Esplorando il potenziale degli estratti di alghe islandesi prodotti dall'estrazione assistita da campi elettrici pulsati acquosi per applicazioni cosmetiche Parte 2

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2.4. Capacità antiossidanti degli estratti di alghe islandesi

A.esculenta ha avuto la più forte attività di scavenging DPPH tra gli estratti grezzi delle tre specie di alghe (p<0.05), with="" scavenging="" effects="" higher="" than="" 90%(table="" 3).="" compared="" with="" the="" different="" standard="" solutions,="" a.esculenta="" showed="" comparable="" scavenging="" activity="" as="" 100ug/ml="" of="" ascorbic="" acid="" (87.9%),="" gallic="" acid="" (91.0%),="" and="" α-tocopherol="" (87.9%).="" our="" results="" were="" in="" agreement="" with="" recent="" studies="" [50],="" which="" also="" reported="" a="" positive="" antioxidant="" activity="" of="" a.esculenta="" extracts.="" surprisingly,="" no="" significant="" differences="" in="" antioxidant="" activity="" were="" observed="" between="" the="" different="" extraction="" methods="" tested="" (p="">0.05). Ci si aspettava che gli estratti di PEF mostrassero valori antiossidanti migliori rispetto agli estratti prodotti con l'estrazione tradizionale a caldo poiché altri studi hanno dimostrato che le tecniche verdi (come l'estrazione assistita da microonde o l'estrazione enzimatica) potrebbero efficacemente evitare la decomposizione dei composti bioattivi, esibendo una maggiore attività antiossidanti [59,60].

È stata anche studiata la capacità degli estratti di alghe di ridurre lo ione ferrico (Fe8#) in ferroso (Fe2 plus) e la capacità di eliminare il radicale ABTS, rispettivamente con il metodo FRAP e ABTS. I risultati FRAP hanno mostrato tendenze simili a DPPH, mostrando che A. esculenta aveva la capacità più forte di ridurre gli ioni ferrici (Fe3 plus) in ferrosi (Fe2 plus) tra gli estratti grezzi delle tre specie di alghe (p<0.05). however,="" a="" different="" behavior="" was="" found="" for="" the="" abts.="" all="" seaweed="" extracts="" showed="" a="" similar="" ability="" to="" scavenge="" the="" radical="" abts="" (p="">0.05), indicando che queste specie contengono probabilmente alcuni composti efficienti responsabili della loro attività di scavenging.

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In generale, è noto che le alghe brune presentano un potenziale antiossidante più elevato rispetto alle famiglie rosse e verdi [61]. I nostri risultati hanno anche mostrato che gli estratti acquosi di A. esculenta hanno mostrato efficaci attività antiossidanti per quanto riguarda lo scavenging dei radicali liberi e il potere riducente, suggerendo che A. esculenta potrebbe potenzialmente essere una risorsa per gli antiossidanti naturali. L'elevata attività antiossidante osservata per gli estratti di A.esculenta potrebbe essere legata all'alto contenuto di composti fenolici determinati negli estratti di alga bruna. In molti studi, l'attività antiossidante degli estratti di alghe è stata attribuita ai composti fenolici, mostrando correlazioni positive tra contenuto fenolico e capacità di scavenging principalmente con DPPH[62,63]. Risultati di correlazione simili sono stati trovati nel presente studio per gli estratti di A.esculenta (si veda una migliore discussione nella Sezione 2.6. Correlazioni tra composti chimici e proprietà bioattive).

2.5. Attività inibitorie enzimatiche degli estratti di alghe islandesi

Gli estratti di alghe islandesi hanno mostrato effetti inibitori positivi verso tutti gli enzimi testati (Tabella 4), aprendo nuove strade per lo sfruttamento degli inibitori enzimatici naturali dalle risorse delle alghe. Per quanto ne sappiamo, questa è la prima volta che vengono testate le attività inibitorie enzimatiche degli estratti di alghe islandesi prodotti dal PEF.

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2.5.1. Attività di inibizione della collagenasi

Gli estratti di A.esculenta hanno mostrato un'inibizione della collagenasi positiva che variava dal 68 al 91%, mentre gli estratti di P. palmaria e U. Lactuca hanno mostrato attività di inibizione insignificante contro la collagenasi (Tabella 4). L'estratto di acqua calda di A.esculenta ha mostrato un'attività di inibizione della collagenasi del 71,1%, che era superiore alla soluzione standard di epigallocatechina-3-gallato(EGCG)(63,2%) e paragonabile allo standard positivo fornito dal kit enzimatico commerciale (74,9%). Una scoperta importante è stata che gli estratti di A.esculenta prodotti dal PEF hanno mostrato un'inibizione della collagenasi del 91 percento, esibendo un'attività ancora maggiore rispetto all'inibitore fornito dal kit commerciale. Va evidenziato che tale attività è stata osservata solo negli estratti d'acqua prodotti da PEF e non dalla combinazione di PEF più HW. Questo comportamento può essere spiegato dalla possibilità che il processo dell'acqua calda possa avere un effetto negativo sui composti responsabili dell'inibizione dell'attività della collagenasi. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per spiegare questi risultati a causa della complessità degli estratti di alghe grezze. Il suddetto gruppo di ricerca sta attualmente lavorando all'identificazione delle molecole di inibizione negli estratti di A.esculenta per comprendere meglio questi effetti positivi prodotti dal PEF.

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I risultati relativi all'inibizione della collagenasi da parte degli estratti di A.esculenta sono in accordo con i dati precedenti, in cui A.esculenta viene utilizzato negli estratti commerciali per il suo effetto antietà. La degradazione del collagene si verifica con l'invecchiamento a causa dell'attività della collagenasi, con conseguente formazione di rughe sulla pelle. L'inibizione della collagenasi da parte di composti naturali è un'interessante opportunità per i prodotti antietà. Ad esempio, SEPPIC, un fornitore di ingredienti per l'industria cosmetica, offre un estratto lipofilo di A.esculenta (Kalpariane AD) [64].

2.5.2. Attività di inibizione dell'elastasi

Only the crude extracts of A.esculenta inhibited elastase, exhibiting activities higher than 70% of inhibition (Table 4). However, the anti-elastase activities of A.esculenta extracts did not statistically differ among extraction methods (p>{{0}}.05). Rispetto alle soluzioni di quercetina, un noto inibitore dell'elastasi che mostrava un'inibizione del 100% a 1 mM e del 58,7% a 0,5 mM, le prestazioni degli estratti di A. esculenta erano elevate.

L'elastasi è un enzima proteasico che può ridurre l'elastina rompendo specifici legami peptidici. Di conseguenza, l'inibizione dell'attività dell'elastasi nello strato del derma può essere utilizzata per mantenere l'elasticità della pelle [65]. Molti estratti vegetali sono stati identificati come inibitori dell'elastasi [17]; tuttavia, sono state condotte poche indagini sull'inibizione dell'elastasi da risorse di alghe. Secondo i dati della letteratura, i polifenoli estratti dalle piante sono noti per essere potenti inibitori dell'elastasi e della ialuronidasi [66]. Uno studio recente ha riportato che i florotannini, il tipo di tannino nelle alghe brune, gli estratti di alghe marine Eisenia bicycles e l'alga bruna Ecklonia cava, apportano benefici alla pelle riducendo significativamente l'attività dell'elastasi [67]. Gli estratti di A.esculenta prodotti in questo studio hanno mostrato i valori di TPC e TFC più elevati rispetto alle altre specie studiate (Tabella 4), quindi questo potrebbe essere il motivo per cui gli estratti acquosi di P. palmaria e U. Lactuca non hanno mostrato anti- attività di elastasi. Per confermare questa ipotesi, è stata condotta un'analisi di correlazione di Pearson, suggerendo che l'attività antienzimatica correla positivamente con il contenuto di sostanze fenoliche (si veda un'ulteriore discussione nella Sezione 2.6. Correlazioni tra composti chimici e proprietà bioattive).

2.5.3. Attività di inibizione della tirosinasi

Gli estratti di A.esculenta hanno mostrato un'inibizione della tirosinasi positiva superiore al 90% per tutti i metodi di estrazione utilizzati, mentre gli estratti di P.palmaria e U. Lactuca non hanno mostrato effetti inibitori della tirosinasi (Tabella 4). Tuttavia, le attività anti-tirosinasi degli estratti di A.esculenta non differivano (p<0.05) with="" extraction="" methods.="" comparing="" the="" effect="" of="" a.esculenta="" extracts="" with="" the="" quercetin="" solutions="" tested,="" the="" crude="" extracts="" of="" the="" brown="" algae="" showed="" better="" inhibitory="" activities="" than="" these="" solutions(88="" and75%="" for="" the="" 0.5="" and="" 1="" mm="" quercetin="" solutions,="" respectively).="" based="" on="" the="" literature,anti-tyrosinase="" activities="" of="" plants,="" bacteria,="" and="" fungi="" have="" been="" reported="" by="" several="" researchers="" i68i.="" however,="" though="" different="" studies="" suggest="" that="" bioactive="" compounds="" derived="" from="" marine="" algae="" have="" a="" good="" potential="" to="" be="" utilized="" as="" skin="" whitening="" agents="" [13],="" this="" is="" still="" an="" unexplored="" domain="" and="" only="" a="" few="" studies="" have="" been="" carried="" out.="" most="" of="" the="" studies="" performed="" in="" this="" area="" have="" been="" focused="" on="" brown="" algae,="" agreeing="" with="" the="" results="" of="" the="" present="" study="" in="" which="" a.esculenta="" extracts="" exhibited="" the="" best="" anti-tyrosinase="" activities.="" for="" instance,="" phloroglucinol="" derivatives="" and="" phlorotannins,="" common="" secondary="" metabolites="" found="" in="" brown="" algae,="" have="" shown="" inhibitory="" activity="" against="" tyrosinase="" due="" to="" their="" ability="" to="" chelate="" copper="" [69].="" in="" a="" recent="" study,="" the="" extract="" of="" the="" brown="" algae="" lessonia="" trabeculate="" produced="" by="" microwave-assisted="" extraction="" inhibited="" a="" tyrosinase="" activity="" of="" 33.73%[60].in="" another="" study,="" the="" extract="" of="" the="" brown="" algae="" turbinaria="" conoides="" showed="" activity="" as="" an="" antioxidant="" and="" tyrosinase="" inhibitor,="" however,="" in="" this="" case,="" ethanol="" was="" used="" as="" solvent="" [70].="" a="" significant="" correlation="" between="" the="" inhibitory="" potency="" of="" polyphenols="" extracted="" from="" plants="" on="" mushroom="" tyrosinase="" has="" been="" reported="" in="" previous="" studies="" [68].="" likewise,="" the="" results="" of="" this="" study="" suggest="" that="" the="" inhibitory="" activity="" towards="" tyrosinase="" was="" positively="" correlated="" with="" flavonoid="" and="" phenolic="" content="" (see="" section="" 2.6.="" correlations="" between="" chemical="" compounds="" and="" bioactive="">

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La tirosinasi svolge un ruolo importante nella biosintesi del pigmento di melanina nella pelle. La melanina è responsabile della protezione contro le radiazioni ultraviolette dannose, che possono causare diverse condizioni patologiche [71]. Inoltre, può creare problemi estetici quando la melanina si accumula sotto forma di macchie iperpigmentate [72]. Pertanto, incorporare inibitori della tirosinasi nei prodotti cosmetici può essere attraente a causa degli effetti sbiancanti e/o schiarenti.

2.5.4. Attività di inibizione della ialuronidasi

Tutti gli estratti di alghe hanno mostrato un'attività anti-ialuronidasi significativamente elevata (Tabella 4), mostrando risultati paragonabili alle soluzioni di acido tannico (un noto inibitore della ialuronidasi). In particolare, gli estratti di A.esculenta hanno mostrato il 100 percento di inibizione per tutti i metodi testati. Inoltre, gli estratti di U. Lactuca hanno mostrato attività superiori al 90 percento di inibizione, dove l'inibizione degli estratti prodotti da PEF (96,8 percento o) e la combinazione di PEF più HW (97,3 percento) era superiore all'inibizione prodotta dal tradizionale caldo metodo dell'acqua 93,4 percento )(pag<0.05). all="" p.palmaria="" extracts="" exhibited="" similar=""><0.05), the="" inhibition="" of="" the="" extracts="" produced="" by="" pef="" was="" (91.9="" %)and="" the="" combination="" of="" pef+hw="" (89.5%)="" and="" the="" traditional="" hot="" water="" method="">

Altri autori hanno anche descritto l'attività anti-ialuronidasica di diversi estratti di alghe, in particolare estratti ricchi di florotannini da alghe brune [73,74]. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, questa è la prima volta che vengono riportate attività inibitorie della ialuronidasi di estratti di P.palmata e U. Lactuca prodotti da PEF.

L'acido ialuronico è un componente importante del derma, dove è coinvolto nella riparazione dei tessuti, si rompe con l'invecchiamento, causando rughe e perdita di compattezza della pelle. In questo senso, gli inibitori della ialuronidasi aumentano il livello di acido ialuronico della matrice extracellulare dermica per il miglioramento dell'aspetto dell'invecchiamento della pelle del viso [13].cistanciaPertanto, i risultati di questo studio potrebbero aprire nuove strade per lo sfruttamento degli inibitori naturali della ialuronidasi dalle risorse di alghe con un potenziale utilizzo nei prodotti cosmetici.

In sintesi, i dati raccolti ci hanno permesso di concludere che gli estratti di A.esculenta hanno mostrato attività inibitorie complessivamente migliori rispetto a P.palmaria e U.lactuca nei confronti degli enzimi testati. Pertanto, essendo la specie di alga più promettente con ottime attività antienzimatiche e quindi è stata selezionata per ulteriori studi nel nostro laboratorio. Sebbene gli estratti grezzi di A. esculenta sembrino essere buoni candidati per esperimenti in vitro, sono necessari ulteriori studi per chiarire l'identità dei metaboliti responsabili di questi effetti biologici.

2.6.Correlazioni tra composti chimici e proprietà bioattive

I risultati dell'analisi delle componenti principali (PCA), hanno mostrato che la principale separazione dei gruppi era definita da PC1 e PC2, che rappresentavano rispettivamente il 71,9% e il 14,5% della varianza dei dati (Figura 2). Gli estratti di A.esculenta erano caratterizzati da un contenuto più elevato di flavonoidi e composti fenolici, effetti inibitori sugli enzimi (collagenasi, tirosinasi ed elastasi) e valori di DPPH e FRAP, rispetto alle altre specie, P. palmata e U.lactuca. D'altra parte, A.esculenta aveva un contenuto di carboidrati inferiore, soprattutto rispetto a P. palmitate (che si trovava sul lato opposto del PC1). La variazione dei dati lungo il PC2 era principalmente correlata all'inibizione dell'ABTS e della ialuronidasi. Come indicato dalla posizione sulla trama, P. palmitate aveva una correlazione più forte con ABTS mentre U.lactuca era più correlato agli effetti di inibizione della ialuronidasi, rispetto a queste due specie.

Un'elevata e significativa correlazione positiva tra TPC, TFC, DPPH, FRAP ed effetti inibitori su collagenasi, elastasi e tirosinasi è stata dimostrata dall'analisi di correlazione di Pearson (Tabella 5).

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Ciò era in accordo con studi precedenti, secondo cui i composti fenolici (compresi i flavonoidi) sono i principali contributori all'attività antiossidante di varie alghe [75-77]. L'elevata attività antiossidante degli estratti di macroalghe brune è stata correlata a un gruppo specifico di polifenoli, florotannini e alla loro struttura molecolare unica. Si dice che il phlorotannis delle alghe brune abbia fino a otto anelli fenolici interconnessi che agiscono come trappole di elettroni [78,79]. Ci si aspettava che gli ABT fossero correlati al TPC e ad altri parametri antiossidanti. Possibili ragioni potrebbero essere che i metodi si basano su diverse condizioni di reazione e che la reattività differisce sia per quanto riguarda il tempo che la gamma dei componenti. Ad esempio, il reagente ABTS reagisce con una gamma più ampia di antiossidanti rispetto al radicale DPPH [80]. D'altra parte, una delle limitazioni menzionate per ABTS è una lunga reazione e il tempo di reazione generale potrebbe non consentire il raggiungimento di un punto finale.

I risultati indicano che esiste un'elevata correlazione positiva tra TPC e TFC all'attività inibitoria di collagenasi, elastasi e tirosinasi ({{0}}.93-0.99), mentre la relazione con l'inibizione di ialuronidasi non era così forte (r=0,42 e 0,54, rispettivamente). Ciò indica che altri componenti potrebbero aver contribuito all'effetto inibitorio degli estratti. Altri studi hanno riportato che i polisaccaridi hanno attività inibitoria della ialuronidasi, ad esempio l'acido alginico nelle alghe brune [81,82]. Sono necessari ulteriori studi sulla composizione chimica delle specie di macroalghe per gli effetti dei composti isolati sull'enzima per valutare il contributo di ciascun componente chimico poiché in questo studio l'attenzione era rivolta agli estratti grezzi. I risultati erano in armonia con studi precedenti, affermando che la composizione chimica e i livelli di bioattività degli estratti variano significativamente tra i tre ceppi (alga rossa, verde e bruna) e tra specie diverse appartenenti allo stesso phylum e sono influenzati dall'età e tipo di tessuto. Inoltre, la composizione e le caratteristiche dipendono da molti fattori ambientali che influenzano la distribuzione e la crescita delle macroalghe. Ad esempio, luce (radiazioni UV), temperatura, disponibilità di nutrienti, esposizione all'aria, movimento dell'acqua, esposizione alle onde e salinità. La temperatura è stata descritta come il fattore che ha i maggiori effetti sulla formazione del pigmento e sulla concentrazione dei nutrienti, sulla salinità e sui raggi UV come fattori che influenzano la concentrazione di TPC [83].

La distribuzione delle diverse specie di macroalghe varia con la profondità dell'acqua. Le posizioni più in alto della costa nella zona intertidale o litoranea sono più stressanti poiché le specie che crescono lì devono resistere a molteplici cambiamenti nei fattori abiotici dovuti ai cambiamenti delle maree. Ad esempio, l'effetto essiccante dell'aria, l'irraggiamento solare elevato (con la bassa marea), le variazioni di salinità e temperatura e, in condizioni di bassa temperatura dell'aria, compreso il congelamento. Al di sotto della soglia di bassa marea, l'aumento della profondità comporta una diminuzione molto rapida dell'intensità della luce e una minore esposizione all'irraggiamento.

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Le alghe che crescono nell'intervallo di marea hanno una minore sensibilità alle radiazioni UV e si riprendono più rapidamente dallo stress solare. Mentre le alghe che crescono nella zona sublitorale sono più sensibili ai raggi UV e hanno un minor recupero dallo stress solare [84]. Allo stesso tempo, la colonna d'acqua fornisce protezione. Nel presente studio, l'esposizione alla luce solare era presumibilmente maggiore per P. palmitate, rispetto alle altre specie. Altri studi hanno dimostrato che la formazione di MAA è direttamente correlata alla luce solare [85], proteggendo gli organismi dalle radiazioni UV-A e UV-B. Inoltre, è stato dimostrato che la quantità specifica di MAA diminuiva con l'aumentare della profondità di raccolta. È noto che alghe come A.esculenta crescono nella zona sublitorale superiore ma si estendono anche nell'intertidale più bassa appena sopra il livello di bassa marea. Ciò significa che la colonna d'acqua ha fornito una protezione più forte rispetto a P. palmitate. Inoltre le caratteristiche morfologiche sono diverse, le lame di A.esculenta sono più spesse rispetto alle altre due specie. interfaccia utente. lactuca, che cresce principalmente nell'intertidale e nel sublitorale, è in grado di fotosintetizzare e crescere con irraggiamenti molto bassi. È stato affermato che l'esposizione alla luce UVB accelera il recupero dei parametri fotosintetici di U.lactuca dagli effetti negativi della luce UVA. È più piccolo, di struttura più semplice e di breve durata (3 mesi) sia di A.esculenta (5-7 anni) che di P. palmata che ha una nuova crescita ogni anno.

In sintesi, si può trarre l'ipotesi che le principali differenze nelle proprietà degli estratti siano la variazione della durata della vita, delle caratteristiche morfologiche e delle condizioni di crescita delle specie di alghe.

3. Materiali e metodi

3.1. Materiali

Le alghe islandesi U.lactuca (alghe verdi), A.esculenta (alghe brune) e P. palmitate (alghe rosse) sono state fornite dalle cozze blu islandesi e dalle alghe, che hanno raccolto le alghe a Breidafjordur (Islanda occidentale). Dopo la raccolta le alghe sono state essiccate (a circa il 90% di materiale secco), macinate e consegnate sottovuoto. I campioni sono stati conservati in un luogo asciutto e buio a temperatura ambiente fino al momento dell'uso.

Tirosinasi da fungo, L-3,4-diidrossifenilalanina (L-DOPA), elastasi da pancreas suino, acido ascorbico, N-succinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (AAPVN), ialuronidasi da testicoli bovini, quercetina, a-tocoferolo, acido tannico,2,2-difenil-1-picrylidrazyl(DPPH),2,4,6-Tripiridil-s-triazina (TPTZ), Trolox, Folin- Il reagente Ciocalteu, l'acido gallico e un kit di analisi colorimetrica dell'attività della collagenasi (MAK293) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA). Il sale di sodio dell'acido ialuronico è stato acquistato da MakingCosmetics (Redmond, WA, USA). Tutti gli altri prodotti chimici e reagenti utilizzati erano di grado analitico e ottenuti da VWR International, LLC. L'acqua deionizzata (Elix Essential, Merck, Darmstadt, Germania) è stata utilizzata per l'estrazione e la preparazione di soluzioni a base d'acqua.

3.2. Progettazione sperimentale

È stato utilizzato un disegno fattoriale per valutare gli effetti delle specie di alghe islandesi (U. Lactuca, A. esculenta, P. palmitate) e il trattamento di estrazione (estrazione di acqua calda (HW,95 gradi), estrazione assistita da PEF (PEF) e la combinazione di entrambe le tecniche (PEF più HW), sulla composizione dell'estratto e sulla bioattività (Tabella 6) L'estrazione è stata effettuata in triplicato per ciascun gruppo e ogni replicato dell'estratto è stato analizzato in triplicato.

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3.3. L'estrazione di bioattivi dalle alghe islandesi

Lo sfruttamento della biomassa macroalgale a diversi livelli ha motivato gli scienziati a esplorare tecniche di estrazione più ecologiche, efficienti ed economiche, basate su approcci di estrazione verde. In questo lavoro, l'estrazione assistita da PEF è stata valutata come un metodo nuovo ed ecologico per produrre estratti funzionali, mentre l'estrazione tradizionale con acqua calda è stata utilizzata per il confronto. Inoltre è stato studiato l'effetto della combinazione di entrambe le tecniche, il trattamento PEF delle macroalghe seguito dall'estrazione tradizionale di acqua calda, sul recupero bioattivo. A causa della prevista elettroporazione prodotta nelle membrane cellulari dopo il trattamento fisico, la successiva estrazione con acqua calda potrebbe facilitare ulteriormente il rilascio del materiale intracellulare [86], aumentando il campo di estrazione. È necessario un tempo dopo il trattamento affinché i materiali si diffondano fuori dalle cellule [87,88] e in questo esperimento le sospensioni hanno aspettato una notte fino alla separazione del liquido (estratto) dalla polpa.

Per quanto riguarda il mezzo di estrazione, per produrre gli estratti di alghe è stata utilizzata acqua distillata per superare le limitazioni relative all'uso di solventi tossici e organici. L'acqua si è rivelata un buon solvente per l'estrazione di numerosi composti bioattivi dalle alghe [46,{1}}] ed è rispettosa dell'ambiente. Inoltre, l'acqua è comunemente usata per l'estrazione assistita da PEF in quanto è un buon conduttore per l'elettricità.

3.3.1. Procedure di estrazione

Per ogni replicato in ciascun gruppo, le alghe (15 g) sono state messe a bagno per una notte a temperatura ambiente (22 gradi) in acqua deionizzata (300 ml). Quindi, la sospensione è stata trattata con PEF (PEF), riscaldata (HW) o sia trattata con PEF che riscaldata (PEF più HW). Le sospensioni sono state conservate per una notte in frigorifero, seguite da filtrazione con carta da filtro grossolana (20 um). Quindi i filtrati (estratti) sono stati conservati a 4 gradi fino alla loro analisi.

L'estrazione assistita da campo elettrico pulsato è stata effettuata utilizzando un generatore di impulsi costruito internamente. Aveva un condensatore FuGHCK-200-2000 (Fu.G.Elektronik GmbH, Rosenheim, Germania) e uno spinterometro (18,5 kV OG75, Perkin-Elmer Optoelectronics, GMBH, Wiese-baden, Germania). L'apparecchiatura PEF ha generato impulsi di decadimento esponenziale con una larghezza di 0.96 us e un'ampiezza di 18 kV. Per trattare le sospensioni con un campo elettrico di 8 kV/cm a 1,2 Hz per 10 min. . Gli estratti HW sono stati preparati riscaldando la sospensione in un becher a bagnomaria termostatico e mantenuti a 95 gradi per 45 min. Per il trattamento combinato di campo elettrico pulsato e riscaldamento, le sospensioni sono state trattate con PEF e quindi poste in un becher, riscaldate a bagnomaria e mantenute a 95 gradi per 45 minuti.

3.3.2. Misurazioni di conducibilità, pH e temperatura

La conducibilità elettrica e il pH delle sospensioni di alghe sono stati misurati dopo l'ammollo e dopo i trattamenti di estrazione, a temperatura ambiente, utilizzando un pHmetro (Orion StarTM A215 pH/Conductivity Benchtop Meter, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) dotato di sensore di conducibilità e elettrodo combinato a triodo pH/ARC. Inoltre sono state registrate le variazioni di temperatura dovute ai trattamenti.

3.4. Profili spettrali degli estratti di alghe

Gli spettri di assorbimento UV-VIS dei diversi estratti di alghe sono stati misurati nell'intervallo da 200 a 450 nm utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis Thermo Scientific Evolution 350 a doppio raggio (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) con cuvette di quarzo da 1 cm. Sono state eseguite tre scansioni per ciascun estratto di alghe.

3.5. Determinazione del Contenuto Polifenolico Totale

Il contenuto fenolico totale (TPC) negli estratti di alghe è stato determinato utilizzando il reagente Folin-Ciocalteu seguendo un metodo leggermente modificato descritto da Zhang [92] utilizzando uno spettrofotometro a micropiastre Multiskan Sky (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA). Un volume di 20 μl di estratto di alghe o soluzione standard seriale sono stati mescolati con 100 μl di reattivo Folin-Ciocalteu (10 percento in acqua distillata). Dopo 5 minuti, sono stati aggiunti 80 μl di soluzione di carbonato di sodio al 7,5 percento (/ w). La miscela di reazione è stata incubato a temperatura ambiente e al buio per 30 minuti. L'assorbanza è stata misurata alla lunghezza d'onda di 760 nm. L'acqua distillata è stata utilizzata come bianco. Una curva standard di acido gallico è stata utilizzata per determinare il contenuto fenolico totale ed espresso come ug di equivalenti di acido gallico （ GAE）per grammo di materiale secco （ug GAE/g do）.

3.6. Determinazione del contenuto totale di flavonoidi

Il contenuto totale di flavonoidi (TFC) negli estratti di alghe è stato determinato con il metodo descritto da Kamtekar 【93】 e adattato a 96-micropiastre. In breve, un volume di 25 μL di estratto di alghe o una soluzione standard seriale è stato miscelato con 100 μL di nitrito di sodio (0,375% p/o). Dopo 5 minuti, alla miscela sono stati aggiunti 25 μL di cloruro di alluminio (3 percento w/o) e incubati per 6 minuti a temperatura ambiente. Quindi, 100 μL di idrossido di sodio (2% p/ø) sono stati aggiunti alla miscela e miscelati. Immediatamente, l'assorbanza è stata misurata alla lunghezza d'onda di 510 nm. Come semilavorati sono stati usati acqua distillata ed etanolo. Una curva standard di quercetina (disciolta in etanolo) è stata utilizzata per determinare il contenuto fenolico totale ed è stato espresso come ug di equivalenti di quercetina (QE) per grammo di materiale secco (ug QE/g do). 3.7.Determinazione del contenuto di carboidrati

Il tenore di zucchero libero è stato misurato secondo il metodo descritto da [94], con lievi modifiche. A 100 μL di campione o soluzione standard sono stati aggiunti 50 μL di soluzione di fenolo (4 percento) e 250 μL di acido solforico (96 percento). Dopo 10 minuti di incubazione a temperatura ambiente, l'assorbanza della miscela è stata letta a 490 nm. Una curva standard di glucosio è stata utilizzata per determinare il contenuto totale di carboidrati ed è stato espresso come mg di equivalenti di glucosio (GluE) per grammo di sostanza secca (mg GluE/g do).

3.8. Proprietà antiossidanti degli estratti di alghe

3.8.1.2,2 Saggio di scavenging dei radicali liberi difenil{5}}picrylidrazyl (DPPH)

L'attività antiossidante (DPPH) degli estratti di alghe è stata determinata seguendo la metodologia precedentemente descritta 【94】 con alcune modifiche. In breve, 200 μL di soluzione di 10,825 × 10-5 M DPPH sono stati aggiunti a 100 μL di campione (1:1 in metanolo) in una piastra a pozzetti 96-. Lo stesso volume di DPPH è stato miscelato con 50μL di standard più 50μL di metanolo. Quindi i campioni e lo standard sono stati incubati in un luogo buio a temperatura ambiente per 30 minuti. L'assorbanza è stata misurata alla lunghezza d'onda di 517 nm. L'acqua distillata è stata utilizzata come bianco. La capacità di eliminare il radicale DPPH è stata calcolata utilizzando la seguente equazione: dove controllo è l'assorbanza del controllo (soluzione DPH senza campione), il campione A è l'assorbanza del campione in esame (soluzione DPPH più campione in esame) e il campione A il bianco del campione è l'assorbanza del solo campione (campione senza soluzione di DPPH) e il bianco di ametanolo è l'assorbanza del solo metanolo. Gli antiossidanti commerciali (acido ascorbico, acido gallico e -tocoferolo) sono stati usati come controlli positivi.

3.8.2. Saggio del potere antiossidante di riduzione degli ioni ferrici (FRAP).

L'attività del FRAP è stata misurata secondo il metodo di Benzie e Strain [95]. In breve, tampone acetato (300 mM, pH3.6), 2.4, 6- tripyridil-s-triazina (TPTZ) 10 mM in 40 mMHCl e FeCl; 6H-O (20 mM) sono stati miscelati nel rapporto di 10:1 per ottenere il reagente FRAP di lavoro. La miscela di reazione è stata incubata a 37 gradi per 10 minuti. Un campione di A50 μL da ogni estratto è stato miscelato con 150 μL di soluzione FRAP funzionante per 8 minuti a temperatura ambiente. L'assorbanza del prodotto colorato, Ferrous-TPTZ è stata misurata alla lunghezza d'onda di 593 nm. I valori FRAP degli estratti di alghe sono stati espressi come uM di Trolox equivalenti (TE) per grammo di materiale secco.

3.8.3.2,2 Dosaggio Azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-acido solfonico)(ABTS)

L'analisi è stata eseguita utilizzando il protocollo di decolorazione ABTS [76] con alcune modifiche. Un catione radicale ABTS (ABTS plus) è stato prodotto facendo reagire ABTS (66 mg) con 10 ml di soluzione di persolfato di potassio (2,45 mM). La miscela è stata lasciata al buio a temperatura ambiente per 12-16 h prima dell'uso. La soluzione ABTS plus è stata diluita con acqua ad un'assorbanza di 0,700 a 734 nm. La miscela di reazione (200 ul) è stata trasferita su una micropiastra, sono stati aggiunti 50 μL di campione e quindi 150 μL di soluzione di reagente. La piastra è stata agitata per 10 s a velocità media e l'assorbanza è stata misurata a 734 nm dopo 5 minuti di incubazione a temperatura ambiente. È stata preparata una curva standard tracciando l'inibizione di A734nm degli standard Trolox in funzione delle loro concentrazioni. Il valore della capacità antiossidante equivalente di Trolox (TEAC) dei campioni è stato calcolato utilizzando l'equazione ottenuta dalla regressione lineare dei valori A734nm sostituiti dalla curva standard per ciascun campione:

3.9. Attività Antienzimatiche degli Estratti di Alghe

3.9.1. Saggio di inibizione della collagenasi

Un kit di analisi colorimetrica dell'attività della collagenasi (MAK293), acquistato da Sigma-Aldrich, è stato utilizzato per determinare l'inibizione della collagenasi degli estratti di alghe. Il kit ha misurato l'attività della collagenasi utilizzando un peptide sintetico (FALGPA) che imita la struttura del collagene. La procedura è stata eseguita secondo le istruzioni del kit.

3.9.2. Saggio di inibizione dell'elastasi

L'inibizione dell'elastasi degli estratti di alghe è stata studiata in una soluzione tampone TRIS con il metodo modificato come descritto in precedenza 【96】. In breve, 100 μL di soluzione tampone TRIS 0,1 M （pH8.0）, 25 μL di elastasi （1 U/mL in tampone TRIS） e 25 μL di campioni estratti sono stati miscelati e incubati per 15 minuti a 30°C prima di aggiungere il substrato per iniziare la reazione. Dopo il tempo di incubazione, sono stati aggiunti 50μL di soluzione 2 mM AAAPVN. Quindi, l'assorbanza a 420 nm è stata monitorata per 20 minuti utilizzando un lettore di micropiastre a una temperatura costante di 30 C. Infine, l'inibizione dell'elastasi è stata calcolata in percentuale utilizzando l'equazione: dove Abs control è l'assorbanza del test utilizzando il tampone invece di inibitore (campione) e Absmple è l'assorbanza degli estratti del campione. La quercetina è stata utilizzata come controllo positivo. Il buffer Tris è stato utilizzato come vuoto.

3.9.3. Saggio di inibizione della tirosinasi

Il test inibitorio della tirosinasi è stato eseguito secondo il metodo precedentemente descritto da 【66】 utilizzando L-DOPA come substrato. 20 μL del campione, 10 μL di soluzione di tirosinasi di funghi (50 U/mL in tampone fosfato) e 80 μL di tampone fosfato (pH=6.8) sono stati miscelati in una micropiastra e pre-incubati a 37°C per 5 minuti. Quindi sono stati aggiunti 90 ul di L-DOPA (2 mg/mL). La formazione di dopacromo è stata immediatamente monitorata per 20 minuti a 475 nm in un lettore di micropiastre a una temperatura costante di 37 gradi. La percentuale di inibizione dell'enzima tirosinasi è stata calcolata utilizzando l'equazione: dove Abs control è l'assorbanza del test utilizzando il tampone invece dell'inibitore (campione) e A sample è l'assorbanza degli estratti del campione. La quercetina è stata utilizzata come controllo positivo. Il tampone fosfato è stato utilizzato come bianco.

3.9.4. Saggio di inibizione della ialuronidasi

L'attività inibitoria della ialuronidasi è stata misurata come precedentemente descritto da [66] con poche modifiche. Un volume di 100 ulof tipo-1-ialuronidasi dei testicoli bovini（2100 U/mL）disciolto in 0.1 M tampone acetato (pH 3,5) è stato miscelato con 100 μL di estratto e incubato a 37 gradi per 20 min. Un volume di 200 μL di 6 mM di cloruro di calcio è stato aggiunto alla miscela di reazione, quindi la miscela è stata incubata a 37 gradi C per 20 minuti. Questa ialuronidasi attivata con Ca2 più è stata trattata con 250 ul di ialuronato di sodio (1,2 mg/mL) disciolto in tampone acetato 0,1 M (pH 3,5) e quindi incubato a bagnomaria a 37 gradi per 40 minuti. Alla miscela di reazione sono stati aggiunti 50 μL di idrossido di sodio 0,9 M e 100 μL di borato di sodio 0,2 M e quindi incubati in un bagno d'acqua bollente per 5 minuti. Dopo raffreddamento a temperatura ambiente, alla miscela di reazione sono stati aggiunti 250 ul di soluzione di p-dimetilamminobenzaldeide (DAMB). La soluzione DAMB è stata preparata sciogliendo 0,25 g di DAMB in 21,88 ml di acido acetico al 100% e 3,12 ml di acido cloridrico 10N. Il gruppo di controllo è stato trattato con 100 μL del 5% di acqua invece dell'estratto. L'assorbanza è stata misurata alla lunghezza d'onda di 585 nm dopo 45 min. La percentuale di inibizione enzimatica è stata calcolata utilizzando la seguente equazione: dove Abs control è l'assorbanza del test utilizzando il tampone anziché l'inibitore (campione) e Abs sample è l'assorbanza degli estratti del campione. L'acido tannico è usato come standard di riferimento.

3.10.Analisi statistica

La media dell'analisi triplicata di ogni estratto è stata calcolata e utilizzata per trovare i valori medi e le deviazioni standard per ciascun gruppo (n=3). Sono stati applicati modelli lineari generali (GLM) per fattori fissi per valutare i principali effetti e le interazioni bidirezionali dei fattori sperimentali (specie e metodi di estrazione) sulle variabili misurate. Inoltre, sono stati utilizzati ANOVA e il test di Tukey-Kramer per identificare i significativi (p<0.05)differences between="" the="" groups.="" pearson="" correlation="" was="" used="" to="" evaluate="" linear="" relationships="" between="" the="" variables.="" principal="" component="" analysis="" (pca)="" was="" used="" to="" detect="" structure="" in="" the="" relationship="" between="" measured="" variables="" and="" experimental="" factors.="" the="" pca="" reduces="" voluminous="" data="" to="" a="" small="" set="" of="" linear="" combinations="" of="" related="" variables(i.e.,="" factors)="" based="" on="" patterns="" of="" correlation="" among="" the="" original="" variables.="" the="" resulting="" linear="" attribute="" combinations="" can="" be="" used="" for="" profiling="" specific="" product="" characteristics="" based="" on="" the="" variables="" studied.="" all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" ncss="" 2020="" statistical="" software="" (2020)="" (ncss,="" llc.,="" kaysville,="" ut,="">

4. Conclusioni

I risultati di questo primo esperimento di screening hanno mostrato il potenziale di tre specie di alghe islandesi fornendo effetti benefici efficaci attraverso diversi percorsi. L'approccio ecologico sviluppato utilizzando campi elettrici pulsati acquosi ha mostrato risultati simili all'estrazione tradizionale dell'acqua calda, mostrando numerosi vantaggi come la sua natura non termica e il tempo di estrazione più breve (10 min contro 45 min). Tra le tre specie di alghe, la macroalga bruna A.esculenta ha mostrato il più alto contenuto di TPC e TFC esibendo anche le maggiori capacità antiossidanti Inoltre, gli estratti d'acqua di A.esculenta hanno mostrato migliori attività inibitorie rispetto a P. palmaria e U. Lactuca nei confronti di collagenasi, elastasi, tirosinasi e ialuronidasi sono le specie di alghe più promettenti con eccellenti attività antienzimatiche per il loro uso nello sbiancamento della pelle, antietà e salute della pelle. È interessante notare che gli estratti di A.esculenta prodotti con il metodo PEF hanno mostrato un'inibizione della collagenasi del 91%, superiore all'attività di inibizione mostrata dall'estrazione tradizionale con acqua calda e persino superiore all'inibitore fornito dal kit commerciale. In conclusione, il nostro studio preliminare suggerisce che gli estratti a base di alghe islandesi, in particolare gli estratti della macroalga bruna A. esculenta, prodotti dall'estrazione assistita da campi elettrici pulsati acquosi sono potenziali ingredienti funzionali che potrebbero essere utilizzati come composti attivi per formulazioni cosmetiche e cosmeceutiche nel futuro prossimo.

Questo articolo è tratto da Mar. Drugs 2021, 19, 662. https://doi.org/10.3390/md19120662 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs