Studio Sperimentale Dei Meccanismi Anti-Fatica Sportiva Di Cistanche Deserticola

Contatto : emily.li@wecistanche.com

YANG Hong-xin1, YANG Yong2, YAN Xiao-hong1 (1.Dipartimento di Citobiologia, Inner Mongolia Medical College, Hohhot 010059, Cina; 2.Dipartimento di Oncologia, Ospedale della Regione Autonoma della Mongolia Interna, Huhhot 010017, Cina)

Astratto:Obiettivo Studiare l'effetto dicistanche desertichesull'isoenzima lattato deidrogenasi (LDH), sul glicogeno e sull'ossido nitrico sintasi 3 (NOS3) del fegato nei topi gravano sul nuoto ed esplorano i meccanismi molecolari rilevanti dell'affaticamento antisportivo. Metodi I topi sono stati divisi nel gruppo di controllo normale, il gruppo di controllo sportivo e ilcistanche desertichegruppo sperimentale. A ciascun topo del gruppo di controllo orale e del gruppo di controllo sportivo è stata somministrata soluzione fisiologica 0,2 ml al giorno. Ad ogni topo del gruppo sperimentale cistanche deserticola è stato somministrato un decotto di acquacistanche desertiche0,2 ml (3 g/kg) al giorno. Le amministrazioni sono state per 15 giorni. Il carico di nuoto per 90 minuti è stato effettuato sui topi del gruppo di controllo sportivo e del gruppo sperimentale cistanche deserticola a 1 ora dall'ultima somministrazione. I fegati dei topi sono stati rimossi dopo 10 ore di nuoto. Una parte del fegato è stata fissata nel liquido di formalina neutra per preparare le sezioni di paraffina e le altre sono state utilizzate per la misurazione dell'attività dell'LDH. La struttura del fegato è stata osservata mediante colorazione di HE e il glicogeno epatico è stato misurato mediante colorazione di glicogeno. NOS3 è stato esaminato con il metodo immunoistochimico SP. Risultati La struttura epatica del gruppo di controllo sportivo era gravemente lesa, l'isoenzima di LDH4 e LDH5 era più alto, il glicogeno epatico era scarso, NOS3 era diminuito rispetto al gruppo di controllo normale (P<0.05). the="" liver="" structure="" of="" the="" cistanche="" deserticola="" experimental="" group="" was="" good,="" ldh5="" isoenzyme="" was="" low,="" the="" glycogen="" was="" rich="" and="" expression="" of="" nos3="" was="" upregulated="" compared="" with="" the="" sport="" control="" group="" (p=""><0.05). conclusions="">Cistanche desertichepotrebbe diminuire l'LDH5, proteggere il fegato dei topi che nuotano e accelerare l'accumulo di glicogeno aumentando l'espressione di NOS3 per proteggere il fegato e migliorare il recupero della capacità fisica.

Parole chiave:cistanche desertiche;glicogeno epatico;ossido nitrico sintasi 3;topi.

foto di Cistanche

Cistanche,noto anche come Dayun, è un'erba parassitaria di due anni delle Ledanaceae. Ha steli carnosi secchi con squame. Viene prodotto principalmente in terreni sabbiosi e praterie semisabbiose nella Mongolia Interna, nel Gansu, nello Xinjiang, nel Qinghai e in altri luoghi. Mongolia continentaleCistancheha la migliore qualità tra tutte le aree di produzione.Cistancheè di natura dolce, salata e calda. Entra nelrenie il meridiano dell'intestino crasso. Le sue funzioni principali sono nutrire i reni e rafforzare lo yang, nutrire l'essenza e il sangue e idratare l'intestino. Viene spesso usato per trattare l'impotenza, l'infertilità, la debolezza della vita e delle ginocchia, la debolezza dei muscoli e delle ossa, l'intestino secco e la stitichezza. Questo studio si propone di osservare gli effetti diCistanchesu topi nuotatori portanti lattato deidrogenasi epatica (LDH), glicogeno epatico e ossido nitrico sintasi 3 (NOS3) attraverso un test di nuoto portante nei topi e per esplorare il suo meccanismo protettivo sul fegato. Pertanto, può fornire una base teorica per la ricerca, lo sviluppo e l'utilizzo approfonditi diCistanche negli alimenti salutari per lo sport.

1 Materiali sperimentali

1.1 Animali

30 ratti Kunming maschi, grado pulito, peso corporeo (20±0,5) g, forniti dall'Animal Center of Inner Mongolia University.

1.2 Farmaci

Cistanche deserticheYCMa, prodotto a Ejina Banner, Mongolia Interna ed è stato identificato. Secondo il materiale medicinale originale: acqua=100 g: 400 ml, prima immergere per 30 min, scaldare e far bollire, quindi decollare a fuoco caldo per 30 min. Versare la medicina liquida e ricostituire nel rapporto di 100 g: 200 ml. I due decotti sono stati miscelati insieme e filtrati con due strati di garza, quindi concentrati nell'equivalente di 1 g del medicinale originale per millilitro di soluzione brodo di decotto d'acqua, conservato in frigorifero a 4 gradi .

1.3 Reagenti e strumenti

L'anticorpo policlonale NOS3 è stato acquistato da Wuhan Boster Bioengineering Co., Ltd. Il kit SP è stato acquistato dalla Fujian Maixin Reagent Company. Il kit dell'isoenzima della lattato deidrogenasi è stato acquistato dalla Inner Mongolia Tongri Reagent Company (di proprietà esclusiva di Nissan). Analizzatore di immagini a colori Nanjing JD-80. Sistema americano di analisi dell'immagine del gel UVP.

2 Metodo sperimentale

2.1 Raggruppamento e dosaggio

I topi Kunming sono stati divisi casualmente in gruppo di controllo normale, gruppo di controllo dell'esercizio eCistanchegruppo sperimentale, con 10 topo in ogni gruppo. Al gruppo di controllo normale e al gruppo di controllo dell'esercizio è stata somministrata una soluzione salina normale una volta al giorno, 0,2 ml/volta; ilCistancheè stato assegnato un gruppo sperimentalecistancedecotto (prendere 3 ml del decotto d'acqua originale e aggiungere acqua a 10 ml). Una volta al giorno, 0,2 ml/volta, la dose giornaliera è di 3 g/kg e 15 giorni di seguito. Un'ora dopo l'ultima somministrazione, i topi nel gruppo di controllo dell'esercizio e ilCistanchegruppo sperimentale è stato caricato con un peso di piombo 1 g sulla coda e sono stati posti in una piscina di 50 cm di altezza, 50 cm di lunghezza e 35 cm di larghezza per nuotare sotto la temperatura (30±0,5) gradi , Osservare costantemente i topi, se si scopre che smettono di nuotare, utilizzare un bastoncino di legno per stimolare i loro movimenti per 90 minuti. Dopo l'esercizio, seguire una dieta normale, riposare per 10 ore e quindi sopprimere i topi con i normali topi del gruppo di controllo. Estrarre il fegato, fissare una parte con il 10 percento di formaldeide neutra e renderla spessa 4 µm dopo la disidratazione, la trasparenza, l'immersione nella cera e l'incorporamento. Utilizzare il metodo di colorazione HE per osservare la struttura del tessuto epatico di ciascun gruppo. L'altra parte è stata lavata con normale soluzione fisiologica e conservata congelata a -20 gradi e scongelata a temperatura ambiente durante la misurazione. Immergere con carta da filtro e pesare, quindi preparare l'omogeneizzato di fegato con soluzione salina normale, centrifugare a 3 500 r/min per 15 min. Prendere il supernatante e misurare l'attività dell'isoenzima lattato deidrogenasi mediante elettroforesi.

2.2 Determinazione dell'attività della lattato deidrogenasi

Utilizzando l'elettroforesi su gel di poliacrilammide, gli isoenzimi di LDH vengono separati in base alle loro differenze di mobilità elettroforetica. La concentrazione del gel di separazione del campione è del 7%, pH 8,9, e la concentrazione del gel concentrato è del 4%, pH 6,8. 10 µL il campione viene miscelato con 1 goccia di glicerolo e indicatore blu di bromofenolo. Il tampone dell'elettrodo è Tris-glicina (pH 8,7), iniziare a stabilizzare la tensione a 100-150 V, aggiungere a 200-250 V dopo 30 min ed elettroforesi per 4 h. Dopo l'elettroforesi, è stato colorato con il kit di isoenzima lattato deidrogenasi e colorato a 37 gradi per 30 minuti, mostrando una banda di isoenzima lattato deidrogenasi blu, quindi risciacquato con acqua, fissato con acido acetico glaciale. Infine, utilizzare il sistema di analisi dell'immagine del gel UVP per l'analisi dei dati.

2.3 Colorazione del glicogeno

Le sezioni seriali spesse 4 µm vengono regolarmente deparaffinate in acqua. mettere in una soluzione acida periodica all'1% a 37 gradi per 15 minuti. sciacquato con acqua corrente. mettere in soluzione di Schiff per 60 min. risciacquato con acqua corrente, disidratato con etanolo a gradiente, xilene trasparente e montato con gomma neutra. Quindi osservare i risultati della colorazione al microscopio.

2.4 Colorazione immunoistochimica

Le fette vengono regolarmente deparaffinate in acqua e l'antigene viene riparato con microonde tampone citrato. Agire con la soluzione A per 10 minuti per rimuovere la perossidasi endogena e bloccare con la soluzione B (siero di capra diluito) per 10 minuti. Aggiungere l'anticorpo primario in una scatola umidificata a 4 gradi durante la notte e lavare con una soluzione PBS a pH 7,4 per 5 min × 3 volte il secondo giorno. Quindi aggiungere la soluzione C marcata con biotina (soluzione di lavoro con anticorpi secondari) e incubare per 10 min, lavare con la soluzione PBS per 5 min × 3 volte. Aggiungere la soluzione D marcata con perossidasi di rafano e incubare per 10 min, lavare con la soluzione PBS per 5 min × 3 volte. Infine, è stato sviluppato in soluzione DAB per 5 minuti, lavato con acqua di rubinetto, controcolorato con HE, disidratato con etanolo a gradiente, trasparente con xilene e montato con gomma neutra. Osservare al microscopio ottico dopo aver montato la pellicola. In ogni lotto di esperimenti, è stata utilizzata una soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) come controllo negativo invece dell'anticorpo primario.

2.5 Analisi dell'espressione dell'ossido nitrico sintasi 3

Osservazione preliminare con metodo visivo semiquantitativo al microscopio ottico, il prodotto NOS3 positivo è marrone scuro o marrone. Il prodotto positivo si trova nel citoplasma degli epatociti o delle cellule endoteliali tra gli epatociti e lo sfondo blu è negativo. Quindi utilizzare il sistema di analisi dell'immagine a colori per misurare il valore di grigio del reagente positivo. Sotto un obiettivo 40x, i parametri di 4 campi visivi vengono misurati casualmente per ciascuna pellicola e viene preso il valore medio. Questo parametro viene utilizzato per riflettere il cambiamento dell'intensità della colorazione di NOS3.

2.6 Metodi statistici

Tutti i dati sono espressi come x-±s e SPSS11.0 il pacchetto software statistico viene utilizzato per t-test e P<0.05 is="" considered="" as="" significant="">

3. Risultati

3.1 Osservazione della struttura dei tessuti al microscopio ottico

La struttura dei lobuli epatici nel gruppo normale è chiara, i cordoni cellulari sono disposti ordinatamente, i sinusoidi epatici sono normali, le cellule epatiche non hanno lesioni evidenti e la struttura nucleare è chiara. La normale struttura tissutale del gruppo di controllo dell'esercizio è scomparsa, i confini del lobulo non erano chiari e il cordone cellulare era disordinato, la maggior parte dei sinusoidi epatici è scomparsa e l'estesa degenerazione vacuolare degli epatociti si manifesta con un aumento del volume cellulare. Il citoplasma è sciolto, leggermente colorato, anche chiaro e trasparente, e alcune cellule epatiche mostrano un tipico cambiamento a palloncino, con una piccola quantità di necrosi focale o puntata. Le cellule epatiche delCistanchegruppo sperimentale erano leggermente torbidi, ma erano organizzati regolarmente. Non c'erano vacuoli evidenti e scioltezza nelle cellule, i cordoni cellulari erano disposti in modo ordinato e la struttura del nucleo era chiara.

3.2 Effetti sull'attività degli isoenzimi della lattato deidrogenasi epatica nei topi sotto carico (vedi Tabella 1)

3.3 Osservazione della colorazione del glicogeno epatico al microscopio ottico

Sebbene il contenuto di glicogeno nel gruppo di controllo normale non sia elevato, vi è glicogeno in ciascuna cellula epatica, la distribuzione è uniforme e non vi è alcun fenomeno del vacuolo. Il gruppo di controllo dell'esercizio aveva meno glicogeno, sparso nelle cellule del fegato e in alcune aree apparivano vacuoli; il gruppo sperimentale Cistanche era ricco di glicogeno, ma ne raccoglieva molto su un lato della cellula.

3.4 Osservazione dell'espressione dell'ossido nitrico sintasi 3 al microscopio ottico e analisi quantitativa dell'immagine

C'è una forte espressione positiva nel citoplasma degli epatociti nel gruppo di controllo normale, che è diffusamente distribuito, specialmente nelle cellule binucleari, ed espressione positiva nelle cellule endoteliali. L'espressione nel citoplasma degli epatociti e delle cellule endoteliali nel gruppo di controllo dell'esercizio è stata indebolita.Cistancheil gruppo sperimentale aveva un'espressione positiva nel citoplasma degli epatociti e una forte espressione positiva nelle cellule endoteliali. I risultati dell'analisi dell'analizzatore di immagini a colori sono mostrati nella Tabella 2.

4. Discussione

Il movimento del corpo umano ha bisogno di energia e anche il corpo ha bisogno di energia nel processo del metabolismo Il metabolismo cellulare utilizza direttamente l'energia dalla decomposizione dell'adenosina trifosfato (ATP) e l'energia necessaria per la sintesi dell'ATP è in definitiva fornita principalmente dal catabolismo dello zucchero . Gli studi hanno dimostrato che dopo un intenso esercizio fisico, il corpo produrrà una grande quantità di H plus , radicali liberi, acido lattico e altre sostanze che influenzano il normale metabolismo delle cellule. Allo stesso tempo, la mancanza di glucosio nelle cellule porta all'affaticamento dell'esercizio e al danno cellulare. I risultati di questo studio mostrano che il danno alla struttura del tessuto epatico è molto grave dopo molto esercizio e colpisce anche l'anabolismo cellulare, come la riduzione della sintesi del glicogeno epatico. Si può osservare che i topi che assumono Cistanche riducono il danno epatico dopo molto esercizio, principalmente a causa della riduzione di LDH5, e il contenuto di glicogeno epatico è significativamente superiore a quello del gruppo di controllo dell'esercizio, suggerendo cheCistanchepuò raggiungere la protezione del fegato e mantenere la normale fisiologia riducendo la funzione LDH5. Dai risultati della colorazione del glicogeno, il contenuto di glicogeno delCistanchegruppo sperimentale è superiore a quello del gruppo di controllo normale. FaCistancheaumentare le riserve di glicogeno epatico prima dell'esercizio o accelerare la sintesi del glicogeno sotto stress dopo l'esercizio? Non si può trarre alcuna conclusione perché non esiste un gruppo di controllo che non si esercitaCistanchenell'esperimento. Deve ancora essere confermato nella fase successiva, ma l'effetto protettivo di Cistanche sul fegato e la promozione della sintesi del glicogeno dopo molto esercizio sono evidenti.

Il NO è una piccola sostanza molecola che è stata molto apprezzata dalla comunità sportiva negli ultimi anni. NOS è il principale fattore limitante per la produzione di NO. È stato confermato che NOS ha 3 tipi di isoenzimi. NOS1 è chiamato ossido nitrico sintasi neuronale. Esiste nelle cellule neuronali, nelle cellule muscolari scheletriche, ecc. ed è principalmente coinvolto nei processi di neurosviluppo, neurosecrezione, apprendimento e memoria. NOS2 è una sintasi di ossido nitrico inducibile, che si trova principalmente nelle cellule muscolari lisce, nei macrofagi e nei linfociti. Una volta che questo enzima è stato indotto, può continuare a sintetizzare NO fino a quando il substrato non è esaurito o la cellula muore. Attualmente si ritiene che sia coinvolto nel danno cellulare; NOS3 è un ossido nitrico sintasi endoteliale, distribuito principalmente nelle cellule endoteliali e negli epatociti. L'NO prodotto è principalmente coinvolto nelle funzioni fisiologiche. I risultati di questo studio mostrano che l'espressione di NOS3 nelle cellule endoteliali e negli epatociti è indebolita dopo molto esercizio e l'NO risultante è ridotto, in modo che i vasi sanguigni non possano essere efficacemente espansi, il flusso sanguigno è ridotto e le materie prime per il glicogeno sintetico non può essere trasportato alle cellule del fegato, quindi la sintesi del glicogeno è ridotta.

Cistanche funzione antifatica

Cistanchepuò sovraregolare l'espressione di NOS3 nelle cellule endoteliali e nelle cellule del fegato. Espandere i vasi sanguigni in modo reattivo. Aumenta il flusso sanguigno, accelera la capacità di trasportare le materie prime di sintesi del glicogeno. Accelera la sintesi del glicogeno e mantiene il corpo a un normale livello metabolico fisiologico. Pertanto, la riduzione dell'LDH5 per proteggere il fegato e la sovraregolazione dell'espressione di NOS3 per promuovere la gluconeogenesi dell'acido lattico possono essere un meccanismo importante perCistancheper proteggere il fegato e favorire il recupero fisico. Questa ricerca fornisce una base scientifica sperimentale per l'ulteriore sviluppo e utilizzo diCistanchenel campo della medicina dello sport, e pone anche le basi per lo sviluppo e la purificazione diL'effetto di Cistanchesostanze.

Artical da: "Experimental Study of Anti-Sports Fatigue Effect Mechanisms of Cistanche Deserticola" di YANG Hong-xin1, ecc.

-----Giornale cinese di informazioni su MTC aprile 2008 Vol.15 No.4