipendente da MyD88- è peculiare delle vie di segnalazione TLR3 e TLR4 [66]. La segnalazione TLR porta anche all'attivazione della via PI3 K-AKT, che a sua volta attiva le cellule B per produrre anticorpi e sintetizzare molecole proinfiammatorie come IL-1 e TNF- attraverso la via di segnalazione NF-κB [67–69]. Vale la pena notare che i livelli trascrizionali di traf6 sono diminuiti sia nella milza che nella testa del rene dopo l'esposizione all'ammoniaca, mentre non sono stati rilevati cambiamenti significativi nell'espressione di myd88 e pi3 k. Pertanto, i nostri risultati hanno indicato che l'ammoniaca esercita un'interferenza con il percorso indipendente da MyD88- - inibendo TRAF6 sia nella milza che nella testa del rene. Inoltre, l'attivazione di TRAF6 può innescare l'attivazione della segnalazione NF-κB a valle e della segnalazione MAPK (p38, JNK ed ERK), che alla fine induce la produzione di varie citochine infiammatorie tra cui TNF e interleuchina-1 /6/12 (IL-1 /6/12) [70,71]. Inoltre, TRAF6 è anche il mediatore cruciale per la segnalazione del CD40 che regola la secrezione di IL-6 e Ig [72]. Nel nostro studio, la significativa down-regolazione degli mRNA erk1 e nf-κb2 della milza e degli mRNA erk1, jnk1 e nf-κb1 del rene testa ha suggerito che l'esposizione all'ammoniaca ha soppresso le molecole di segnalazione NF-κB e MAPK a valle nella milza e nella testa -rene. Inoltre, l’esposizione all’ammoniaca ha down-regolato il segnale di NF-κB sopprimendo il gene nf-κb1 nella milza ma il gene nf-κb2 nella testa del rene, che riflette la risposta infiammatoria tessuto-specifica tramilza e rene capo. Per quanto riguarda la via di segnalazione MAPK, l'esposizione all'ammoniaca ha inibito significativamente l'espressione di erk1 splenico e di erk1 e jnk1 della testa-rene. Dopo aver eseguito l'analisi di correlazione di Spearman, abbiamo scoperto che la concentrazione di esposizione all'ammoniaca era significativamente correlata negativamente con i livelli dei parametri immunitari (IL-1, TNF e IgM) nonché con l'espressione dei geni correlati alla segnalazione TLR nella milza e testa-rene. Pertanto, i nostri risultati suggeriscono che l'esposizione cronica all'ammoniaca potrebbe compromettere l'immunità innata e adattativa attraverso il percorso di segnalazione indipendente dai TLR/MyD88-.
Valori IBR elevati riflettevano le risposte biologiche migliorate e le cattive condizioni di salute degli organismi [73]. I risultati attuali per i valori IBR sono aumentati con l'aumento della concentrazione di ammoniaca ambientale sia nella milza che nella testa del rene. Questo risultato era coerente con i dati sull'istopatologia e sui parametri sieroimmuni. Inoltre, a parità di concentrazione di stress da ammoniaca, il valore IBR era più alto nella milza che nella testa del rene, il che dimostrava ulteriormente che le influenze dello stress da ammoniaca sulla milza erano più gravi che sulla testa del rene dell'orata di Wuchang.
4. Materiali e metodi
4.1. Mantenimento degli animali e protocollo sperimentale giovanile
Le orate di Wuchang con un peso medio di 9,98 ± 0,48 g provenienti dalla Tuanfeng Fishery (Hubei, Cina) sono state spostate in vasche in fibra di vetro da 300 L, dove sono state alimentate con acqua declorata e continuamente aerata acqua. Sono stati acclimatati per 14 giorni alimentandoli con diete commerciali due volte al giorno (9:{{10}} e 15:00 pomeriggio). Dopo un esperimento preliminare, la LC50 a 96 ore e le concentrazioni sicure di azoto ammoniacale totale per i giovani di orata sono risultate essere 46,013 mg/L e 4,601 mg/L, rispettivamente. Pertanto, l'intervallo di esposizione dell'ammoniaca è stato impostato su 0 mg/L, 5 mg/L, 10 mg/L, 20 mg/L e 30 mg/L di azoto ammoniacale totale. I pesci sono stati distribuiti in modo casuale in 5 gruppi di trattamento con vasche triplicate e la densità di rifornimento era di 20 giovani per vasca. Le concentrazioni sperimentali di ammoniaca sono state ottenute da una soluzione madre di 10 g/L realizzata con cloruro di ammoniaca di grado reagente (BASFR, 99,5%). Per mantenere stabili le concentrazioni di trattamento dell'ammoniaca, la metà della soluzione sperimentale è stata rinnovata ogni giorno con una nuova ed uguale concentrazione di soluzione di azoto ammoniacale. Nel frattempo, il gruppo di controllo è stato sottoposto a una manipolazione simile con acqua di rubinetto aerata. I reali livelli totali di azoto ammoniacale per ciascun trattamento sono stati misurati quotidianamente mediante nesslerizzazione. Durante l'intero periodo sperimentale, i dati di monitoraggio giornaliero dell'analizzatore dell'acqua HQ40 D (Hach, Loveland, CO, USA) hanno mostrato che la temperatura dell'acqua era di 25,0 ± 0,60 ◦C, le concentrazioni di ossigeno disciolto erano superiori a 5,0 mg/L e il pH era mantenuto a 7,55 ± 0,04, con lievi aggiustamenti utilizzando H2SO4 al 10% e NaOH al 10%. I pesci sono stati nutriti con una dieta commerciale due volte al giorno come durante l'acclimatazione.
4.2. Raccolta e preparazione dei campioni
Dopo un'esposizione sperimentale di 30-giorni, i pesci sono stati prima tenuti a digiuno per 48 ore e poi anestetizzati in una soluzione MS-222. Il peso corporeo di ciascun giovane è stato misurato prima della dissezione e il sangue è stato raccolto immediatamente dalle vene caudali per separare il siero per la successiva determinazione dei parametri biochimici. I tessuti (milza e testa-rene) furono estratti e pesati. Gli indici della milza e della testa del rene sono stati calcolati utilizzando la formula [peso del tessuto (g)/peso corporeo (g) * 100%]. Tre singole milze e tre reni di ciascun gruppo sono stati utilizzati per l'analisi istopatologica, mentre gli altri sono stati congelati immediatamente a -80°C per l'analisi delle concentrazioni di ammoniaca nei tessuti, dei parametri immunitari e dei livelli di trascrizione genetica. Questo lavoro condotto su M. amblycephala è stato approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università agricola di Huazhong, Wuhan, Cina (HZAUFI-2019-018).
4.3. Rilevazione dell'ammoniaca nella milza e nella testa del rene
Per l'analisi dei livelli di ammoniaca, il pretrattamento dei campioni di tessuto e il rilevamento dell'ammoniaca sono stati effettuati secondo studi precedenti [74,75]. Le fasi dettagliate del test sono disponibili nelle informazioni di supporto (testo supplementare S1).
4.4. Analisi dei parametri immunitari del siero
I campioni di sangue sono stati centrifugati (845 g, 20 min, 4 ◦C) per la preparazione dei campioni di siero. Ciascun gruppo sperimentale aveva sei repliche e una replica includeva il siero di 10 individui della stessa vasca. Il cortisolo sierico è stato determinato mediante dosaggio radioimmunologico (RIA) utilizzando il kit del Beijing North Institute of Biotechnology Co., Ltd. (Pechino, Cina) (www.bnibt.com, accesso il 15 marzo 2020) secondo uno studio precedente [76]. Il contenuto del complemento C3 e del complemento C4 e l'attività del lisozima sono stati misurati utilizzando kit commerciali prodotti dal Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Cina) (www.njjcbio.com, accesso il 15 marzo 2020).
4.5. Analisi dei parametri immunitari dei tessuti
I campioni di tessuto di cinque pesci dello stesso gruppo sono stati raggruppati come un duplicato e omogeneizzati con 0,85% di cloruro di sodio, quindi centrifugati a 845× g per 15 minuti (4 ◦C) per la raccolta del surnatante. Ciascun gruppo sperimentale aveva sei repliche. Come descritto in studi precedenti [77,78], il surnatante è stato utilizzato per testare le concentrazioni di IgM, IL-1, TNF e proteine totali utilizzando kit commerciali. Tutti i kit sono stati acquistati dal Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Cina) (www.njjcbio.com, accesso il 15 marzo 2020).
4.6. Analisi dell'espressione genica
I livelli di Mrna dei geni immuno-associati nella milza e nella testa del rene sono stati testati secondo il metodo in uno studio precedente [79]. Informazioni dettagliate sulla procedura di test sono fornite nelle Informazioni di supporto (Testo supplementare S2). Le sequenze di primer sono elencate nella Tabella 3. L'analisi della curva di fusione è stata eseguita per ciascun primer al termine della reazione per dimostrare la specificità della reazione. Dopo aver verificato che l'efficienza di amplificazione di tutti i geni selezionati variava dal 90 al 110%, i livelli relativi di Mrna sono stati calcolati con il metodo del 2−∆∆Ct con -actina come controllo interno [80].
4.7. Valutazione istopatologica
I campioni di milza e testa di rene sono stati fissati in formalina tamponata neutra al 10%, quindi disidratati in etanolo e inclusi in paraffina. Infine, le fette di tessuto sono state colorate con ematossilina ed eosina (H&E). Ulteriori analisi quantitative dei cambiamenti patologici sono state eseguite secondo studi precedenti [82,83]. Il protocollo di analisi dettagliato è fornito nelle Informazioni di supporto (Testo supplementare S3).
4.8. Analisi integrata della risposta ai biomarcatori
L'analisi IBR è un metodo per integrare tutte le risposte dei biomarcatori misurati in un indice integrativo per valutare i livelli di stress [84–86]. Nel presente studio, è stato applicato per valutare gli effetti tossici di diverse concentrazioni di ammoniaca sulla milza e sulla testa del rene dell'orata di Wuchang dopo un'esposizione di 30- giorni. Informazioni dettagliate sulla procedura di calcolo sono fornite nelle Informazioni di supporto (Testo supplementare S4).
4.9. Analisi statistiche
Tutti i valori sono stati sottoposti ad analisi della varianza unidirezionale seguita dal test post hoc di Dunnett per valutare le differenze tra le medie (SPSS 22.0, Chicago, IL, USA). L'analisi di correlazione Spear Man è stata scelta per determinare la relazione tra le concentrazioni totali di ammoniaca, i parametri immunitari e i livelli di espressione genica. La normalità e l'omogeneità della varianza sono state precedentemente verificate. Le differenze sono state misurate e considerate significative al valore p < 0,05.
5. Conclusioni
Il nostro studio fornisce la prova che lo stress cronico da ammoniaca ha aumentato il COR sierico, ridotto il lisozima sierico e C3/C4 e diminuito i livelli proteici e trascrizionali di IL-1, TNF e IgM, nonché i livelli di espressione dei geni coinvolti nei TLR /MyD88- via di segnalazione indipendente nella milza e nella testa del rene di M.amblycephala. Inoltre, gli indici di edanno patologicoai due organi immunitari aumenta con l’accumulo di ammoniaca nei tessuti. Questi risultati hanno indicato che l'accumulo di ammoniaca nella milza e nella testa del rene ha causato danni istopatologici e ha indotto la soppressione immunitaria attraverso l'inibizione della segnalazione indipendente dai TLR/MyD88-. Inoltre, gli effetti negativi dello stress cronico da ammoniaca sulla milza si sono rivelati più gravi di quelli sulla testa del rene dell'orata di Wuchang.
Finanziamento: questo lavoro è stato sostenuto congiuntamente dal Programma nazionale di ricerca e sviluppo chiave della Cina (2019 YFD0900303), dal Sistema di ricerca agricola cinese di MOF e MARA (CAS-45-24) e dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (n. 32071621) .
Dichiarazione del Comitato di Revisione Istituzionale: Abbiamo aderito a tutte le normative e convenzioni locali, nazionali e internazionali e abbiamo rispettato le normali pratiche etiche scientifiche. I campioni utilizzati in questo studio provenivano da una popolazione composta principalmente da individui pescati a fini commerciali e destinati al consumo umano. Il protocollo sugli animali è stato approvato dal Comitato etico istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università agricola di Huazhong (Wuhan, Cina) (HZAUFI-2019-018).
Dichiarazione di consenso informato: il consenso informato è stato ottenuto da tutti i soggetti coinvolti nello studio.
Dichiarazione sulla disponibilità dei dati: tutti i set di dati generati per questo studio sono inclusi nell'articolo/materiali supplementari.
Conflitti di interessi: gli autori dichiarano il conflitto di interessi.
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