Studio sperimentale dell'effetto protettivo del pretrattamento con glicosidi cistanchi sulla lesione da ischemia-riperfusione renale

per ulteriori informazioni:ali.ma@wecistanche.com

Zhu Jun, Zhao Ximin

(Dipartimento di chirurgia, Baoshan District Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai 201900)

【Astratto】Obiettivo Stabilire un modello di rianimazione dello shock emorragico nei ratti e osservare l'effetto protettivo diCistancheglicosidi totali (CTG) sul danno da ischemia-riperfusione renale. Metodi I ratti SD sono stati divisi casualmente in 3 gruppi: gruppo di operazione simulata, gruppo sperimentale (gruppo di rianimazione shock), gruppo di trattamento CTG, 10 ratti in ciascun gruppo. Il gruppo sperimentale e il gruppo di trattamento CTG hanno stabilito modelli di ischemia-riperfusione renale. I ratti nel gruppo di trattamento sono stati iniettati con CTG 400 mg/kg per via intraperitoneale e il gruppo sperimentale e il gruppo dell'operazione fittizia sono stati iniettati con soluzione salina. Il contenuto del miocardio nel sangue, il contenuto di azoto ureico e la cistatina C di ciascun gruppo sono stati rilevati per determinare la funzione renale, l'analisi della citometria a flusso è stata utilizzata per rilevare il tasso di apoptosi delle cellule renali; Il test immunoenzimatico (ELISA) è stato utilizzato per rilevare il legame del cromosoma X nel rattorenetessuto Espressione dell'inibitore legato all'X della proteina dell'apoptosi (XIAP). Risultati Confrontando il gruppo CTG con il gruppo sperimentale, Cr ematico, BUN e cistatina C erano significativamente ridotti (P<0.01), renal="" cell="" apoptosis="" was="" reduced=""><0.05), ctg="" can="" significantly="" increase="" the="" expression="" of="" xiap=""><0.05). conclusion="" the="" total="" glycosides="" of="">cistancehanno un effetto protettivo sul danno da ischemia-riperfusione renale nei ratti, che può essere correlato alla promozione dell'espressione di XIAP.

[Parole chiave] rene; danno da ischemia-riperfusione; glicosidi totali di cistanche; inibitore legato al cromosoma della proteina dell'apoptosi; apoptosi; ratto

[Numero di classificazione della biblioteca cinese] R692 [Codice marcatura documento] A [Numero articolo] 1008 -0392 (2015) 02-0037 -04

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La lesione da ischemia-riperfusione (I/R) è un fenomeno fisiopatologico comune di danno renale nel processo di shock emorragico, trauma grave,renetrapianto, erenechirurgia del tumore. Gli studi hanno dimostrato che l'apoptosi è una parte importante del danno alla funzione renale causato da un danno I/R (1). L'inibitore legato all'X della proteina dell'apoptosi (XIAP) è uno dei più potenti inibitori dell'apoptosi endogena trovati finora (2). Ci sono pochi studi sull'effetto anti-apoptotico di XIAP nel tessuto renale dopo danno I/R.Cistanchei glicosidi totali (CTG) sono un composto di glicosidi totali feniletanoidi estratti daCistanche, che ha diverse funzioni biologiche. Ci sono pochi studi sulla sua protezione renale dopo danno I/R. . Questo studio ha stabilito un modello di rianimazione shock emorragico nei ratti e ha stabilito un modello di lesione I/R sistemica per esplorare l'effetto protettivo dei glicosidi totali dell'ernia della carne sulrenedalla lesione I/R ed esplorare il suo possibile meccanismo.

1Materiali e metodi

1.1 Animali e raggruppamento

Ci sono 30 ratti maschi sani e puliti forniti dal Centro Sperimentale dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Shanghai, del peso di (320 ± 30) g. Divisi casualmente in 3 gruppi: gruppo operazione sham, gruppo sperimentale (gruppo di rianimazione shock), gruppo CTG, ciascuno con 10 ratti.

1.2 Principali reagenti e strumenti

I glicosidi totali del riso glutinoso (numero di lotto: 20081516) sono stati acquistati da Zhejiang Hangzhou Xinghui Tianli Pharmaceutical Co., Ltd.; sodio pentobarbital, Hoechst 33258 e propionil ioduro sono stati acquistati da Sigma, USA; Il kit di analisi delle proteine ​​(XIAP) e il kit ELISA dell'inibitore dell'apoptosi legato al cromosoma X del topo sono stati acquistati da Shanghai Kemin Biotechnology Co., Ltd.; il lettore di micropiastre è stato acquistato da Thermo Company, USA; rilevatore fisiologico multiparametrico è stato acquistato da Nihon Kohden Company, Giappone; citometro a flusso BDFACSAria è stato acquistato da Becton, USA -Dickinson Company; Il trocar 24G è stato acquistato dalla Shandong Jierui Medical Devices Company.

1.3 Metodo sperimentale

1.3.1 Preparazione del modello animale I ratti SD sono stati a digiuno 12 ore prima dell'esperimento e anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di sodio pentobarbital (50 mg/kg).

Il ratto è stato fissato in posizione supina, è stata praticata un'incisione di 3 cm nell'addome inferiore sinistro, l'arteria femorale è stata separata, è stato inserito un trocar 24G ed è stato collegato un rilevatore fisiologico multiparametrico. La pressione sanguigna media del ratto è stata misurata come (113 ± 15) mmHg, siringa da 20 ml di eparina. La pressione sanguigna è stata ridotta a 40 mmHg (l mmHg=0. 133 kPa) con un dispositivo a tre vie di connessione chimica. Lo shock è stato considerato iniziato e la pressione sanguigna è stata mantenuta per 90 minuti. Il volume del salasso era (13 ± 3) ml, quindi il sangue autologo nella siringa La reinfusione lenta richiede circa 30 minuti e la pressione sanguigna torna a oltre il 90 percento del valore di base e la rianimazione è considerata riuscita (3) . Il trequarti è stato estratto, l'arteria femorale è stata legata e l'incisione è stata suturata. Dopo che i topi furono svegli, furono riportati nella gabbia per l'osservazione e furono liberi di mangiare e bere. 24 h dopo la rianimazione, è stata utilizzata l'iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico (50 mg/kg) per l'anestesia, la laparotomia, sono stati raccolti 5 ml di sangue dalla vena cava inferiore, i ratti sono stati immediatamente sacrificati e i reni sinistro e destro sono stati prelevati per uso.

1.3.2 Metodi farmacologici Al gruppo di trattamento con CTG è stato somministrato CTG 2 ore prima del salasso dei ratti e iniettato nella cavità addominale alla dose di 400 mg/kg. Al gruppo sperimentale è stato iniettato per via intraperitoneale 3 ml di soluzione fisiologica 2 ore prima del salasso; il gruppo operatorio fittizio è stato sottoposto solo ad anestesia, laparotomia e separazione dell'arteria femorale, posizionamento di un trequarti e sutura dell'incisione, ma nessun sanguinamento o rianimazione. Il resto era lo stesso del gruppo sperimentale.

1. 4 indicatori e metodi di rilevamento

1.4.1 Determinazione del contenuto ematico di BUN, Cr e cistatina C La cistatina C è un marker endogeno delle variazioni della velocità di filtrazione glomerulare. Quando la funzione renale è compromessa, la velocità di filtrazione glomerulare diminuisce, la concentrazione di cistatina C nel sangue può aumentare di 10 volte e l'accuratezza diagnostica della cistatina C è significativamente migliore di quella dell'intossicazione muscolare sierica. Il contenuto di BUN, Cr e Cistatina C nel sangue è stato sottoposto al laboratorio del nostro ospedale per la determinazione.

1.4.2 Determinazione del tasso di apoptosi cellulare La citometria a flusso è stata utilizzata per rilevare il tasso di apoptosi delle cellule renali. Prendete il rognone e tritatelo con una lama, aggiungete un po' di PBS e trasferitelo in una provetta. Aggiungere 0,3 percento di tripsina da digerire in un bagnomaria a 37 P, incubare per 20 min, quando il contenuto della provetta diventa torbido, aggiungere 2 volte PBS per fermare la digestione, filtrare con una rete di nylon da 300 mesh, eliminare le impurità e centrifugare in una centrifuga a bassa temperatura. Raggio della centrifuga 8 cm, 12,000 r/min, centrifugare per 5 min, eliminare il surnatante, regolare la concentrazione cellulare su 1 ~ 1,5 x 106/ml, prelevare 0,4 ml della sospensione cellulare di cui sopra e aggiungere 1,2 ml Hoechst 33258 (10 pil/ml), scuro 37 t: incubare a bagnomaria, tappare la provetta, risciacquare con PBS dopo 5 min, centrifugare raggio 8 cm, 12 000 r/min, centrifugare per 5 min , scartare il supernatante, risciacquare nuovamente allo stesso modo. Aggiungere 0,4 ml di PI, colorato per 5 minuti e rilevare la percentuale di cellule normali, necrotiche e apoptotiche nel rene. In base all'affinità dei due coloranti di vari tipi di cellule, è noto che solo le cellule colorate con PI sono cellule morte, solo le cellule colorate Hoechst 33258 sono cellule apoptotiche e nessuna di esse è cellule viventi normali colorate.

1.4.3 Saggio immunoenzimatico (ELISA) per rilevare l'espressione di XIAP nei tessuti renali di ratto Prendere ciascun gruppo di reni e trattare i tessuti renali freschi con lisato tissutale. Centrifugare in una centrifuga a bassa temperatura a 12 000 r/min per 5 min. Prendere il supernatante e operare secondo le istruzioni del kit XIAP ELISA Kit. Shanghai Jiaotong University Fenghe Technology Co., Ltd. è responsabile dei test.

1.5 Elaborazione statistica

I dati sperimentali di ciascun gruppo sono rappresentati da Yuan soil s e SPSS 17. Il software 0 viene utilizzato per l'analisi statistica. P<0.05 indicates="" that="" the="" difference="" is="" statistically="">

Cistanche può migliorare la funzione sessuale

2 risultati

Indici di funzionalità renale I valori di Cr, BUN e cistatina C erano statisticamente significativi (F<0.01); the="" experimental="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" the="" sham="" operation="" group="" (p=""><0.01), indicating="" that="" the="" rat="" the="" kidney="" i/r="" model="" was="" successfully="" prepared;="" compared="" with="" the="" experimental="" group,="" the="" values="" of="" cr,="" bun="" and="" cystatin="" c="" in="" the="" ctg="" group="" were="" significantly="" reduced=""><0.01). renal="" cell="" apoptosis="" rate:="" in="" the="" sham-operated="" group,="" only="" a="" few="" cells="" in="" the="" kidney="" tissue="" experienced="" apoptosis.="" apoptotic="" cells="" accounted="" for="" 0.42%="" ±="" 0.08%,="" and="" the="" experimental="" group="" had="" a="" significant="" increase="" in="" apoptosis,="" accounting="" for="" 18.="" 22%="" ±="" 5.="" 32%="" (p=""><0.01). compared="" with="" the="" experimental="" group,="" the="" ctg="" group="" showed="" apoptosis="" the="" number="" decreased="" to="" 12.71%="" ±="" 3.81%="">< 0.01).="" the="" effect="" of="" ctg="" on="" the="" expression="" of="" xiap="" in="" i/r="" injured="" renal="" tissue:="" the="" sham="" operation="" group="" only="" had="" weak="" xiap="" expression,="" while="" the="" experimental="" group="" xiap="" expression="" increased="" significantly,="">< 0.01).="" compared="" with="" the="" experimental="" group,="" the="" ctg="" group="" can="" significantly="" increase="" the="" expression="" of="" xiap="" (f=""><0.05), see="" table="">

Tabella 1 Indici di funzione renale Cr, BUN e valori di cistatina-C dei ratti in ciascun gruppo Tab. 1 Indici di funzione renale in tre gruppi

Rispetto al gruppo di operazioni fittizie, *P<0.01; compared="" with="" the="" experimental="" group,=""><0.05><>

Il meccanismo del danno renale da ischemia-riperfusione è molto complicato. È un processo patologico che si verifica in molti modi sotto l'azione di vari fattori, come il sovraccarico di ioni calcio, il danno da perossidazione lipidica, l'apoptosi e la necrosi cellulare, tra cui l'apoptosi cellulare caspasi-dipendente è una delle principali forme di cellula epiteliale tubulare renale danno indotto da danno renale I/R (4). La famiglia dell'inibitore della proteina dell'apoptosi (IAP) è l'unico inibitore della caspasi endogeno trovato finora nelle cellule dei mammiferi, che può prevenire efficacemente l'insorgenza dell'apoptosi cellulare. XIAP è il membro con il più forte effetto inibitorio sulla caspasi nella famiglia IAP. Può inibire l'apoptosi cellulare causata da una varietà di stimoli patologici e svolgere un effetto protettivo sugli organi danneggiati (5).

Attualmente, la maggior parte dei metodi per stabilire modelli animali di danno renale I/R consiste nell'asportare un rene e bloccare l'altro lato del peduncolo renale o dell'arteria renale ⑹ per simulare lo stato del trapianto di rene. Questo studio utilizza un modello di shock/rianimazione emorragico, che è più vicino al processo fisiopatologico di ischemia-riperfusione sistemica che si verifica nello shock clinico traumatico. In questo esperimento, i livelli ematici di BUN, Cr e cistatina C di ratti SD Un miglioramento significativo, una funzione renale gravemente compromessa, è un modello animale ideale per lo studio del danno renale I/R.

Il CTG è un ingrediente medicinale importante della pasta di carne per ragazze della medicina tradizionale cinese. La pasta di melanzane, di natura calda, dolce e salata, ritorna ai meridiani dei reni e dell'intestino crasso ed era originariamente contenuta nella Materia Medica di Shennong. "Ben Sutra": Le cinque fatiche principali e sette ferite, nutrono la parte centrale, nutrono i cinque organi interni, rafforzano lo yin, nutrono l'essenza e il qi;Cistancheè stato utilizzato nel mio paese per duemila anni. In passato è al primo posto nelle formule per aumentare la forza e al secondo posto nelle formule nutrienti dopo il ginseng. Gli studi lo hanno dimostratoCistanchePoteremigliorare la funzione sessuale, regolare il neuroendocrino, emigliorare la funzione immunitaria. , Antiossidanti, promuovere il metabolismo materiale, proteggere il miocardio ischemico e altre funzioni. Come ingrediente medicinale principale della purea di famiglia della carne, il CTG ha molte funzioni. La ricerca sui modelli di ischemia-riperfusione cerebrale ha scoperto che il CTG può ridurre gli aminoacidi eccitatori nel tessuto cerebrale dopo l'ischemia-riperfusione e proteggere il tessuto cerebrale dei ratti SD (7). CTG ha uneffetto antiossidantesui tessuti del topo e ha un certo effetto protettivo sull'ipossia cerebrale acuta nei topi e sul danno muscolare cardiaco nei topi (9). CTG può migliorare significativamente il neurocomportamento diParkinsontopi modello e inibiscono la diminuzione del numero di neuroni dopaminergici nella substantia nigra (9). Migliorando l'attività degli enzimi scavenging dei radicali liberi, prevenendo la perossidazione lipidica, inibendo la deposizione del peptide B-amiloide nel cervello e inibendo l'apoptosi delle cellule cerebrali, CTG migliora significativamente l'apprendimento diIl morbo di Alzheimertopi causati dal peptide B-amiloide Capacità di memoria w. Questo studio ha mostrato che dopo l'applicazione del pretrattamento CTG, il contenuto ematico di BUN, Cr e cistatina C dei ratti è diminuito in modo significativo e il danno renale è stato ridotto. CTG ha aumentato la proteina XIAP che inibisce l'apoptosi nel tessuto renale danneggiato da I/R e ha bloccato l'apoptosi cellulare. Il verificarsi della morte ha un effetto protettivo sul danno al rene.