Esperimento 3 Effetto del glicoside del feniletanolo della Cistanche Deserticola sul modello di perimenopausa del ratto Ⅲ

Esperimento 3 Effetto del feniletanolo glicoside della Cistanche deserticola sul modello di perimenopausa del ratto

1 Materiali sperimentali

1.1 Animali da esperimento

Ratti Wistar, grado SPF, femmine, forniti da Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., numero di certificato di ratto per questo lotto: 0017216; numero di certificato di laboratorio SYXK (Yu) 2010-001.

1.2 Farmaci sperimentali

Cistanche deserticola feniletanolo glicosideè stato preparato secondo il metodo dell'Esperimento 1 e il contenuto ha raggiunto il 66,47%. Gengnian'an Capsule, ingredienti: Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, corteccia di peonia, Poria cocos, madreperla, curculigo, Schisandra chinensis, magnetite, Polygonum multiflorum vite, Uncaria, grano galleggiante, polygonum multiflorum . Funzioni e indicazioni:Nutre lo yin e doma lo yang, alleviare i problemie calmare la mente. Utilizzato per vampate di calore e sudorazione della menopausa, vertigini, acufeni, irritabilità e insonnia. Specifiche: 0,3 g per capsula. Uso e dosaggio: Orale, 3 capsule alla volta, 3 volte al giorno. Produttore: Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Numero di lotto di produzione: 121104. Numero di approvazione: Approvazione nazionale del farmaco n. Z14021848.

Isoflavoni di soia e vitamina E capsule molli, lista degli ingredienti: isoflavoni di soia in polvere, vitamina E, olio di girasole, gelatina, glicerina, acqua, tartrazina, biossido di titanio. Ingredienti e contenuto iconici: ogni 100 g contiene 55,2 mg di isoflavoni di soia (calcolati come genisteina) e 608,5 mg di vitamina E. Funzioni salutari: aumenta la densità ossea. Istruzioni e dosaggio: Assumere 1 capsula 2 volte al giorno con acqua tiepida. Specifiche: 500 mg×100 capsule. Produttore: Weihai Ziguang Biotechnology Development Co., Ltd. Numero di lotto di produzione: 13070302. Numero di approvazione: National Food Health G20080032.

QUANTO TEMPO IMPIEGA LE CISTANCHE A FUNZIONARE?

1.3 Reagenti sperimentali

Carbossimetilcellulosa sodica, Tianjin Hengxing Chemical Reagent Manufacturing Co., Ltd., numero di lotto: 20120418; penicillina sodica per preparazioni iniettabili, North China Pharmaceutical Co., Ltd., specifica: 4 milioni di unità, numero di lotto di produzione: c1206807;

Soluzione di formaldeide (analiticamente pura), Yantai Shuangshuang Chemical Co., Ltd., numero di lotto di produzione: 20130902; Iniezione di cloruro di sodio allo 0,9%, Henan Shuanghe Huali Pharmaceutical Co., Ltd.; specifica: 250 ml, numero di lotto di produzione: 13082405B;

Cloralio idrato, Istituto di ricerca di chimica fine di Tianjin Guangfu, numero di lotto 20120827; Kit di rilevamento ELISA per ratti E2, società di ricerca e sviluppo, numero di lotto: 20140101A; Kit di rilevamento ELISA Rat T, società di ricerca e sviluppo, numero di lotto: 20140101A; Kit di rilevamento ELISA per ratti LH, società di ricerca e sviluppo, numero di lotto: 20140101A; Kit di rilevamento ELISA FSH per ratti, società di ricerca e sviluppo, numero di lotto: 20140101A;

2 Metodi sperimentali

2.1 Modellazione e somministrazione di farmaci

Metodo di modellazione: prendere 100 ratti Wistar femmine con un peso corporeo di 210~230 g, selezionare casualmente 12 ratti come gruppo vuoto e sottoporli a un intervento chirurgico fittizio, e i ratti rimanenti verranno utilizzati per creare la menopausa Modelli. Dopo che i ratti furono pesati, i ratti furono anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di cloralio idrato al 10% (0,3 ml/100 g) e la posizione addominale fu fissata. Quindi, i ratti sono stati tagliati da sotto l'ultima costola della schiena all'intersezione della linea medio-ascellare e a circa 2 cm dal lato laterale della colonna vertebrale, e quindi disinfettati. La pelle e i muscoli della schiena vengono incisi per circa 1 cm e nel campo visivo dell'incisione si può vedere una massa grassa lucida, bianco latte, e l'ovaio è incorporato in essa. Usa una piccola pinzetta per afferrare delicatamente la massa grassa ed estraila dall'incisione, separa la massa grassa e vedrai un gruppo di ovaie sottili, irregolari, di colore giallo-rosso. Durante il taglio, legare prima la tuba di Falloppio (incluso il grasso) sotto l'ovaio con un filo sottile, rimuovere completamente l'ovaia sinistra e rimuovere l'80% dell'ovaia destra. Dopo l'operazione, i corni uterini furono rimessi nella cavità addominale, i muscoli e la pelle furono suturati ed entrambe le ovaie furono rimosse allo stesso modo. Dopo l'operazione, gli animali sono stati allevati con cura e sono stati iniettati per via intramuscolare 200,000 u/kg di penicillina (0,1 ml ciascuno) per prevenire l'infezione, una volta al giorno per 3 giorni consecutivi. 5 giorni dopo l'intervento, è stato iniziato l'esame tramite striscio vaginale dei ratti uno per uno, una volta al giorno per 5 giorni consecutivi. I ratti con reazioni estrali nello striscio sono stati scartati. 72 ratti completamente castrati sono stati selezionati e divisi casualmente in 6 gruppi. A fini sperimentali, sono il gruppo modello, il gruppo Gengnianan, il gruppo degli isoflavoni di soia e il gruppo del glicoside del feniletanolo a dose grande, media e piccola Cistanche deserticola.

Metodo di preparazione: Metodo di preparazione: {{0}}.5% CMC Metodo di preparazione: Pesare 4 g di carbossimetilcellulosa sodica e mescolarli con acqua distillata per ottenere 800ml. I dosaggi delle dosi grandi, medie e piccole del gruppo Cistanche deserticola feniletanolo glicoside erano rispettivamente 133,33 mg/kg, 66,67 mg/kg e 33,33 mg/kg (volume di somministrazione 1 ml/100 g). Metodo di preparazione: pesare rispettivamente 1333,3 mg, 666,7 mg e 333,3 mg di flavonoidi totali di lampone, scioglierli con una piccola quantità di 0,5% CMC, quindi regolare il volume a 100 ml, mescolare bene e il gioco è fatto. Capsule di Gengniangan (450 mg/kg, miscelati con acqua distillata a 45 mg/ml, 1 ml/100 g, equivalenti a 10 volte il dosaggio clinico); Metodo di preparazione: prendere 15 capsule di Gengniangan, scioglierle prima con una piccola quantità di CMC allo 0,5%, quindi regolare il volume a 100 ml e mescolare bene, che è la dose di sospensione di capsule di Gengnianan (450 mg/kg). Capsule molli di isoflavone di soia e vitamina E (166,67 mg/kg, utilizzare acqua distillata per produrre 16,67 mg/ml, 1 ml/100 g, equivalenti a 10 volte il dosaggio clinico); Metodo di preparazione: prendere 4 capsule molli di isoflavoni di soia e vitamina E, scioglierle prima con una piccola quantità di 0,5% di CMC, quindi regolare il volume a 120 ml e mescolare bene per ottenere la dose di sospensione di capsule molli di isoflavoni di soia e vitamina E (16,67 mg/kg). ).

Metodo di somministrazione: agli animali di ciascun gruppo sono stati somministrati i farmaci corrispondenti il ​​primo giorno dopo l'intervento chirurgico. Il gruppo bianco e il gruppo modello sono stati sottoposti a sonda gastrica con lo stesso volume di soluzione CMC allo 0,5% (il volume della sonda gastrica era 1 ml/100 g) e il gruppo Gengnianan è stato sottoposto a sonda gastrica con sospensione di capsule di Gengnianan (450 mg/kg, equivalente a 10 volte la dose clinica ). ), al gruppo degli isoflavoni di soia è stata somministrata per via orale una sospensione in capsule molli di isoflavoni di soia e vitamina E (166,67 mg/kg, equivalente a 10 volte la dose clinica), e al gruppo con dose grande, media e piccolaCistanche deserticola feniletanolo glicosidei gruppi sono stati somministrati per via orale in base al gruppo. Dosi grandi, medie e piccole di Cistanche deserticola feniletanolo glicoside (i dosaggi sono rispettivamente 133,33 mg/kg, 66,67 mg/kg e 33,33 mg/kg, il volume della dose è 1 ml/100 g), somministrate una volta al giorno mediante somministrazione intragastrica, in modo continuo . medicinale per 30 giorni.

2.2 Elementi di osservazione e metodi di rilevamento

I punteggi del movimento orizzontale-verticale dei ratti in ciascun gruppo sono stati misurati 29 giorni dopo la somministrazione. 2 ore dopo l'ultima somministrazione gastrica (a digiuno da 15 ore), rimuovere i bulbi oculari per raccogliere il sangue, separare il siero eplasmae misurare il contenuto di E2, T, LH, FSH, GnRH e BGP nel siero e il contenuto di -EP nel plasma; i ratti sono stati sezionati. Rimuovere il timo, la milza, l'utero e il restante 20% del tessuto ovarico, pesarne il peso umido e calcolare l'indice degli organi di timo, milza e utero (indice degli organi=peso umido dell'organo mg/peso ratto g) , e quindi rimuovere il cervello. Per l'ipotalamo e la ghiandola pituitaria, sono stati preparati omogenati di tessuto dall'ipotalamo, dalla ghiandola pituitaria e da 1/2 dell'utero, e il contenuto dei recettori degli estrogeni nell'ipotalamo, nella ghiandola pituitaria e negli omogenati del tessuto uterino e gli androgeni sono stati determinati il ​​contenuto dei recettori negli omogenati del tessuto ipotalamico. Il timo, la milza, l'utero e l'ovaio sono stati fissati in una soluzione di formaldeide al 10%, incorporati in paraffina, sezionati e colorati con HE. ILcambiamenti istomorfologiciin ciascun gruppo sono stati osservati al microscopio ottico.

2.2.1 Prova con metodo in campo aperto

Il dispositivo sperimentale è una scatola cubica aperta con un'altezza di 40 cm e una lunghezza e larghezza di 80 cm. Le pareti circostanti e il fondo sono neri. Il fondo è composto da 25 blocchi di uguale area, divisi da linee bianche. Durante l'esperimento, il ratto è stato posizionato nel quadrato al centro della scatola aperta e il punteggio di attività orizzontale del numero di blocchi che il ratto ha attraversato sul fondo entro 5 minuti (si possono contare i quadrati con tutte e quattro le zampe inserite), e il numero di volte in cui gli arti posteriori sono rimasti in posizione verticale (due zampe anteriori erano in aria). (o aggrapparsi a un muro) punteggio di attività verticale. Le feci devono essere completamente rimosse dopo ogni esperimento e ciascun ratto viene misurato una volta 2 ore dopo la somministrazione. Questo esperimento è stato condotto in una stanza tranquilla.

2.2.2 Metodo di determinazione del kit

Ottenere campioni di siero: utilizzare provette prive di pirogeni ed endotossine. Evitare qualsiasi stimolazione cellulare durante l'operazione. Dopo aver raccolto il sangue, centrifugarlo a 3000 giri al minuto per 10 minuti per separare rapidamente e con attenzione il siero dai globuli rossi. Ottenere campioni di plasma: anticoagulare con provette anticoagulanti con eparina. Centrifugare a 3000 giri per 30 minuti e prelevare il surnatante. Ottenere campioni di tessuto omogenato: aggiungere una quantità adeguata di soluzione fisiologica al tessuto e schiacciarlo. Centrifugare a 3000 giri per 10 minuti e prelevare il surnatante.

Il metodo di determinazione del kit ELISA per ratto (Rat) estradiolo (E2) è lo stesso dell'Esperimento 2. Le concentrazioni degli standard (S0-S5) sono 0, 4, 8, 16, 32 e 64 µmol/l.

Il metodo di analisi del kit ELISA per ratto (ratto) testosterone (T) è lo stesso del metodo di analisi del kit ELISA per estradiolo. Le concentrazioni degli standard (S{{0}}S5) sono {{10}}, 2{{20}}, 40, 80, 160 e 320 pg /ml. Il metodo di determinazione del kit di rilevamento ELISA dell'ormone luteinizzante (LH) del ratto (ratto) è lo stesso del metodo di determinazione del kit di rilevamento ELISA dell'estradiolo. Le concentrazioni degli standard (S0-S5) sono 0, 3, 6, 12, 24 e 48 ml/ml. Il metodo di analisi del kit ELISA dell'ormone follicolo-stimolante (FSH) del ratto è lo stesso del metodo di analisi del kit ELISA dell'estradiolo. Le concentrazioni degli standard (S0-S5) sono 0, 0,75, 1,5, 3, 6 e 12 UI/L. Il metodo di determinazione del kit di rilevamento ELISA dell'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH) nel ratto (ratto) è lo stesso del metodo di determinazione del kit di rilevamento ELISA dell'estradiolo. Le concentrazioni degli standard (S0-S5) sono 0, 5, 10, 20, 40 e 80 mlU/ml.

Il metodo di determinazione del kit di rilevamento ELISA dell'osteocalcina di ratto (ratto) (BGP/OCN) è lo stesso del metodo di determinazione del kit di rilevamento ELISA dell'estradiolo. Le concentrazioni degli standard (S{{0}}S5) sono 0, 0,75, 1,5, 3, 6 e 12 ng/ml. Il metodo di determinazione del kit di rilevamento ELISA per ratti (Rat) -endorfina ( -EP) è lo stesso del metodo di determinazione del kit di rilevamento ELISA di estradiolo. Le concentrazioni degli standard (S0-S5) sono 0, 3, 6, 12, 24 e 48 pg/mL. Il metodo di determinazione del kit di rilevamento ELISA del recettore degli estrogeni (ER) nel ratto (ratto) è lo stesso del metodo di determinazione del kit di rilevamento ELISA dell'estradiolo. Le concentrazioni degli standard (S{{20}}S5) sono 0, 4, 8, 16, 32 e 64 pg/mL. Il metodo di determinazione del kit di rilevamento ELISA del recettore degli androgeni (AR) nel ratto (ratto) è lo stesso del metodo di determinazione del kit di rilevamento ELISA dell'estradiolo. Le concentrazioni degli standard (S0-S5) sono 0, 25, 50, 100, 200 e 400 pg/mL.

2.3 Modalità di elaborazione statistica

Per l'analisi dei dati è stato utilizzato il pacchetto statistico medico SPSS17.0 per l'elaborazione statistica dei dati. I dati di misurazione sono stati espressi come media ± deviazione standard (-x±s). Per il confronto tra i gruppi è stata utilizzata l’analisi della varianza unidirezionale. Il metodo LSD è stato utilizzato per verificare l'omogeneità delle varianze. , il test Games-Howell è stato utilizzato per le varianze irregolari e il test Ridit è stato utilizzato per i dati sui voti.

Dalla Tabella 11 e dalla Figura 14 si può vedere che, rispetto al gruppo bianco, l'indice del timo, l'indice della milza e l'indice uterino dei ratti nel gruppo modello erano significativamente diminuiti (P<0.01), indicating that the perimenopausal rat model was caused by incomplete removal of the ovaries. Atrophy of the thymus, spleen, and uterus occurs. Compared with the model group, each medication group can significantly improve the thymus and spleen index of perimenopausal model rats (P<0.01), and the Gengnianan, soy isoflavones, large and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside groups can significantly improve The uterine index of perimenopausal model rats was increased (P<0.01), and the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group significantly increased the uterine index of perimenopausal model rats (P<0.05).

3 Effetti sui livelli dell'indice biochimico del sangue nei ratti modello in perimenopausa

I contenuti sierici di E2, T, LH, FSH, GnRH e BGP e i contenuti plasmatici di -EP dei ratti in ciascun gruppo sono mostrati nelle Tabelle 12~13 e nelle Figure 15~17.

Dalle Tabelle 12~13 e dalle Figure 15~18 si può vedere che, rispetto al gruppo bianco, i livelli sierici di E2 e T dei ratti nel gruppo modello erano significativamente diminuiti (P<0.01), and the LH and FSH levels were significantly increased (P<0.01 ), indicating that incomplete ovarian removal causes sex hormone disorders in the perimenopausal rat model, and the perimenopausal rat model was successfully replicated. Compared with the model group, each medication group could significantly increase serum E2 and T levels (P<0.01) and reduce FSH levels; the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside, soybean isoflavones, and menganianan groups could significantly reduce the elevated levels. The LH level in the high-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group can be significantly reduced (P<0.05); the elevated LH level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group has a decreasing trend.

Tabella 14 Effetto del feniletanolo glicoside della Cistanche deserticola sui livelli sierici di GnRH e plasmatici di -EP nel modello di perimenopausa del ratto (-x±s)

Dalla Tabella 14 e dalle Figure 19-20 si può vedere che, rispetto al gruppo bianco, il livello sierico di GnRH dei ratti nel gruppo modello era significativamente aumentato e il livello plasmatico di -EP era significativamente diminuito (P<0.01), indicating that incomplete removal of the ovaries caused The perimenopausal rat model has sex hormone disorders, and related hormones secreted by the hypothalamus are also disordered due to negative feedback regulation. Compared with the model group, the GnRH levels in each medication group were significantly reduced (P<0.01), and the β-EP levels in the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group, soybean isoflavones group, and menanianan group were significantly increased (P<0.01). 0.01), the plasma β-EP level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group could be significantly increased (P<0.05).

4 Effetti sui contenuti di ER e AR nei tessuti di ratti modello in perimenopausa

Il contenuto di ER e AR nei tessuti rilevanti dei ratti in ciascun gruppo è mostrato nelle Tabelle 16~17 e nelle Figure 22~23.

Dalla Tabella 17 e dalla Figura 23 si può vedere che, rispetto al gruppo vuoto, il livello AR nell'ipotalamo del gruppo modello era significativamente più basso (P<0.01), indicating that the androgen receptors distributed in the hypothalamus of the perimenopausal rat model caused by incomplete ovary removal body, thereby reducing the biological effects of androgens. Compared with the model group, the AR levels in the hypothalamus of the large- and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group were significantly increased (P<0.01). The hypothalamic AR level of the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group was rising trend.

5 Effetti sulla morfologia dei tessuti degli organi nei ratti modello in perimenopausa

I risultati dell'osservazione patologica e istologica dell'utero, del timo e della milza dei ratti in ciascun gruppo sperimentale sono i seguenti. Le foto patologiche sono mostrate nell'Appendice 1 per le foto patologiche dei ratti modello in perimenopausa.

5.1 Effetto sulla morfologia del tessuto uterino nei ratti modello in perimenopausa

In base ai vari gradi di cambiamenti nell'endometrio, nelle ghiandole e nel miometrio dei ratti in ciascun gruppo sperimentale, sono stati utilizzati standard semiquantitativi per dividere la morfologia patologica del tessuto in quattro livelli e gli uteri dei ratti in ciascun gruppo sperimentale sono stati analizzati. misurato. I risultati dell’osservazione sono mostrati nella Tabella 18.

"-" Le cellule epiteliali endometriali, le ghiandole, il miometrio e la sierosa sono tutti normali; "+" le cellule epiteliali e le ghiandole endometriali sono atrofizzate e il miometrio e la sierosa sono normali; "++" l'epitelio endometriale. Le cellule e le ghiandole sono parzialmente atrofizzate, lo strato muscolare è leggermente atrofizzato e la sierosa è normale; Le cellule e le ghiandole epiteliali endometriali "+++" sono significativamente atrofizzate e la sierosa è normale.

Dopo il test Ridit, dalla Tabella 18 si può vedere che, rispetto al gruppo bianco, l'utero dei ratti nel gruppo modello mostrava significative lesioni tissutali patologiche (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the uterine pathological tissue lesions of mice (P<0.01).

5.2 Effetto sulla morfologia del tessuto ovarico nei ratti modello in perimenopausa

Secondo i diversi gradi di cambiamento nei follicoli, nel corpo luteo, nelle cellule della granulosa e nei vasi sanguigni nelle ovaie dei ratti in ciascun gruppo di esperimenti, sono stati utilizzati standard semiquantitativi per dividere la morfologia patologica del tessuto in quattro livelli. Le ovaie dei ratti in ciascun gruppo di esperimenti sono state misurate e osservate. I risultati sono mostrati nella Tabella 19.

Tabella 19 Effetto del feniletanolo glicoside della Cistanche deserticola sui cambiamenti patologici ovarici nei ratti modello in perimenopausa Unità: solo

"-" può mostrare follicoli in crescita, follicoli maturi e corpo luteo a tutti i livelli. Il corpo luteo è ben sviluppato, con molti strati di cellule della granulosa, ricco liquido follicolare e ricchi vasi sanguigni; "+" può mostrare follicoli in crescita, follicoli maturi e corpo luteo, ma il numero di follicoli maturi e di corpo luteo è piccolo. , i follicoli sono più piccoli e le cellule della granulosa sono meno stratificate; "++" può mostrare follicoli maturi e il corpo luteo, con più corpo luteo, meno cellule della granulosa e meno vasi sanguigni; "+++" non ha follicoli, ha più corpo luteo e l'ovaio è atrofico, avascolare.

Dopo il test Ridit, dalla Tabella 19 si può vedere che, rispetto al gruppo bianco, le ovaie dei ratti del gruppo modello hanno mostrato significative lesioni tissutali patologiche (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the ovarian pathological tissue lesions of rats (P<0.01).

5.3 Effetti sulla morfologia dei tessuti del timo e della milza nei ratti modello in perimenopausa

Utilizzando un micrometro, misurare lo spessore delle parti più spesse e più strette della corteccia timica di ciascun ratto in ciascun gruppo sperimentale per ottenere la media; utilizzare la linea di base del micrometro per cadere sui noduli splenici, misurare lo spessore dei noduli splenici su entrambi i lati con l'arteria centrale come centro e calcolare la media. I risultati misurati sono mostrati nella Tabella 20 e nella Figura 24.

Dalla Tabella 20 e dalla Figura 24 si può vedere che, rispetto al gruppo bianco, lo spessore della corteccia del timo e il volume dei noduli splenici nel gruppo modello erano significativamente ridotti (P<0.01), indicating that the thymus and spleen volumes atrophied after the perimenopausal model was created in rats. Compared with the model group, each medication group could significantly increase the thickness of the thymus cortex (P<0.01). Except for the low-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, all medication groups could significantly increase the volume of splenic nodules (P<0.01).