Valutazione dell'attività antimelanogenica e del meccanismo della galangina in silico e in vivo
Mar 29, 2022
Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Ki Wung Chung, un Hyeong Oh Jeong, un Eun Kyeong Lee, un Su Jeong Kim, un Pusoon Chun, bHae Young Chung,*, un e Hyung Ryong Moon*, un
Una pigmentazione anormale dovuta all'eccessiva sintesi di melanina può causare seri problemi come lentiggini, macchie senili e melanoma. Gli inibitori della tirosinasi sono stati un bersaglio interessante per il trattamento dell'iperpigmentazione perché la tirosinasi è l'enzima limitante la velocità nella sintesi della melanina. Lo screening per i forti inibitori della tirosinasi ha portato alla scoperta del flavonoidegalanina, che ha mostrato notevoli effetti inibitori sulla tirosinasi dei funghi. Il valore IC50 della galanina (3,55±0,39 µM) era inferiore a quello dell'acido cogico (48,55±1,79 µM), che è stato utilizzato come controllo positivo. La simulazione dell'attracco in silico e gli studi meccanicistici hanno dimostrato che la galanina interagiva con i siti catalitici della tirosinasi e competeva con la tirosina. Nelle cellule di melanoma B16F10 stimolate con l'ormone stimolante i melanociti, la galanina ha inibito l'attività della tirosinasi e la produzione di melanina. Sebbene alte dosi digalaninaerano citotossici, non sono stati osservati effetti citotossici a basse dosi. Inoltre, l'efficacia in vivo della galanina è stata valutata in topi glabri HRM2 che possiedono melanina. Come misurato dall'indice di sbiancamento cutaneo e dalla colorazione della melanina, l'esposizione ripetuta ai raggi UVB ha aumentato la sintesi della melanina cutanea. L'applicazione di galangina ha ridotto significativamente la melanogenesi indotta dall'esposizione ai raggi UVB. Collettivamente, i nostri dati lo indicanogalaninamostra una forte attività di inibizione della tirosinasi, il che suggerisce che potrebbe essere un efficace agente sbiancante della pelle.
Parole chiavegalanina; melanogenesi; pigmentazione; tirosinasi
La galangina, un composto flavonoide, si trova in alte concentrazioni in Alpinia officinarum ed Helichrysum) Studi precedenti hanno dimostrato che la galangina ha varie attività farmacologiche, protegge le piante dai raggi UV, agenti patogeni ed erbivori ed esercita attività antibatteriche e antivirali.2– 4) Tuttavia, ha anche proprietà antiossidanti, attribuibili ai suoi effetti benefici.5) La galangina esercita anche effetti antitumorali attraverso l'inibizione della crescita delle cellule tumorali.6,7)
La melanina è un pigmento biologico presente nella maggior parte degli organismi. Nella biologia della pelle, la melanina è prodotta dall'ossidazione dell'amminoacido tirosina. Nella fisiologia normale, la melanina previene le lesioni cutanee attraverso l'assorbimento delle radiazioni UV dannose.8) La melanina sintetizzata nei melanociti della pelle viene distribuita ai cheratinociti, dove partecipa principalmente alla protezione contro i raggi UV dannosi.8) Tuttavia, nonostante alcuni vantaggi, l'eccessiva melanina può anche causare problemi estetici e malattie della pelle.9) Pigmentazioni anomale, come lentiggini, macchie senili, melasma e lentiggini senili, causano seri problemi alla normale fisiologia della pelle.10,11) Pertanto, la modulazione della melanogenesi è una strategia importante per il trattamento dell'eccessiva pigmentazione della pelle.Un certo numero di enzimi partecipa ai processi di melanogenesi. Tra questi vari enzimi, la tirosinasi, che catalizza i processi di ossidazione della L-tirosina a 3,{7}}diidrossifenilalanina (L-DOPA) e L-DOPA a dopachinone, è il più importante.12) Questi processi mediati dalla tirosinasi sono processi di limitazione della velocità. In condizioni anormali, l'iperattivazione della tirosinasi è stata rilevata con un aumento della produzione totale di melanina.13) A causa del suo ruolo chiave nella melanogenesi, la tirosinasi è un bersaglio attraente per un agente depigmentante.14) Pertanto, vari inibitori della tirosinasi sia naturali che sintetici sono state sviluppate le fonti. Molti inibitori della tirosinasi, tra cui idrossichinone, acido cogico e arbutina, sono stati precedentemente utilizzati nell'industria farmaceutica e cosmetica. Sebbene in commercio siano stati sviluppati numerosi inibitori della tirosinasi, sono emersi effetti collaterali citotossici.12) Pertanto, sono necessari agenti sbiancanti per la pelle efficaci e sicuri.
Lo scopo di questo studio era di caratterizzare la galangina come un potente inibitore della tirosinasi utilizzando vari metodi sperimentali. Durante la ricerca di inibitori della tirosinasi da fonti naturali, abbiamo scoperto che la galangina riduceva significativamente l'attività della tirosinasi con un'elevata potenza. Poiché gli effetti inibitori della galanina sulla tirosinasi erano già stati riportati, ci siamo concentrati sui meccanismi inibitori e sulla potenza negli esperimenti su cellule e animali.1) Utilizzando vari esperimenti in silico, in vitro e in vivo, i nostri dati hanno indicato che la galangina potrebbe essere un potente agente sbiancante della pelle per il trattamento della pigmentazione cutanea.
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MATERIALI E METODI
Materiali
Galangina, acido cogico, tirosinasi dei funghi, L-tirosina, ormone stimolante i melanociti (-MSH) e altri reagenti chimici sono stati acquistati da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA).
Misurazione dell'effetto inibitorio della tirosinasi e del meccanismo inibitorio in un sistema privo di cellule
Per valutare l'efficacia inibitoria ei meccanismi della galangina sulla tirosinasi, è stata utilizzata la tirosinasi dei funghi come descritto in precedenza. In breve, 1000 unità di tirosinasi di funghi sono state sciolte in 20 µL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e aggiunte a 170 µL della miscela di dosaggio, che conteneva 1 mM di L-tirosina, 50 mM di tampone fosfato (pH 6,5) e 10 µL di il materiale di prova. La miscela è stata incubata a temperatura ambiente (25 gradi) per 30 minuti. La quantità di dopacromo prodotto è stata misurata spettrofotometricamente a 492 nm (OD492) in un lettore di micropiastre. L'IC50 è stato calcolato dalle ripetizioni dell'esperimento a diverse dosi di galangina. Per determinare il meccanismo inibitorio della galanina, è stato eseguito un test cinetico della tirosinasi. Per il test di inibizione sono state utilizzate varie concentrazioni di L-tirosina (1, 2, 4 e 8 mM). Dopo l'esame, ogni valore è stato convertito nel suo reciproco secondo i grafici di Lineweaver-Burk. I risultati hanno mostrato il grafico di 1/V rispetto a 1/[S]. L'intersezione di ciascuna trama è stata utilizzata per determinare il meccanismo inibitorio.
Simulazione di aggancio
Per la simulazione dell'aggancio proteico-ligando in silico, abbiamo utilizzato AutoDock4.2. Il legame riuscito è stato ottenuto tra la proteina e il ligando. La struttura tridimensionale (3D) della tirosinasi utilizzata nella struttura cristallina proveniva da Agaricus bisporus (ID PDB: 2Y9X) ed un sito di legame predefinito della tirosina è stato utilizzato come tasca di aggancio.15) Le simulazioni di aggancio sono state eseguite tra tirosinasi e galangina /acido cogico. I composti sono stati preparati per la simulazione dell'aggancio nei seguenti passaggi: (1) le strutture 2D sono state convertite in strutture 3D; (2) sono state calcolate le cariche e (3) sono stati aggiunti atomi di idrogeno utilizzando il programma ChemOffice. La previsione di possibili residui di legame idrogeno tra i composti e la tirosinasi e la generazione di farmacofori sono state calcolate da LigandScout 3.0.
Sistema di coltura cellulare
Le cellule di melanoma murino B16F10 ottenute dall'American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) sono state utilizzate per la prima volta per valutare gli effetti della galanina sull'inibizione della tirosinasi. Le cellule sono state coltivate nel mezzo Eagle's modificato di Dulbecco (DMEM; WELGENE Inc., Korea, LM001-05) integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS; WELGENE Inc., S101-01) e penicillina/streptomicina (100 IU/50 µg/mL; WELGENE Inc., LS202-02) a 37 gradi in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2 nell'aria. Per valutare gli effetti della galangina sulla vitalità cellulare, è stato condotto un test di vitalità cellulare utilizzando un kit disponibile in commercio (EZ-1000, Dogen Bio, Corea). In breve, le cellule sono state coltivate in 96-piastre a pozzetti e trattate con diverse concentrazioni di galangina. Trascorso il tempo indicato, l'assorbanza è stata letta a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre. Tutti gli esperimenti cellulari sono stati eseguiti almeno tre volte per garantire la riproducibilità.
Attività tirosinasi
L'attività della tirosinasi nelle cellule B16F10 è stata esaminata attraverso la misurazione del tasso di ossidazione della L-DOPA. Le cellule sono state piastrate in piastre da 60 π, incubate in presenza o assenza di 1 µM -MSH, e quindi trattate per 24 ore con 5 e 10 µM di galangina. Il trattamento con acido cogico è stato utilizzato come controllo positivo. Le cellule sono state lisate in 500 µL di tampone fosfato di sodio 50 mM (pH 6,8) contenente 25 µL 1 percento di Triton X-100 e 25 µL 0,1 mM di fenilmetilsulfonilfluoruro e quindi congelate a -80 gradi per 30 min. Dopo scongelamento e miscelazione, i lisati cellulari sono stati chiarificati mediante centrifugazione a 12000×g per 30 minuti a 4 gradi . I supernatanti (80 µL) sono stati posti in una 96-piastra a pozzetti, sono stati aggiunti 20 µL di L-DOPA (2 mg/mL) e l'assorbanza è stata letta a 492 nm ogni 10 minuti per 1 ora a 37 gradi utilizzando un lettore di lastre.
Estratto di Cistanche: inibisce l'espressione della tirosinasi
Contenuto di melanina
Nel presente studio, il contenuto di melanina è stato utilizzato come indice di melanogenesi. In breve, le cellule B16 sono state piastrate in un piatto da 60 π e incubate in presenza o assenza di 1 µM -MSH. Le cellule sono state quindi incubate per 24 ore con o senza galangina a 5 e 10 µM. Come controllo positivo è stato utilizzato il trattamento con acido cogico. Dopo due lavaggi con PBS, i campioni sono stati disciolti in 500 µL 1 NNaOH, incubati a 60 gradi per 1 ora e miscelati per solubilizzare la melanina. L'assorbanza a 405 nm è stata misurata utilizzando un lettore di micropiastre.
Esperimenti in vivo
L'efficacia depigmentante in vivo della galangina è stata valutata in esperimenti su animali. Gli studi sugli animali sono stati progettati dalla Banca dei tessuti per l'invecchiamento, approvati dal Comitato istituzionale per la cura degli animali dell'Università nazionale di Pusan ed eseguiti in conformità con le linee guida per la sperimentazione animale emesse dall'Università nazionale di Pusan. Topi glabri HRM2 maschi di sei settimane che possiedono melanina sono stati ottenuti da Hoshino Laboratory Animals (Yoshino, Saitama, Giappone) e alloggiati in condizioni controllate (23±1 grado, 55% ±5% di umidità, 12-h di luce /ciclo nero) con libero accesso all'acqua e dieta standard di laboratorio. Dopo un periodo di acclimatamento di 1 settimana, i topi sono stati divisi casualmente in quattro gruppi di sei animali. La galangina (10 µM) e l'acido cogico (50 µM) sono stati preparati in una soluzione composta da glicole propilenico ed etanolo (3: 7). La soluzione disciolta (200 µl) o il veicolo sono stati applicati localmente sulla pelle dorsale dell'animale una volta al giorno. Gli animali sono stati irradiati con UVB da un CROSSLINKER (BEX-800, Ultra-Lum Inc., CA, USA) a 50 mJ/cm2 in conformità con il programma sperimentale sugli animali. I colori dei siti cutanei sono stati misurati utilizzando uno spettrofotometro CR-10 (Konica Minolta Sensing, Inc., Sakai, Osaka, Giappone) in cui i colori sono stati descritti dai loro valori L*, a* e b* secondo il sistema di colori della Commission International de L'Eclairage. Dopo che gli animali sono stati sacrificati, le pelli sono state raccolte, fissate in paraformaldeide al 4% durante la notte a temperatura ambiente e colorate per la melanina utilizzando un kit di colorazione Fontana-Masson dell'American Master*Tech Scientific, Inc. (Lodi, CA, USA) in secondo le istruzioni del produttore. In breve, le pelli affettate sono state colorate con una soluzione di argento ammoniacale per 60 minuti a 60 gradi, incubate in cloruro d'oro allo 0,1% e poi in tiosolfato di sodio al 5%.
Analisi statistiche
Il test t di Student è stato utilizzato per analizzare le differenze tra due gruppi e ANOVA è stato utilizzato per analizzare le differenze tra i gruppi. Valori di p<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" the="" analysis="" was="" performed="" using="" graphpad="" prism="" 5="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca,="">
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RISULTATI
Simulazione di docking in silico di galangina su tirosinasi
La galangina è un fitochimico presente in natura e contiene una parte flavonoide nella sua struttura (Fig. 1). Inizialmente, è stata eseguita una simulazione di attracco tra la tirosinasi del fungo (struttura terziaria) e i composti (galangina, acido cogico e tirosina). Il sito di attracco a cui erano legati la galangina e l'acido cogico era stato precedentemente determinato come sito attivo della tirosinasi.15) Questa simulazione ha avuto successo ed è stato ottenuto un punteggio significativo. L'energia di legame tra galangina e tirosinasi era -7,67 kcal/mol, come determinato dall'analisi utilizzando Autodock4.2. L'energia di legame tra la tirosinasi e l'acido cogico (il controllo positivo) era di -4,09 kcal/mol e di -5,13 kcal/mol tra la tirosinasi e il substrato originale, la tirosina (Tabella 1). Questi risultati hanno mostrato che la galangina legava la tirosinasi con un'affinità maggiore rispetto alle altre interazioni. Sulla base dei risultati della simulazione di aggancio, abbiamo cercato le interazioni tra tirosinasi e composti utilizzando il programma LigandScout. Abbiamo scoperto che la galangina interagiva con ASN-260, VAL-283, ALA-286 e PHE-292, mentre l'acido cogico interagiva solo con ASN-260 e MET280 ( Fig. 2, Tabella 1). Queste interazioni possono quindi essere i determinanti chiave dell'attività dell'inibitore e avere un effetto importante sul punteggio di docking.
Determinazione degli effetti e dei meccanismi antimelanogenici nella tirosinasi dei funghi
Sulla base dei risultati in silicoresult e di altri risultati precedentemente riportati, abbiamo valutato gli effetti e i meccanismi antimelanogenici utilizzando la tirosinasi dei funghi. Quando testata con la tirosinasi del fungo nel sistema cellulare libero, l'efficacia inibitoria della galangina era più forte di quella dell'acido cogico (Fig. 3A). Inoltre, la galangina ha ridotto in modo dose-dipendente l'attività della tirosinasi (Fig. 3B). I valori IC50 di galangina e acido kojico sono stati calcolati e sono presentati nella Tabella 2. Il basso valore IC50 di galangina (3,55±0,39 µM) indicava che la potenza era significativamente superiore a quella di kojic acido (48,55±1,79 µM). Il meccanismo inibitorio della galangina è stato ulteriormente valutato utilizzando i diagrammi a doppio reciproco di Lineweaver-Burk. Per il test di inibizione sono state utilizzate varie concentrazioni di L-tirosina (1, 2, 4 e 8 mM) e galangina (0, 7,5 e 15 µM). Sono state misurate le variazioni dipendenti dal tempo nell'assorbanza e sono stati tracciati i risultati a doppio reciproco (Fig. 3C). I risultati hanno indicato che il grafico di 1/V rispetto a 1/[S] ha prodotto tre diverse linee con diverse pendenze, che si intersecavano sullo stesso asse verticale. All'aumentare della concentrazione del composto, il valore di Km è aumentato, ma i valori di Vmax sono rimasti gli stessi, suggerendo che la galangina fosse un inibitore competitivo del legame con la tirosinasi. Questi dati concordavano con i risultati in silico secondo cui la galangina si legava e inibiva il sito attivo della tirosinasi.
Fig. 1. Le strutture di galangina, acido kojico e tirosina
Valutazione dell'attività depigmentante della galangina nelle cellule di melanoma murino B16F10
Successivamente, l'attività depigmentante della galangina è stata valutata utilizzando cellule di melanoma murino B16F10. In primo luogo, sono stati testati gli effetti citotossici della galangina sulle cellule di melanoma murino B16F10. Come mostrato in Fig. 4A, la galangina ha ridotto significativamente la vitalità cellulare a dosi superiori a 25 µM. Pertanto, per evitare la citotossicità, abbiamo utilizzato galangina 5 µM e 10 µM negli esperimenti per valutare gli effetti antimelanogenici. Le cellule B16F10 sono state trattate con galangina in presenza di 1 µM -MSH. La sintesi totale di melanina causata dal trattamento con -MSH era visibile ad occhio nudo e ha mostrato che la galangina inibiva potentemente la sintesi di melanina innescata da -MSH (Fig. 4B). -Il trattamento con MSH ha aumentato significativamente l'attività della tirosinasi e il contenuto di melanina delle cellule B16F10 (Figg. 4C, D). Il trattamento con galangina ha inibito la melanogenesi cellulare, che è stata aumentata da -MSH in modo dose-dipendente (Figg. 4C, D). Nel complesso, questi risultati hanno indicato che la galangina potrebbe essere un potente agente per la soppressione della melanogenesi attraverso l'inibizione della tirosinasi.
Tabella 1. Punteggi di ancoraggio e principali residui interattivi dei composti
Effetti della galangina sulla pigmentazione cutanea in vivo
Gli effetti inibitori della galangina sono stati successivamente esaminati in topi glabri possessori di melanina che sono stati trattati come descritto dal programma in Fig. 5A. I colori dei siti cutanei sono stati misurati accuratamente utilizzando uno spettrofotometro. L'esposizione ai raggi UVB dei topi ha portato a una diminuzione del valore L*, che era rappresentativo della pigmentazione (Fig. 5B). Le diminuzioni indotte dai raggi UVB nel valore L* sono state significativamente bloccate negli animali trattati con galanina rispetto a quelli degli animali di controllo trattati con il veicolo, il che ha dimostrato la potente efficacia depigmentante della galanina (Fig. 5B). Il valore ΔL* indicava anche la potenza della galangina durante i periodi sperimentali (Fig. 5C). Inoltre, i colori della pelle rilevati ad occhio nudo il giorno 14 indicavano anche la potenza antimelanogenica della galangina (Fig. 5D). La colorazione Fontana-Mas son, che mette in evidenza la melanina, ha verificato gli effetti della galangina. I campioni di pelle degli animali irradiati con UVB hanno mostrato un aumento delle macchie di melanina (Fig. 5E). In accordo con i dati numerici della spettrofotometria, gli animali trattati con galanina hanno mostrato una diminuzione delle macchie di melanina colorate rispetto agli animali di controllo irradiati con UVB (Fig. 5E). Collettivamente, questi dati lo suggerivanogalaninaera un agente angiogenico efficace nel modello di melanogenesi in vivo indotto da UVB.
Fig. 2. I risultati della simulazione di docking in silico tra tirosinasi e composti candidati
DISCUSSIONE
È stato precedentemente riportato che la galangina esercita vari effetti biologici, inclusa la citoprotezione. Sebbene l'attività anti-tirosinasi della galangina sia stata precedentemente studiata, i meccanismi e l'accurata efficacia nei sistemi di coltura cellulare non sono stati completamente descritti.1,16) Pertanto, abbiamo mirato a esplorare la potenza ei meccanismi inibitori della galangina. L'efficacia inibitoria della galangina è stata inizialmente valutata utilizzando la simulazione di docking in silico. Le simulazioni di docking hanno rivelato che il legame della galangina al sito attivo della tirosinasi era più stabile di quelli del substrato originale (tirosina) o dell'acido cogico (controllo positivo). L'efficacia e i meccanismi inibitori sono stati confermati anche utilizzando la tirosinasi dei funghi. Infine, l'efficacia inibitoria della galangina contro la melanogenesi è stata valutata in cellule di melanoma murino B16F10 stimolate con MSH. In sintesi, il presente studio ha identificato la galanina come un potente agente.
La simulazione di docking computazionale è stata definita come un potente strumento per lo screening e la valutazione di nuovi agenti farmacologici.17) I risultati della simulazione di docking forniscono non solo i siti di legame ma anche l'affinità di legame tra il composto e l'enzima, che fornisce informazioni iniziali senza la necessità di esperimenti.18) Sebbene le previsioni non siano sempre accurate e richiedano ulteriori esperimenti, la simulazione di docking riduce i materiali e le risorse necessarie e può anche supportare i dati sperimentali biologici. La nostra simulazione di docking computazionale ha indicato che la galangina potrebbe legarsi più fortemente alla tirosinasi rispetto alla tirosina o all'acido cogico. Inoltre, il numero di residui interagenti tra galangina e tirosinasi era maggiore rispetto alla tirosina o all'acido cogico. I dati di docking iniziale sono stati ulteriormente verificati utilizzando un test dell'enzima tirosinasi, che ha mostrato che l'IC50 della galangina era inferiore all'acido cogico; quindi, gli effetti inibitori della galangina sulla tirosinasi erano più potenti dell'acido cogico.
Il meccanismo inibitorio della galangina sulla tirosinasi è stato ulteriormente esaminato utilizzando la tirosinasi dei funghi. Poiché i dati di simulazione dell'aggancio suggerivano che la galangina si lega allo stesso sito attivo a cui si lega la tirosinasi, si prevedeva che la galangina potesse essere un inibitore competitivo della tirosinasi. I risultati sperimentali hanno rivelato che la galangina ha inibito in modo competitivo la tirosinasi dal legare il suo substrato originale, la tirosina, il che ha confermato i risultati della simulazione di aggancio. Nel complesso, i risultati hanno dimostrato l'affidabilità della simulazione di docking computazionale e il suo potenziale per lo screening degli inibitori.
L'efficacia della galangina è stata valutata anche nelle cellule di melanoma murino B16F10. La galangina ha mostrato effetti citotossici significativi nelle cellule B16F10 quando somministrata a dosi elevate. Ciò era coerente con i precedenti rapporti sull'attività antitumorale della galangina in diverse linee cellulari tumorali.19,20) A causa degli effetti citotossici, gli esperimenti per verificare gli effetti anti-melanogenici delle cellule hanno richiesto un'attenta selezione delle condizioni. Tuttavia, il valore IC50 della galangina era molto basso quando testato in un sistema privo di cellule che non ha mostrato effetti citotossici. Infatti, l'efficacia della galangina per l'inibizione della melanogenesi era accettabile a basse dosi che non esercitavano citotossicità. Basse dosi di galangina hanno ridotto efficacemente il contenuto di melanina, così come l'attività della tirosinasi, nel sistema di coltura cellulare. Insieme al sistema senza cellule,galaninaha dimostrato di avere un forte effetto inibitorio sulla tirosinasi nel sistema di coltura cellulare.
Infine, l'effetto antimelanogeno della galangina è stato valutato utilizzando un topo glabro HRM2. Il modello murino glabro HRM2 ha fornito una base utile per esperimenti di melanogenesi in vivo, poiché il topo può produrre melanina, specialmente sotto stress ambientali.21,22) In questo modello murino, la galangina ha mostrato un significativo effetto antimelanogenico sulla sintesi di melanina indotta da UVB. A nostra conoscenza, questo è il primo studio a mostrare l'efficacia antimelanogenica della galangina utilizzando un modello di melanogenesi in vivo. È importante stabilire l'efficacia in vivo perché molti altri inibitori della melanogenesi non sono riusciti ad agire in vivo a causa della loro incapacità di attraversare lo strato corneo della pelle. In sintesi,galaninaè stato identificato come un potente agente angiogenico animale in vivo. Abbiamo concluso che l'inibitore della tirosinasi galangina offriva un nuovo farmaco candidato per il trattamento dei disturbi dell'iperpigmentazione.
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