Esplorando il ruolo di un nuovo omologo dell'interleuchina-17 del mitilo marino invertebrato Mytilus Coruscus nella risposta immunitaria innata: la chiave è la regolazione negativa di Mc-Novel_miR_145?

Astratto: L'interleuchina-17 (IL-17) rappresenta una classe di citochine proinfiammatorie coinvolte nei disturbi infiammatori cronici e degenerativi. Prima di questo studio, era stato previsto che un omologo IL-17 potesse essere preso di mira da Mc-novel_miR_145 per partecipare alla risposta immunitaria di Mytilus coruscus. Questo studio ha utilizzato una varietà di metodi di ricerca di biologia molecolare e cellulare per esplorare l'associazione tra Mc-novel_miR_145 e l'omologo IL-17 e i loro effetti immunomodulatori. La previsione bioinformatica ha confermato l'affiliazione dell'omologo IL-17 con la famiglia delle IL-17 dei mitili, seguita da test PCR quantitativi in ​​tempo reale (qPCR) per dimostrare che McIL-17-3 era altamente espresso in tessuti immuno-associati e hanno risposto alle sfide batteriche. I risultati dei test reporter della luciferasi hanno confermato il potenziale di McIL-17-3 di attivare NF-kb a valle e il suo targeting da parte di Mc-novel_miR_145 nelle cellule HEK293. Lo studio ha prodotto anche l'antisiero McIL-17-3 e ha scoperto che Mc-novel_miR_145 regola negativamente il McIL-17-3 tramite western blotting e test qPCR. Inoltre, l'analisi della citometria a flusso ha indicato che Mc-novel_miR_145 regolava negativamente McIL-17-3 per alleviare l'apoptosi indotta da LPS. Nel complesso, i risultati attuali hanno mostrato che McIL-17-3 ha svolto un ruolo importante nella difesa immunitaria dei molluschi contro gli attacchi batterici. Inoltre, McIL- 17-3 è stato regolato negativamente da Mc-novel_miR_145 per partecipare all'apoptosi indotta da LPS. I nostri risultati forniscono nuove informazioni sulla regolazione dell’RNA non codificante nei modelli di invertebrati.

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Parole chiave: Mytilus couscous; interleuchina-17; microRNA; apoptosi; immunità innata

1. Introduzione

Il sistema immunitario svolge un ruolo cruciale nella difesa dell'organismo contro l'invasione di agenti patogeni esogeni. Convenzionalmente il sistema di difesa si divide in immunità innata e immunità acquisita. L'immunità innata rappresenta la prima linea di difesa del corpo contro gli agenti patogeni, che può rilevare l'invasione degli agenti patogeni ed eliminarli parzialmente [1]. L’immunità innata è mediata da una grande varietà di cellule, tra cui le cellule natural killer, i monociti, i neutrofili, gli eosinofili, i basofili e le cellule dendritiche circolanti, che sono collettivamente note come cellule immunitarie innate. Queste cellule rilasciano un gran numero di citochine coinvolte nella comunicazione cellulare e quindi aiutano a coordinare le risposte immunitarie [2]. In caso di infezione e infiammazione, le citochine funzionano come modulatori: alcune citochine peggiorano la malattia (proinfiammatorie), mentre altre promuovono la salute (antinfiammatorie) [3]. Le citochine sono soggette ad alti livelli di pressione evolutiva e quindi mostrano una diversificazione delle sequenze [4], mentre la famiglia delle citochine IL-17 mostra un'elevata conservazione, che si manifesta con una piega a nodo di cisteina nell'architettura funzionale formata attraverso le interazioni tra quattro residui conservati di cisteina [5]. Studi recenti hanno dimostrato che l'IL-17 è una classe di citochine proinfiammatorie coinvolte nei disturbi infiammatori cronici e degenerativi [6]. La funzione delle IL-17 si lega specificamente ai recettori per promuovere lo sviluppo dell'infiammazione, il rigetto immunitario e l'ematopoiesi. La famiglia di citochine IL-17 nell'uomo è composta da sei membri (da IL-17A a IL-17F), prodotti dai linfociti T attivati ​​e da altre popolazioni cellulari innate in risposta all'IL -1 e IL-23 [7,8]. Tuttavia, un numero crescente di prove suggerisce che la famiglia IL-17 abbia sperimentato una marcata espansione nei molluschi marini e nelle specie di echinodermi. Nel genoma del riccio di mare viola Strongylocentrotus purpuratus sono stati rilevati circa 30 geni IL-17 [9]. Allo stesso modo, 31 geni simili a IL-17- del polpo sono stati trovati nei cefalopodi coleoidi, in cui 27 geni hanno una potente espressione nelle ventose e nella pelle [10]. Saco et al. [11] hanno recuperato 379 sequenze IL-17 uniche da 15 genomi di cozze risequenziati e dal genoma di riferimento di M. galloprovincialis [12] e le hanno divise in 23 isoforme attraverso l'analisi filogenetica. Inoltre, hanno scoperto che le isoforme di IL-17 delle specie Mytilidae erano conservate tra gli individui e condivise tra specie strettamente imparentate. Oltre alle specie Mytilidae, le grandi famiglie IL-17 sono state trovate anche in altre specie di molluschi, tra cui Crassostrea gigas, Mizuhopecten yessoensis e Pinctada fucata martensii [13]. L'acqua di mare pullula di agenti patogeni e i molluschi marini sono in costante contatto con loro, quindi è necessario un potente arsenale di molecole immunitarie, dopodiché l'espansione della famiglia IL-17 dota questi animali di risposte immunitarie più efficaci.

Sono stati condotti diversi studi che indicano il ruolo significativo svolto dalle IL-17 nell'immunità innata dei molluschi. Ad esempio, la ricerca ha scoperto che in seguito all'infezione da Vibrio harveyi, il livello di mRNA di IL-17D era notevolmente sovraregolato in Tegillarca granulosa [14], mentre in C. gigas, CgIL17-5 ha mostrato un reazione distinta al Vibrio Gorgeousus [15]. Inoltre, è stato dimostrato che le IL-17 dei molluschi rispondono a molti modelli molecolari associati ai patogeni (PAMP), come il lipopolisaccaride (LPS), l'acido poliinosinico: policitidilico (poliI: C) e il peptidoglicano (PGN). L'LPS è un componente importante della parete esterna delle pareti cellulari batteriche Gram-negative e rappresenta uno degli stimolanti immunitari più comunemente utilizzati. D'altra parte, polyI: C è un analogo dell'RNA a doppio filamento che viene spesso utilizzato come simulatore di virus nella ricerca scientifica. Dopo la stimolazione con LPS, l'espressione trascrizionale dei geni della famiglia IL-17 è stata rapidamente attivata nell'ostrica del Pacifico C. gigas e nell'ostrica perlifera P. fucata [16,17]. Anche nelle ostriche perlifere, è stato scoperto che PfIL-17 è coinvolta nella risposta immunitaria alla stimolazione poliI:C [17].

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Inoltre, un test a doppia luciferasi ha mostrato che PfIL-17 era in grado di attivare i geni bersaglio dei vertebrati contenenti siti di legame di NF-kB e di partecipare alla via di segnalazione di NF-kB nelle cellule HEK293 [17]. Il PGN è presente nella parete cellulare dei batteri Gram-positivi ed è spesso utilizzato come imitazione dei batteri Gram-positivi. È stato dimostrato che la IL17-5 ricombinante di C. gigas ha una forte affinità con PGN, che non era mai stata segnalata nelle interleuchine dei vertebrati [18]. Questi studi hanno fornito il preludio alla rivelazione della funzione immunomodulante dell'IL-17 nei molluschi. Essendo una classe di citochine proinfiammatorie, l'eccessiva espressione di IL-17 può indurre gravi danni alle cellule. Gli organismi hanno sviluppato vari meccanismi per controllare la reazione eccessiva di IL-17, di cui i microRNA (miRNA) rappresentano la classe più potente e ben studiata di RNA non codificanti. I miRNA sono una famiglia di RNA corti lunghi circa 22 nt che possono regolare l’espressione dei geni bersaglio mediante repressione traslazionale o degradazione dell’mRNA [19]. L'attuale ricerca sulla regolazione delle IL-17 da parte dei miRNA si concentra principalmente sui loro effetti sinergici nelle malattie autoimmuni umane come la sclerosi multipla, l'artrite reumatoide, la psoriasi e altre [20]. Lo sviluppo della tecnica di sequenziamento ad alto rendimento e di calcolo biologico rende possibile la scansione dei miRNA dei molluschi a livello genomico e un gran numero di miRNA conservati e nuovi sono stati identificati da specie di molluschi come l'ostrica piatta Ostrea edulis, l'ostrica del Pacifico C. gigas , Lymnaea stagnalis, cozza M. galloprovincialis, ecc. [21–29]. Questi studi forniscono dati di base e un grande supporto per l’interpretazione funzionale dei miRNA nei molluschi. Per quanto riguarda il ruolo immunoregolatore di alcuni miRNA nei molluschi, Tian, ​​et al. [30] hanno scoperto che Pm-miR-29a potrebbe regolare positivamente IL-17 in Pinctada martensii; dopo la sovraespressione di Pm-miR-29a, l'espressione di IL-17 nel mantello e nelle branchie della specie era sovraregolata. In C. gigas, cgi-miR-2d ha aumentato la fagocitosi degli emociti delle ostriche regolando negativamente CgIκB2 [31] e regolando negativamente l'espressione di un gene simile al trasportatore della colina nella fase iniziale dell'infezione, che era coinvolto in una sofisticata immunomodulazione [32].

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Durante l'essiccazione, si è scoperto che cgi-miR-365 era indotto dalla norepinefrina e promuoveva direttamente l'espressione di CgHSP90AA1 [33]. Studi recenti hanno dimostrato che l'impalcatura di miRNA659_26519 prende di mira la calmodulina per regolare l'espressione di IL-17 nella fase iniziale della risposta immunitaria di C. gigas [34]. Inoltre, funzioni specifiche di alcuni miRNA sono state descritte in altri invertebrati, come il cetriolo di mare Apostichopus japonicus [35–39] e il gambero Litopenaeus vannamei [40]. Questi studi hanno aperto il velo sui meccanismi alla base dei miRNA negli invertebrati e hanno anche fornito riferimenti tecnici e metodologici per la nostra ricerca attuale. Nel nostro studio precedente, 26 miRNA e 667 geni di M. coruscus sono stati calcolati biologicamente per l'espressione differenziale dopo la sfida con Vibrio alginolyticus, di cui Mcnovel_miR_145 può bersagliare un omologo di IL-17 ed essere coinvolti nella risposta immunitaria alle infezioni batteriche [41]. L'obiettivo del presente studio è identificare il gene IL-17 e indagare il suo potenziale ruolo nell'immunità innata e la sua regolazione da parte del miRNA Mcnovel_miR_145 nel M. coruscus. Attraverso questo studio, miriamo a comprendere meglio i meccanismi di risposta immunitaria dei molluschi e a far luce sulle basi molecolari della loro difesa immunitaria contro i patogeni. Questa ricerca può anche fornire approfondimenti sulla regolazione dell'RNA non codificante nei modelli di invertebrati.

2. Risultati

2.1. Caratterizzazione di McIL-17-3

La sequenza di cDNA McIL-17-3 contenente l'ORF completo, 30 -UTR e l'UTR parziale 50 - è stata clonata in silico dal trascrittoma a lunghezza intera di M. coruscus (numero di accesso: PRJNA798880, F{ {5}}trascrizione_12404). McIL-17-3 contiene una regione ORF di 585 bp che codifica 194 aminoacidi. Il peso molecolare previsto è 21,77 kDa e il punto isoelettrico è 5,21. L'analisi SMART ha rivelato un tipico dominio IL-17 in questa proteina (Figura 1A). È stato costruito un albero filogenetico reclutando membri IL-17 di specie di vertebrati e Mytilidae e le IL2 sono state utilizzate come gruppo esterno. Come mostrato nella Figura 1B, questi IL-17 sono raccolti in un ramo specifico per distinguerli dagli IL-2. All'interno del cluster IL-17, sono stati mostrati due cladi apparenti, uno composto da IL-17 di vertebrati e l'altro composto da IL-17 di mitili. Nel gruppo IL-17 delle cozze, McIL-17-3 si è prima raggruppato con la molecola corrispondente di un'altra specie di Mytilus, M. galloprovincialis (Figura 1B).

2.2. Previsione di allineamenti multipli e strutture terziarie

Il nucleo del McIL-17-3 è composto da due coppie di filamenti antiparalleli; una coppia include i filamenti 1 (residui 52–58) e 2 (residui 66–72 e 77–79), mentre l'altra include i filamenti 3 (residui 89–103) e 4 (residui 110–125) (Figura 2B, C) . Due ponti disolfuro (Cys97/Cys134 e Cys125/Cys169) collegano i filamenti 1 e 3, 2 e 4, rispettivamente (Figura 2A, C). Coerentemente, anche altri IL-17 dei molluschi possiedono questi due ponti disolfuro tra i filamenti 1 e 3, 2 e 4 (Figura 2A, C). In particolare, sebbene gli IL-17 dei vertebrati abbiano anche due ponti disolfuro, ne esistono tra 2 e 4 (Figura 2A, C).

2.3. Espressione trascrizionale di McIL-17-3

Il profilo della distribuzione tissutale delle trascrizioni McIL{{0}} è stato valutato mediante qPCR. Le trascrizioni di McIL-17-3 sono state espresse in tutti i tessuti testati e i livelli di espressione negli emociti e nelle branchie erano significativamente più alti di quelli nel muscolo adduttore (Figura 3A). È stata valutata anche l'espressione temporale delle trascrizioni McIL-17-3 degli emociti in risposta alla sfida con V. alginolyticus. Il livello di mRNA di McIL-17-3 era significativamente sovraregolato a 3 e 12 HPC (aumento di 3,13- o 4,35-volte rispetto a 0 HPC, rispettivamente), ma non c'era evidente regolarità temporale in generale (Figura 3B).

Figura 1. Caratterizzazione molecolare di McIL-17-3. (A) Analisi dell'architettura dei domini conservati in McIL-17-3 utilizzando SMART. È stato mostrato un dominio IL-17 conservato. (B) Analisi filogenetica di McIL-17-3. L'albero filogenetico è stato costruito utilizzando il software MEGAX con 2000 repliche di bootstrap utilizzando il metodo di unione dei vicini. McIL-17-3 è stato etichettato con un triangolo verde. Le specie incluse nell'albero filogenetico sono state tutte recuperate dal database Genebank e nell'albero sono stati elencati anche i numeri di accesso. Triangolo verde per conto di McIL-17-3. (Per l'interpretazione dei riferimenti al colore nella legenda di questa figura, si rimanda il lettore alla versione Web di questo articolo.)

2.4. L'attivazione del downstream da parte di McIL-17-3

Come mostrato nella Figura 4, la McIL-17-3 ricombinante ha aumentato l'attività luciferasica di pGLNF-κB-luc in modo dose-dipendente. A 0,5 e 1,0 µg/pozzetto, l'attività luciferasica di pGLNF-κB-luc è aumentata rispettivamente di 2,07- e 11,07-volte.

2.5. Conferma di McIL-17-3 come gene bersaglio di Mc-novel_miR_145

Attraverso la previsione bioinformatica, il gene McIL{{0}} contiene una sequenza bersaglio standard per Mc-novel_miR_145 al suo 30 UTR (Figura 5A). Il mimico e l'inibitore del Mc-novel_miR_145 sono stati co-trasfettati con il plasmide reporter McIL-17-3-30 UTR wild-type nelle cellule HEK293 per confermare la loro correlazione. Come mostrato nella Figura 5B, il mimico Mc-novel_miR_145 può inibire l'attività luciferasica di McIL-17-3-30 UTR-WT (0.{{2{{58} }}}volte rispetto al controllo), mentre l'inibitore Mc-novel_miR_145 allevia notevolmente gli effetti (aumento di 1,64-volte rispetto a Mc-novel_ miR_145 imita come un gruppo semplicemente aggiunto). Per valutare se Mc-novel{{30}}miR_145 prende di mira direttamente il gene McIL-17-3 attraverso il sito target nel 30 UTR, abbiamo costruito la versione mutante dei plasmidi reporter della luciferasi che ha modificato le sequenze di targeting di Mc-novel_miR_145 nell'UTR di McIL-17-3 30. Come mostrato nella Figura 5C, la mimica Mc-novel_miR_145 ha ridotto significativamente l'attività luciferasica delle cellule trasfettate con McIL-17-3-30 UTR-WT (0,27-volte diminuzione), mentre non è stato osservato alcun cambiamento nell'attività della luciferasi nelle cellule trasfettate con McIL-17-3-30 UTR-MUT. Inoltre, gli effetti dose-dipendenti del nuovo Mc-{50}}miR_145 imitano l'inibizione dell'attività della luciferasi McIL-17-3-30 UTR-WT potrebbero essere osservati anche 24 ore dopo la trasfezione (0 .71-, 0.43- e 0.20-volte diminuiscono rispetto al controllo, rispettivamente, Figura 5D).

Figura 2. Allineamenti multipli di McIL-17-3 con altri membri della famiglia IL-17. (A) La sequenza aminoacidica di McIL-17-3 era allineata con quella di altri IL-17 recuperati da cozze e vertebrati, inclusi topi e pesci zebra. Queste cisteine, che formano un nodo canonico, erano contrassegnate in verde, con i residui di amminoacidi sostituiti contrassegnati in rosso. Il nodo della cisteina è indicato da linee colorate, il blu indica la loro presenza nei molluschi e il rosso indica la loro presenza nei vertebrati. Nota: solo la seconda metà dell'allineamento della sequenza viene conservata per la visualizzazione. (B) La struttura terziaria della proteina McIL-17-3 è stata prevista utilizzando il modello svizzero e il software pyMol. Queste cisteine, che formano un nodo canonico, sono state marcate. (C) Una rappresentazione a fumetti della piega canonica del nodo della cisteina. I residui di cisteina erano indicati da cerchi pieni; quelli presenti nelle proteine ​​IL-17 erano gialli, mentre i due mancati erano grigi. (Per l'interpretazione dei riferimenti al colore nella legenda di questa figura, si rimanda il lettore alla versione Web di questo articolo.)

Figura 3. Analisi del profilo di espressione delle trascrizioni McIL-17-3. (A) Distribuzione delle trascrizioni McIL-17-3 nei tessuti delle cozze comuni. (B) Cambiamenti dell'espressione temporale delle trascrizioni McIL-17-3 in risposta alla sfida di V. alginolyticus. I risultati sono stati espressi come media ± DS (n=3, * p < 0.05, ** p < 0,01). (Per l'interpretazione dei riferimenti al colore nella legenda di questa figura, si rimanda il lettore alla versione Web di questo articolo.)

Figura 4. L'attivazione del reporter NF-κB da parte di McIL-17-3. Il vettore ricombinante pEGFP-McIL- 17-3 in tre concentrazioni (0.1, 0.5 e 1.{{10}} µg/pozzetto) è stato cotrasfettato nelle cellule HEK293 utilizzando Lipo6000TM per 24 ore. Le relative attività luciferasiche sono state calcolate normalizzando al valore pRLTK. I risultati sperimentali sono stati espressi come cambiamenti di piega confrontando le attività luciferasiche delle cellule indotte da vettori ricombinanti con quelle delle cellule indotte da vettori vuoti alla stessa concentrazione. Ciascun valore è stato mostrato come media ± DS (n=3) e le barre con un asterisco erano significativamente diverse (* p < 0,05, ** p < 0,01).

Figura 5. Mc-novel_miR_145 ha preso di mira McIL-17-3. (A) La sequenza McIL-17-3 30 UTR è stata inserita nel vettore pmiR-RB-Report™, rispettivamente plasmidi wild-type e mutanti costruiti. La sequenza Mcnovel_miR{{10}}, il sito target McIL-17-3-30 UTR e la sequenza del sito mutante sono stati etichettati con marcatori rossi. (B) Il plasmide McIL-17-3-30 UTR-WT è stato co-trasfettato con Mc-novel_miR_145 mimic o Mc-novel_miR{{2{{37} }}} inibitore nelle cellule HEK293. (C) Le cellule HEK293 sono state trasfettate con McIL-17-3-30 UTR-WT o il tipo mutante di McIL-17-3-30 UTR-MUT, insieme a Mc-novel_miR_145 o NC , per 24 ore. L'attività della luciferasi è stata misurata utilizzando il sistema di analisi reporter a doppia luciferasi. (D) Gli esperimenti sul gradiente di concentrazione sono stati condotti per la trasfezione Mc-novel_miR_145. Tutti i dati sono presentati come media ± DS di almeno tre esperimenti triplicati indipendenti. **, p < 0,01, *, p < 0,05 rispetto ai controlli. (Per l'interpretazione dei riferimenti al colore nella legenda di questa figura, si rimanda il lettore alla versione Web di questo articolo.)

2.6. Mc-novel_miR_145 regola negativamente l'espressione di McIL-17-3

Gli emociti di M. coruscus sono stati trasfettati con Mc-novel_miR_145 mimic, Mcnovel_miR_145 inibitore e i rispettivi controlli, e i cambiamenti in McIL{{ 5}} espressione sono state valutate a livello trascrizionale e proteico. Come mostrato nella Figura 6A, l'espressione di Mc-novel_miR_145 era significativamente sovraregolata (aumento di 8,83-volte) dalla sua imitazione e sottoregolata ({{14 }}.41-volte diminuito) dal suo repressore negli emociti, suggerendo effetti efficaci di questi composti sintetici. Nella Figura 6B, l'espressione di McIL-17-3 endogeno è stata significativamente inibita (diminuzione di 0.51-volte) dall'imitazione di Mc-novel_miR_145 al livello livello trascrizionale e significativamente indotto (aumento di 2,42-volte) dall'inibitore di Mcnovel_miR_145. Per studiare gli effetti di Mc-novel_miR_145 sull'espressione di McIL-17-3 a livello proteico, è stato prodotto un anticorpo policlonale contro McIL-17-3. Come mostrato nelle corsie 2 e 3 nella Figura 6C, la proteina ricombinante McIL-17-3 è stata espressa con successo in E. coli. La specificità dell'anticorpo è stata esaminata con la proteina di cozza dagli emociti mediante Western blot. È stata osservata una singola banda di circa 22 kDa, corrispondente alla massa molecolare di McIL-17-3 (corsia 4 nella Figura 6C). I risultati del Western blot nella Figura 6D hanno mostrato la regolazione negativa di McIL-17-3 a livello proteico mediante Mc-novel_miR_145.

Ffigura 6. Mc-novel_miR_145 ha inibito l'espressione di McIL-17-3 negli emociti di M. coruscus. (A) L'espressione di Mc-novel_miR_145 è stata valutata mediante qPCR in emociti trasfettati con 145 mimici, 145 inibitori e il rispettivo controllo. (B) Dopo la trasfezione per 24 ore, i livelli trascrizionali di McIL-17-3 sono stati determinati mediante qPCR. (C) Espressione ricombinante, purificazione e preparazione dell'antisiero per McIL-17-3. Corsia M, marcatore del peso molecolare delle proteine ​​standard. Corsia 1, controllo negativo (senza induzione). Corsia 2, proteina ricombinante indotta McIL-17-3. Corsia 3, McIL purificato- 17-3. Corsia 4, Western blot con anticorpo anti-McIL{{20}} negli emociti di M. coruscus. (D) Dopo la trasfezione per 24 ore, i livelli proteici di McIL-17-3 sono stati determinati mediante Western blot. ** p < 0,01 rispetto ai controlli

2.7. Apoptosi degli emociti

Il tasso di apoptosi degli emociti di quattro gruppi, ovvero NC+LPS, McIL-17-3+LPS, Mcnovel_miR_145+McIL-17-3+LPS e Mc-novel{{6} }miR_145-i+McIL-17-3+LPS è stato analizzato mediante citometria a flusso utilizzando la doppia colorazione. Dopo che McIL-17-3 è stato sovraespresso, il tasso di apoptosi degli emociti sottoposti a LPS è stato significativamente aumentato rispetto al gruppo di controllo (Figura 7A(a,b), B). Quando McIL-17-3 è stato cotrasfettato con Mc-novel_miR_145, il tasso di apoptosi degli emociti indotto da LPS è diminuito significativamente rispetto a quello di McIL-17-3 trasfettato da solo (Figura 7A( b, c), B). Al contrario, il tasso di apoptosi degli emociti ha mostrato un notevole aumento nel gruppo Mc-novel_miR_145-i+ McIL-17-3+LPS rispetto al gruppo McIL-17-3+LPS (Figura 7A (b,d), B).

Figura 7. Il tasso di apoptosi degli emociti è stato valutato mediante citometria a flusso utilizzando ioduro di propidio (PI) e colorazione FITC-Annessina-V

3. Discussione

IL-17 è riconosciuta come una delle importanti famiglie di citochine proinfiammatorie, che possono partecipare efficacemente alla patogenesi di diverse malattie [42]. Nel nostro studio precedente, un omologo IL-17 di M. coruscus ha mostrato un'espressione differenziale prima e dopo l'infezione da V. alginolyticus attraverso il sequenziamento del trascrittoma [41], suggerendo il suo potenziale ruolo nella risposta immunitaria innata alla sfida batterica. Qui, abbiamo caratterizzato questo omologo IL-17 e lo abbiamo chiamato McIL-17-3. La previsione del dominio funzionale ha rivelato un tipico dominio IL-17, conferendo al gene attualmente identificato l'affiliazione alla famiglia delle citochine IL-17. Nell'albero filogenetico, questo nuovo gene IL-17 ha mostrato una parentela molto stretta con IL-17- 3 di un'altra specie di Mytilus, M. galloprovincialis. Inoltre, condividevano un'identità aminoacidica molto elevata pari al 95% e pertanto abbiamo nominato l'attuale nuovo gene IL-17 come McIL-17-3 per seguire la convenzione di denominazione utilizzata nelle specie Mytilus. La famiglia IL-17 è composta da sei membri e cinque recettori negli esseri umani [43], ma ha sperimentato un'enorme espansione genetica negli invertebrati marini, in particolare nei mitili [11]. Sulla base di ciò, i nostri dati hanno suggerito che McIL-17-3 non era direttamente correlato a determinati geni della famiglia umana IL-17. La piega a nodo di cisteina situata a -sheets è la caratteristica tipica della famiglia IL-17 [5]. Prevedibilmente, la previsione della struttura terziaria ha rivelato una piega del nodo della cisteina nella proteina McIL-17-3, approfondendo ulteriormente l'attribuzione di McIL-17-3 alla famiglia delle citochine IL-17. Per esplorare ulteriormente la differenziazione delle sequenze aminoacidiche IL-17 tra le diverse specie, alcune tipiche IL-17 delle cozze e Mus musculus IL-17-A a IL-17-F e Danio rerio Da IL-17-1 a IL-17-3 sono stati selezionati per eseguire l'analisi degli allineamenti multipli. I risultati hanno mostrato una scoperta interessante secondo cui la posizione del collegamento disolfuro degli IL-17 nei mitili e nei vertebrati era incoerente: questi due collegamenti disolfuro esistevano tra i filamenti 1 e 3, 2 e 4, rispettivamente, nei mitili, ma solo tra -filamenti 2 e 4 nei vertebrati. Nel primo e nel quarto sito della cisteina, le IL-17 dei vertebrati sostituiscono la cisteina con la serina; al contrario, nel secondo sito della cisteina, le IL-17 dei mitili sostituiscono la cisteina con la treoninineziazione nel collegamento disolfuro nei mitili e nei vertebrati, e il suo meccanismo sottostante non è chiaro e necessita di ulteriori studi. Dato il polimorfismo delle IL-17 nei mitili, il legame disolfuro tra i filamenti 1 e 3 potrebbe non essere così forte come quello tra 2 e 4, conferendo loro una maggiore plasticità nei mitili. In ogni caso, l'analisi dei domini funzionali e della struttura terziaria suggerisce che la McIL-17-3 attualmente identificata è tipica della citochina IL-17 dei mitili e potrebbe svolgere un ruolo funzionale simile alle sue controparti nei molluschi. L'espressione dei geni IL-17 nei tessuti umani varia ampiamente, con alcuni espressi solo in poche cellule e altri in un gran numero di tessuti [44,45]. La maggior parte degli studi sui molluschi hanno dimostrato che gli IL-17 avevano un profilo di espressione costitutivo [13,15,17,46,47]. Tuttavia, Li, Zhang, Zhang, Xiang, Tong, Qu e Yu [47] hanno mostrato risultati incoerenti negli IL-17 di C. gigas: CgIL-17-2, -3, {{ 65}} e -6 erano altamente espressi nelle branchie, nelle ghiandole digestive e nel mantello di C. gigas, ma difficilmente espressi in altri tessuti. Qui, le trascrizioni di McIL-17-3 sono state trovate in tutti i tessuti esaminati, suggerendo i suoi molteplici ruoli funzionali in una varietà di attività fisiologiche. Tuttavia, gli alti livelli di espressione di McIL-17-3 in alcuni tessuti immuno-correlati dei molluschi, come emociti, branchie e ghiandole digestive, suggeriscono un suo più stretto coinvolgimento con la risposta immunitaria. Successivamente, la sua rapida risposta all’attacco di V. alginolyticus approfondisce questo punto. L'iniezione di V. alginolyticus ha significativamente sovraregolato l'espressione di McIL-17-3 e risultati simili sono stati osservati anche in altri IL-17 di molluschi. L'iniezione di V. anguillarum in C. gigas ha indotto un rapido aumento dell'abbondanza del trascritto CgIL-17 negli emociti, suggerendo che si trattasse di un gene immunitario della fase iniziale [46]. Quando C. gigas subì un attacco da parte di un altro patogeno, V. splendidius, anche il livello di mRNA di CgIL-17-5 negli emociti era significativamente elevato [15]. La stimolazione dell'LPS, il principale componente patogeno dei batteri, ha aumentato notevolmente l'espressione di PfIL-17 nelle ghiandole digestive dell'ostrica perlifera P. fucata [17]. Inoltre, LPS potrebbe indurre l'espressione di CgIL-17-3 in C. gigas [47] e PmIL-17-2 in P. fucata martensii [13]. Questi risultati hanno indicato collettivamente che IL-17 ha svolto un ruolo importante nella difesa immunitaria dei molluschi contro l'attacco batterico. In questo studio, McIL-17-3 ha mostrato la capacità di attivazione del percorso a valle di NF-κB. Risultati simili sono stati osservati anche in alcune specie di molluschi. Nell'ostrica perlifera P. fucata, PfIL-17 ha anche mostrato l'attivazione della via NF-κB nelle cellule HEK293 mediante test reporter della luciferasi [17]. In C. gigas, CgIL-17-5 ha promosso l'attivazione di CgMAPK e la traslocazione nucleare di CgRel e CgAP-1 per promuovere l'espressione dell'mRNA di citochine e peptidi antibatterici [15]. È stato dimostrato che la modalità d'azione dell'IL-17 si basa sulla sua unione in dimeri (omodimeri o eterodimeri), la cui attività dipende fortemente dal loro attaccamento ai recettori (IL-17R) che essi bersaglio. Questi recettori contengono un dominio citoplasmatico conservato (SEFIR) che interagisce con le proteine ​​adattatrici per avviare percorsi di trasduzione del segnale a valle per attivare fattori di trascrizione come NF-κB e promuovere l’espressione di geni bersaglio immunitari e proinfiammatori, come citochine e peptidi antimicrobici. 11,48,49].

Cistanche tubulosa: migliora il sistema immunitario

Questi risultati suggeriscono che gli IL-17 dei molluschi potrebbero avere la stessa modalità di azione delle loro controparti nei vertebrati. Ciò deve essere confermato in studi futuri. Le correlazioni tra miRNA e IL-17 sono state trovate in diversi modelli di malattie umane. Niimoto, et al. [50] hanno confermato la correlazione positiva tra l'espressione di miR-146a e di IL-17a nelle cellule mononucleari del sangue periferico e nella sinovia di pazienti affetti da artrite reumatoide e hanno riassunto la funzione vitale di miR-146a nell'espressione differenziazione delle cellule produttrici di IL-17-. Nei pazienti affetti da psoriasi, il miR-146a agisce come un potente inibitore dell'infiammazione cutanea guidata da IL-17- e i suoi bassi livelli possono contribuire all'insorgenza precoce della malattia in individui geneticamente predisposti [51]. MiR-146a può migliorare la parodontite riducendo l'espressione di IL-17 e inibendo la proliferazione delle cellule staminali del legamento parodontale umano [52]. MiR-155 regola negativamente l'espressione di IL-17 per partecipare alla risposta immunitaria dell'ospite alla polmonite batterica postvirale nel polmone dei topi; I topi inibiti da miR-155 mostrano un'espressione più forte di IL-17 nel polmone, accompagnata da una migliore clearance batterica [53]. Questi studi suggeriscono che l'IL-17 è regolata da più miRNA e varia a seconda della malattia e del tipo cellulare [20]. In uno studio precedente, abbiamo eseguito un'analisi integrata del miRNAoma e del trascrittoma per esplorare la regolazione interattiva del miRNA-mRNA da parte di M. coruscus in risposta all'infezione da V. alginolyticus. I risultati prevedevano che Mc-novel_miR_145 potesse prendere di mira McIL-17-3 per partecipare alla risposta immunitaria innata alle infezioni batteriche [41]. Con l'obiettivo di esplorare in profondità il meccanismo alla base della regolazione Mcnovel_miR_145 di McIL-17-3, nei presenti studi sono stati condotti una serie di esperimenti di laboratorio. Il calcolo prevedeva che Mc-novel_miR_145 potesse raggiungere i 30 UTR di McIL-17-3. I seguenti test reporter della luciferasi eseguiti in cellule HEK293 co-trasfettate da Mc-novel_miR_145 mimano, mimano NC, inibitore, inibitore NC con McIL-17-3-30 reporter UTR-WT, -MUT i plasmidi hanno ulteriormente confermato questo punto. Inoltre, Mc-novel_miR_145 mimic, mimic NC, inibitore e inibitore NC sono stati trasfettati in emociti di M. coruscus per valutare i loro effetti sull'espressione di McIL-17-3 a livello trascrizionale e proteico . L'espressione di McIL-17-3 era significativamente sottoregolata nel gruppo di trasfezione mimica Mc-novel_miR_145, mentre era significativamente sovraregolata nel gruppo di trasfezione mimica Mc-novel_miR _145 gruppo di trasfezione di inibitori, suggerendo una regolazione negativa di McIL-17-3 da parte di Mc-novel_miR_145. I risultati attuali erano contrari a uno studio precedente. In Pinctada martensii, Tian, ​​Zheng, Huang, Jiao e Du [30] hanno scoperto che sebbene Pm-miR-29a potesse colpire IL-17, la regolazione era positiva, poiché l'espressione di IL{{ 65}} nel mantello e nelle branchie di Pinctada martensii risultava sovraespresso in seguito alla sovraespressione di Pm-miR-29a. Dato che P. martensii e M. coruscus appartengono entrambi a bivalvi e sono relativamente strettamente correlati, questi risultati incoerenti suggeriscono che la regolazione delle IL-17 nei molluschi può variare con i miRNA. Oltre a questo, nessuna letteratura ha riportato la correlazione tra miRNA e IL-17 nei molluschi, e quindi non ci sono più studi paralleli per confrontare i risultati attuali. Tuttavia, alcuni studi hanno riportato relazioni mirate tra miRNA specifici e geni specifici correlati al sistema immunitario nei molluschi.

Ad esempio, cgi-miR-2d aumenta la fagocitosi degli emociti delle ostriche regolando negativamente CgIκB2 in Crassostrea gigas [31]. Inoltre, cgi-miR-2d regola negativamente anche l'espressione di un gene simile al trasportatore della colina per partecipare alla sofisticata immunomodulazione degli emociti dell'ostrica durante la fase iniziale dell'infezione [32]. Questi studi suggeriscono almeno che i miRNA svolgono un ruolo potenziale nella segnalazione immunitaria innata prendendo di mira geni specifici nei molluschi, proprio come fanno nei vertebrati. Successivamente, abbiamo cercato di esplorare la potenziale funzione dell'interazione tra Mcnovel_miR_145 e McIL{{10}} nell'immunità innata di M. coruscus e il loro ruolo nella L’apoptosi indotta da LPS è al centro della nostra attenzione. L'LPS è una molecola altamente proinfiammatoria che è un componente dell'involucro esterno di tutti i batteri Gram-negativi. È stato dimostrato che l'LPS induce l'apoptosi in varie cellule e tessuti, come i macrofagi [54], le cellule endoteliali [55] e il polmone del topo [56]. Un esperimento preliminare ha dimostrato che l'esposizione a LPS ad una concentrazione nominale di 0,1 mg/mL per 24 ore ha indotto significativamente l'apoptosi degli emociti di M. coruscus. Dopo la sovraespressione di McIL-17-3, il livello di apoptosi degli emociti di M. coruscus era significativamente aumentato rispetto al gruppo di controllo, suggerendo che McIL-17-3 può rafforzare l'apoptosi degli emociti indotta da LPS in M. coruscus. I risultati attuali erano coerenti con alcuni studi precedenti. Nei neutrofili umani, IL-17A potrebbe ridurre gli effetti anti-apoptotici mediati dal fattore stimolante le colonie di macrofagi e granulociti [57]. IL-17 induce l'apoptosi delle cellule endoteliali vascolari, che è un potenziale meccanismo della sindrome coronarica acuta [58]. La delezione genetica di IL-17A riduce l'apoptosi delle cellule alveolari di tipo II e quindi allevia la malattia polmonare ostruttiva cronica [59]. Tuttavia, ci sono ancora alcune argomentazioni contrarie. Quando i topi vengono infettati dal virus dell’encefalomielite murina di Theiler, IL-6 e IL-17 promuovono sinergicamente la persistenza virale inibendo l’apoptosi cellulare [60]. Questi conflitti suggeriscono che il meccanismo alla base dell'apoptosi mediata da IL-17- è complesso e che gli IL-17 possono svolgere funzioni opposte a seconda del tipo di infezione.

Quando i McIL-17-3 sono stati co-trasfettati con Mc-novel_miR_145, il livello di apoptosi indotto da LPS era significativamente sottoregolato rispetto all'unico McIL-17-3 trasfettato gruppo, corrispondentemente, il livello di apoptosi era significativamente sovraregolato dopo che McIL-17-3 è stato co-trasfettato con l'inibitore Mc-novel_miR_145. È stato dimostrato che Mc-novel_miR_145 regola negativamente McIL-17-3 e pertanto abbiamo concluso che McIL-17-3 aggrava l'apoptosi degli emociti indotta da LPS, mentre Mc-novel _miR_145 ha alleviato gli effetti. Negli ultimi anni sono stati identificati nei molluschi diversi miRNA che hanno dimostrato di essere coinvolti nell'apoptosi delle cellule umane e di topo. Ad esempio, miR-125b e miR- 335 sono stati trovati nell'ostrica piatta Ostrea edulis [21], miR-184 è stato trovato negli emociti dell'ostrica Crassostrea gigas [23] e miR{{ 26}}, -29, -96, -182 e -193 sono stati trovati nel sistema nervoso centrale in rigenerazione del L. stagnalis [25]. Questi miRNA correlati all'apoptosi identificati attraverso sequenziamento ad alto rendimento e calcoli biologici confermano l'esistenza dell'apoptosi mediata dai miRNA nei molluschi. Chen et al. hanno riportato una sovraregolazione di miR-2d dopo il test con Vibrio Gorgeousus negli emociti di Crassostrea gigas. La sovraespressione di miR-2d era correlata all'espressione knock-down di IκB2 e ad un aumento significativo del tasso di fagocitosi degli emociti, collegato alla soppressione dell'apoptosi [31]. I risultati erano coerenti con il nostro attuale studio, nel complesso, sembrando implicare che i miRNA esercitino una funzione inibitoria sull’apoptosi cellulare nei molluschi. Infatti, la maggior parte dei miRNA correlati all’apoptosi negli esseri umani hanno mostrato effetti inibitori sull’apoptosi. MiR-146 protegge le cellule A549 e H1975 dall'apoptosi indotta da LPS e dal danno infiammatorio attraverso la sovraregolazione di Sirt1, bloccando così le vie NF-κB e Notch [61]. Inoltre, miR-146 attenua l'apoptosi degli epatociti indotta dall'irradiazione e da LPS attraverso l'inibizione della via TLR4 [62]. MiR-93 inibisce l'apoptosi dei condrociti nell'osteoartrosi prendendo di mira la via di segnalazione TLR4/NF-κB [63]. MiR-129-5p allevia le lesioni del midollo spinale nei topi sopprimendo l'apoptosi attraverso la via HMGB1/TLR4/NF-κB [64]. Tuttavia, esistono ancora alcuni miRNA specifici che mostrano azioni rinforzanti sull'apoptosi. Ad esempio, è stato scoperto che miR-203 accelera l'apoptosi indotta da LPS prendendo di mira PIK3CA nelle cellule epiteliali alveolari [65]. Questi risultati suggeriscono la complessità del meccanismo sottostante l’apoptosi mediata dai miRNA.

4. Materiali e metodi

4.1. Design sperimentale

Innanzitutto, McIL-17-3 è stato identificato e caratterizzato da M. coruscus attraverso l'analisi bioinformatica. Successivamente, la distribuzione tissutale delle trascrizioni McIL-17-3 e la sua risposta alla sfida batterica sono state valutate mediante saggi quantitativi di PCR in tempo reale (qPCR). Successivamente, l'associazione tra McIL-17-3 e Mc-novel_miR_145 è stata determinata mediante analisi reporter della luciferasi eseguita in cellule HEK293 ed emociti di M. coruscus. Inoltre, il loro ruolo funzionale nell'apoptosi indotta da LPS è stato valutato mediante citometria a flusso.

4.2. Acqua di mare artificiale

Dopo tre giorni di aerazione dell'acqua del rubinetto municipale, è stato aggiunto cristallo marino istantaneo (Haiding LTD, Ji'an, Cina), accuratamente agitato e sciolto per raggiungere una salinità del 30‰. L'acqua di mare artificiale configurata deve essere aerata per 2 ore prima di essere utilizzata.

4.3. Animali

La cozza dal guscio spesso M. coruscus (lunghezza del guscio, 9,82 ± 0,53 cm; larghezza del guscio, 4,68 ± 0,45 cm; peso umido, 71,2 ± 2,7 g) è stata acquistata dal mercato di Donghe a Zhoushan, provincia di Zhejiang, Cina. Tutte le cozze sono state conservate in vasche riempite con una ASW di circa 25 ◦C e una salinità di 30‰ per più di una settimana prima dei successivi esperimenti.

4.4. Identificazione del cDNA McIL-17-3

Un omologo IL-17 (McIL-17-3) è stato clonato in silico dal trascrittoma completo di M. coruscus (numero di accesso: PRJNA798880, trascrizione F01__12404). La procedura Blast è stata eseguita per prevedere la presunta sequenza aminoacidica McIL-17-3, seguita dall'analisi del dominio funzionale con SMART e dalla valutazione della relazione filogenetica con MEGA-X. L'allineamento multiplo è stato eseguito utilizzando la procedura ClustalW. Il modello svizzero e il pool sono stati utilizzati per prevedere la struttura terziaria della proteina McIL-17-3. La procedura dettagliata era conforme al nostro studio precedente [66].

4.5. Saggi quantitativi in ​​tempo reale PCR

I test PCR quantitativi in ​​tempo reale (qPCR) sono un potente strumento per rilevare e misurare i livelli di espressione genica. Qui, la distribuzione tissutale di McIL-17-3 è stata valutata utilizzando il metodo qPCR. Inoltre, mediante qPCR sono stati rilevati anche cambiamenti nell'espressione dell'mRNA di McIL-17-3 in risposta all'infezione batterica. Il profilo di distribuzione tissutale di McIL-17-3 è stato determinato nelle branchie, nel mantello, nelle ghiandole digestive, nelle gonadi, nei muscoli adduttori e negli emociti utilizzando qPCR programmato a 95 ◦C per 10 min, seguito da 40 cicli di 95 ◦C per 10 s, 60 ◦C per 45 s. Questi tessuti sono stati sezionati da nove individui di cozze e raggruppati insieme per alleviare la differenziazione individuale. Nell'esperimento di sfida batterica, come stimolo immunitario è stato utilizzato V. alginolyticus vivo. Un volume di 100 µl di batteri disciolti in acqua di mare (1 × 108 CFU mL−1) è stato iniettato nell'adduttore delle cozze. Come controllo non sono state utilizzate cozze iniettate. Nove cozze sono state campionate casualmente da ciascun gruppo a 0, 3, 6, 12, 24 e 36 ore dopo la sfida (hpc). Gli emociti di tre cozze sono stati raggruppati insieme per essere considerati come un unico campione e c'erano tre campioni per ciascun punto temporale. I microRNA sono stati estratti utilizzando il miRNA Extraction Kit (HaiGENE, Cat. No.: B1802) e il cDNA è stato sintetizzato utilizzando il miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit (Tiangen, Cat. No.: 4992786) e la qPCR è stata eseguita utilizzando il kit miRcute Plus miRNA qPCR Kit (Tiangen, n. cat.: 4992887). I geni U6 e -actina sono stati utilizzati come riferimenti interni rispettivamente per qPCR e miRNA qPCR. Le coppie di primer specifiche utilizzate in questo esperimento sono elencate nella Tabella 1. I relativi livelli di espressione sono stati misurati utilizzando il metodo 2−∆∆Ct [67].

Tabella 1. Nel presente studio sono state utilizzate coppie di primer per PCR.

4.6. Coltura cellulare

Le cellule HEK293 dei mammiferi (RiboBio Ltd., Guangzhou, Cina) sono state impiegate per eseguire i test reporter della luciferasi per determinare l'attivazione a valle da parte di McIL- 17-3 nonché l'associazione tra Mc-novel_miR{{ 4}} e McIL-17-3. Le cellule HEK293 sono state coltivate in terreno OPTI-MEM (GIBCO) a 37 ◦C, 5% CO2. Per esplorare ulteriormente la regolazione di McIL-17-3 mediante Mc-novel_miR_145 e il loro ruolo funzionale nell'apoptosi indotta da LPS, sono stati recuperati emociti di M. coruscus dal muscolo adduttore di ciascun cozza con un ago monouso da 0,5 mm di diametro (25 G) contenente 0,5 ml di anticoagulante. Gli emociti sono stati raccolti mediante centrifugazione per 5 minuti a 3000 giri/min, 4 ◦C ed è stata aggiunta lo 0,25% di trypsin (Solarbio). Gli emociti sono stati sospesi in un mezzo L-15 contenente il 15% di siero bovino fetale (Solarbio) e coltivati ​​a 26 ◦C con il 5% di CO2.

4.7. Sintesi di miRNA Mimic e Inibitore

I nucleotidi mimici, inibitori e di controllo del romanzo Mc_miR_145 sono stati composti da GenePharma (Shanghai). La loro sequenza è la seguente: Mc-novel_miR_145 mimic, 52032- UCCAGAAAAGCGCUUCGGACG-30; Mc-novel inibitore_miR_145, 50 -CGUCCGAAGCG CUUUUCUGGA-30 (modificato chimicamente da 20 Ome); imitazione del controllo negativo, 50 -UUGUA CUACACAAAAGUACUG-30; e inibitore del controllo negativo, 50 -CAGUACUUUUGUGU AGUACAA-30 (modificato chimicamente da 20 Ome).

4.8. Analisi del reporter della luciferasi

I test reporter della luciferasi sono ampiamente utilizzati per studiare l'espressione genica e l'attività regolatoria. La quantità di luce generata è proporzionale alla quantità di enzima luciferasi prodotto, che a sua volta riflette l'attività dell'elemento regolatore. L'attività luciferasica viene quindi misurata utilizzando un luminometro e i risultati vengono analizzati e interpretati per determinare l'attività regolatoria dell'elemento studiato. I test reporter della luciferasi sono stati impiegati per analizzare l'attivazione a valle di McIL{{0}}. In questo esperimento, il plasmide pEGFP-McIL-17-3 (0.1, 0.5 e 1.0 µg/pozzetto) insieme al pGLNF-κb- luc reporter (0,25 µg/pozzetto) sono stati cotrasfettati in cellule HEK293 utilizzando Lipo6000TM per 24 ore. Come controllo è stato utilizzato un plasmide pEGFP-N1 vuoto. L'attività della luciferasi è stata misurata utilizzando il Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega, Madison, WI, USA) secondo le specifiche, con Renilla luciferasi utilizzata come intercontrollo. Il Mc-novel_miR_145 mirato a McIL-17-3 è stato confermato anche dai test reporter della luciferasi. Il calcolo bioinformatico ha previsto che Mc-novel_miR_145 possa prendere di mira l'30 -UTR di McIL-17-3 e successivamente ha clonato l'30 -UTR di McIL{{ 29}} nel vettore reporter della luciferasi pmiR-RB-ReportTM per costruire il plasmide reporter selvaggio McIL-17-3-30 UTR-WT. Il vettore reporter McIL-17-3-30 UTR-MUT di tipo mutante è stato costruito mutando il nucleotide nei siti 1023-1040: da TCCGAAGCGCTTTCTGG a AGGCTTCGCGAAGACC. L'oligo RNA (Mc-novel_miR_196 NC, mimic, NCi, inibitore) è stato trasfettato insieme a McIL-17-3- 3 0 UTR-WT o McIL-17-3-30 UTR-MUT in HEK293 cellule che utilizzano Lipo6000TM.

4.9. Espressione ricombinante, purificazione e preparazione dell'antisiero

Per valutare l'effetto di Mc-novel_miR_145 sull'espressione della proteina McIL-17-3, è stato preparato un antisiero di McIL-17-3. Il frammento di cDNA che copre l'open reading frame (ORF) di McIL-17-3 è stato amplificato con una coppia di primer specifica (Tabella 1) e inserito nel vettore pET-32a. Il plasmide ricombinante pET-32a-McIL{{10}} è stato trasformato in Escherichia coli (DE3) (Takara) e incubato in terreno LB (contenente 50 mg L−1 kanamicina) a 37 ◦C con agitazione a 130 giri/min per 4 ore. Dopo che la densità ottica ha raggiunto l'assorbanza 0.6 a 600 nm, l'isopropil-beta-D-tiogalattopia interna (IPTG) con una concentrazione finale di 1 mM è stata aggiunta alla soluzione batterica per indurre l'espressione del ricombinante McIL{ proteina {24}} (rMcIL-17-3). Dopo l'incubazione a 37 ◦C per 6 ore, il mezzo è stato centrifugato a 8000 giri/min per 30 minuti per raccogliere i batteri, seguito dalla sospensione in tampone TBS (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8,0). La rMcIL-17-3 è stata purificata mediante cromatografia di affinità con acido Ni-nitrilotriacetico (NI-NTA) e la proteina purificata è stata dializzata dall'imidazolo per 24 ore. La proteina risultante è stata isolata riducendo l'elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS al 12% (SDS-PAGE). La proteina purificata è stata ripiegata in un tampone di glicerolo con gradiente urea-TBS (Tris-HCl 50 mM, NaCl 50 mM, glutatione ridotto 2 mM, glicerolo al 10%, glutatione ossido 0,2 mM, una concentrazione di urea in gradiente di 6, 4, 3, 2 , 1 e 0 M di urea in ciascun gradiente, pH 7,4, ciascun gradiente a 4 ◦C per 12 h). Quindi, la proteina risultante è stata utilizzata per immunizzare topi di 6-settimane affinché acquisissero anticorpi policlonali.

4.10. Western Blot

I campioni proteici sono stati estratti dagli emociti con tampone di lisi RIPA (Beyotime), e quindi la concentrazione è stata rilevata con un kit BCA. Dopo l'isolamento mediante SDS-PAGE, la proteina è stata trasferita su membrane in PVDF sigillate con latte scremato in polvere al 5% in TBST (20 Mm Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Tween-20, pH 8.0), seguito dall'incubazione notturna dell'anticorpo contro McIL-17-3. Successivamente, le membrane sono state incubate con una soluzione diluita di anticorpi IgG anti-topo di capra e coniugato di fosfatasi alcalina (Thermo Fisher Scientific, Cat. No.: 31324) nel tampone di diluizione dell'anticorpo secondario (Beyotime, P0258) per 3 ore. Infine, le proteine ​​immunoreattive sono state rilevate dal sistema di rilevamento ECL.

4.11. Apoptosi

L'apoptosi degli emociti è stata valutata utilizzando la citometria a flusso secondo il manuale del kit di rilevamento dell'apoptosi FITC-Annexin-V (Beyotime). In breve, gli emociti raccolti sono stati trattati per 24 ore con LPS (0,1 mg/ml), 20 nM del plasmide pEGFP-McIL-17-3, Mc novel_miR{{9} } imitano e inibitore di Mc-novel_miR_145. Dopo il lavaggio con PBS, le cellule sono state risospese nel mezzo L15 ad una concentrazione finale di 1 × 106 cellule mL−1 e sono state colorate con FITC-Annexin-V e PI incubate a temperatura ambiente per 25 minuti al buio . Infine, lo strumento di citometria a flusso (Beckman CytoFLEX FCM) è stato utilizzato per rilevare l'apoptosi cellulare e i dati sono stati analizzati utilizzando il software FlowJoTM 10. 4.12. Analisi statistica I risultati sperimentali sono stati presentati come media ± deviazione standard (SD). I risultati sono stati elaborati utilizzando un'analisi ANOVA a due vie della varianza con il test di confronti multipli di Tukey e il software Origin2021 è stato utilizzato per analizzare i dati e costruire cifre.

Cistanche pianta che aumenta il sistema immunitario

5. Conclusioni

In questo studio, un nuovo omologo di IL-17, McIL-17-3, è stato identificato da M. coruscus e si è scoperto che svolge un ruolo cruciale nella difesa immunitaria dei molluschi contro l'attacco batterico. Inoltre, è stato scoperto che McIL-17-3 è regolato negativamente da Mc-novel_miR_145, che contribuisce alla sua partecipazione all'apoptosi indotta da LPS. I risultati di questo studio forniscono preziose informazioni sul ruolo regolatore dell'IL-17 nella risposta immunitaria dei mitili ed evidenziano il potenziale dell'RNA non codificante nella regolazione dei meccanismi di difesa immunitaria degli invertebrati. Tuttavia, è importante notare che esistono alcune limitazioni in questo studio. Nello specifico, il meccanismo alla base della modalità di azione di McIL-17-3 non è stato studiato e richiede ulteriori indagini. Inoltre, questo studio si è concentrato solo sull'interazione tra Mc-novel_miR_145 e McIL-17-3 e non ha esplorato il possibile coinvolgimento di altri miRNA nella risposta immunitaria. Nel complesso, questo studio sottolinea l’importante ruolo dell’RNA non codificante nei meccanismi di difesa immunitaria e suggerisce che la loro modulazione potrebbe servire come potenziale strategia per terapie mirate per varie malattie.

Riferimenti

1. Medzhitov, R.; Janeway, C., Jr. Immunità innata. N. ingl. J.Med. 2000, 343, 338–344. [CrossRef] [PubMed]

2. Lacy, P.; Stow, JL Rilascio di citochine da cellule immunitarie innate: Associazione con diverse vie di traffico di membrana. Sangue J. Am. Soc. Ematolo. 2011, 118, 9–18. [CrossRef] [PubMed]

3. Dinarello, CA Citochine proinfiammatorie. Cassa 2000, 118, 503–508. [CrossRef] [PubMed]

4. Rauta, PR; Nayak, B.; Das, S. Sistema immunitario e risposte immunitarie nei pesci e il loro ruolo nello studio comparativo dell'immunità: un modello per organismi superiori. Immunolo. Lett. 2012, 148, 23–33. [RifCroce]

5. Hymowitz, SG; Filvaroff, EH; Yin, J.; Lee, J.; Cai, L.; Riser, P.; Maruoka, M.; Mao, W.; Foster, J.; Kelley, RF IL-17 adottano una piega del nodo della cistina: struttura e attività di una nuova citochina, IL-17F, e implicazioni per il legame dei recettori. EMBO J. 2001, 20, 5332–5341. [RifCroce]

6. Buckley, KM; Ho, ECH; Hibino, T.; Schrankel, CS; Schuh, nordovest; Wang, GZ; Rast, i fattori JP IL17 sono i primi regolatori nell'epitelio intestinale durante la risposta infiammatoria al Vibrio nella larva del riccio di mare. eLife 2017, 6, e23481. [RifCroce]

7. Cua, DJ; Tato, CM Cellule produttrici di IL-17-innata: le sentinelle del sistema immunitario. Naz. Rev. Immunol. 2010, 10, 479–489. [RifCroce]

8. Mills, cellule produttrici di KH IL-17 e IL-17- nella protezione contro la patologia. Naz. Rev. Immunol. 2022, 10, 479–489. [RifCroce]

9. Hibino, T.; Loza-Coll, M.; Messier, C.; Majeske, AJ; Cohen, AH; Terwilliger, DP; Buckley, KM; Brockton, V.; Nair, SV; Berney, K. Il repertorio del gene immunitario è codificato nel genoma del riccio di mare viola. Dev. Biol. 2006, 300, 349–365. [RifCroce]

10. Albertin, CB; Simakov, O.; Mitros, T.; Wang, ZY; Pungor, JR; Edsinger-Gonzales, E.; Brennero, S.; Ragsdale, CW; Rokhsar, DS Il genoma del polpo e l'evoluzione delle novità neurali e morfologiche dei cefalopodi. Natura 2015, 524, 220–224. [RifCroce]

11. Saco, A.; Rey-Campos, M.; Rosani, U.; Novoa, B.; Figueras, A. L'evoluzione e la diversità dell'interleuchina-17 evidenziano un'espansione negli invertebrati marini e il suo ruolo conservato nell'immunità delle mucose. Davanti. Immunolo. 2021, 12, 692997. [CrossRef] [PubMed]

12. Gerdol, M.; Moreira, R.; Cruz, F.; Gómez-Garrido, J.; Vlasova, A.; Rosani, U.; Venier, P.; Naranjo-Ortiz, MA; Murgarella, M.; Greco, S. La massiccia variazione di presenza-assenza del gene modella un pan-genoma aperto nella cozza mediterranea. Genoma biologico. 2020, 21, 1–21. [RifCroce]

13. Cao, Y.; Yang, S.; Feng, C.; Zhan, W.; Zheng, Z.; Wang, Q.; Deng, Y.; Jiao, Y.; Du, X. Evoluzione e analisi della funzione del gene dell'interleuchina-17 da Pinctada fucata martensii. Immunolo ai crostacei e ai pesci. 2019, 88, 102–110. [CrossRef] [PubMed]

14. Wang, Q.; Xiao, G.; Abbraccio.; Chen, R.; Li, M.; Teng, S. L'interleuchina-17D media i cambiamenti correlati all'infezione da Vibrio harveyi nella Tegillarca granulosa attraverso l'attivazione della proteina attivatrice 1 in vivo. Acquacoltura 2023, 566, 739178. [CrossRef]

15. Lv, X.; Sole, J.; Li, Y.; Yang, W.; Wang, L.; Leng, J.; Yan, X.; Guo, Z.; Yang, Q.; Wang, L. CgIL17-5 regola le espressioni di mRNA degli effettori immunitari inducendo la fosforilazione di CgMAPK e la traslocazione nucleare di CgRel e CgAP-1 nell'ostrica del Pacifico Crassostrea gigas. Dev. Comp. Immunolo. 2022, 127, 104263. [CrossRef] [PubMed]

16. Wang, L.; Sole, J.; Wu, Z.; Lian, X.; Han, S.; Huang, S.; Yang, C.; Wang, L.; Song, L. AP-1 regola l'espressione di IL17-4 e IL17-5 nell'ostrica del Pacifico Crassostrea gigas. Immunolo ai crostacei e ai pesci. 2020, 97, 554–563. [RifCroce]

17. Wu, S.-Z.; Huang, X.-D.; Li, Q.; Lui, M.-X. Interleuchina-17 nell'ostrica perlifera (Pinctada fucata): clonazione molecolare e caratterizzazione funzionale. Immunolo ai crostacei e ai pesci. 2013, 34, 1050–1056. [RifCroce]

18. Xin, L.; Zhang, H.; Zhang, R.; Li, H.; Wang, W.; Wang, L.; Wang, H.; Qiu, L.; Song, L. CgIL17-5, un'antica citochina infiammatoria in Crassostrea gigas che mostra le funzioni di eterogeneità rispetto alle molecole di interleuchina17 dei vertebrati. Dev. Comp. Immunolo. 2015, 53, 339–348. [RifCroce]

19. Denli, AM; Massime, BB; Plasterk, destra; Ketting, RF; Hannon, GJ Elaborazione dei microRNA primari da parte del complesso del microprocessore. Natura 2004, 432, 231–235. [RifCroce]

20. Khan, D.; Ansar Ahmed, S. Regolazione dell'IL-17 nelle malattie autoimmuni da parte di fattori trascrizionali e microRNA. Davanti. Genetta. 2015, 6, 236. [CrossRef]

21. Martín-Gómez, L.; Villalba, A.; Kerkhoven, RH; Apollo, E. Ruolo dei microRNA nel processo immunitario dell'ostrica piatta Ostrea edulis contro la buona miosi. Infettare. Genetta. Evoluzione. 2014, 27, 40–50. [CrossRef] [PubMed]

22. Xu, F.; Wang, X.; Feng, Y.; Huang, W.; Wang, W.; Li, L.; Zanna, X.; Que, H.; Zhang, G. Identificazione di microRNA conservati e nuovi nell'ostrica del Pacifico Crassostrea gigas mediante sequenziamento profondo. PLoS ONE 2014, 9, e104371. [RifCroce]

23. Zhou, Z.; Wang, L.; Canzone, L.; Liu, R.; Zhang, H.; Huang, M.; Chen, H. L'identificazione e le caratteristiche dei microRNA immuno-correlati negli emociti dell'ostrica Crassostrea gigas. PLoS ONE 2014, 9, e88397. [CrossRef] [PubMed]

24. Burgos-Aceves, MA; Cohen, A.; Smith, Y.; Faggio, C. Potenziale regolazione dei microRNA dei geni immuno-correlati negli emociti invertebrati. Sci. Ambiente totale. 2018, 621, 302–307. [RifCroce]

25.Walker, SE; Spencer, GE; Necakov, A.; Carlone, RL Identificazione e caratterizzazione dei microRNA durante la rigenerazione indotta dall'acido retinoico del sistema nervoso centrale di un mollusco. interno J.Mol. Sci. 2018, 19, 2741. [CrossRef] [PubMed]

26. Abo-Al-Ela, HG; Faggio, C. Risposta allo stress mediata da microRNA nelle specie bivalvi. Ecotossicolina. Ambiente. Saf. 2021, 208, 111442. [CrossRef] [PubMed]

27. Huang, S.; Yoshitake, K.; Asaduzzaman, M.; Kinoshita, S.; Watanabe, S.; Asakawa, S. Scoperta e comprensione funzionale dei miRNA nei molluschi: un approccio di profilazione dell'intero genoma. RNA biologico. 2021, 18, 1702–1715. [RifCroce]

28. Rosani, U.; Bortoletto, E.; Bai, C.-M.; Novoa, B.; Figueras, A.; Venier, P.; Fromm, B. Scavando nei miRNAomi bivalvi: tra conservazione e innovazione. Filos. Trans. R.Soc. B 2021, 376, 20200165. [CrossRef]

29. Sole, X.; Zhang, T.; Li, L.; Tu, K.; Yu, T.; Wu, B.; Zhou, L.; Tian, ​​J.; Liu, Z. Firma dell'espressione del microRNA nei muscoli adduttori striati e lisci della capesante Yesso Patinopecten yessoensis. Genomica 2022, 114, 110409. [CrossRef]

30. Tian, ​​R.; Zheng, Z.; Huang, R.; Jiao, Y.; Du, X. miR-29a ha partecipato alla formazione della madreperla e alla risposta immunitaria prendendo di mira Y2R in Pinctada martensii. interno J.Mol. Sci. 2015, 16, 29436–29445. [RifCroce]

31. Chen, H.; Zhou, Z.; Wang, H.; Wang, L.; Wang, W.; Liu, R.; Qiu, L.; Song, L. Un microRNA specifico per gli invertebrati e immuno-reattivo aumenta la fagocitosi degli emociti dell'ostrica prendendo di mira CgIκB2. Sci. Rep. 2016, 6, 1–10. [CrossRef] [PubMed]

32. Chen, H.; Zhou, Z.; Wang, L.; Wang, H.; Liu, R.; Zhang, H.; Song, L. Un miRNA specifico per gli invertebrati ha preso di mira l'antico sistema neuroendocrino colinergico delle ostriche. Apri Biol. 2016, 6, 160059. [CrossRef]

33. Chen, H.; Xin, L.; Canzone, X.; Wang, L.; Wang, W.; Liu, Z.; Zhang, H.; Wang, L.; Zhou, Z.; Qiu, L. Un miRNA sensibile alla norepinefrina promuove direttamente l'espressione di CgHSP90AA1 negli emociti di ostriche durante l'essiccazione. Immunolo ai crostacei e ai pesci. 2017, 64, 297–307. [CrossRef] [PubMed]

34. Han, Z.; Li, J.; Wang, W.; Li, J.; Zhao, Q.; Li, M.; Wang, L.; Song, L. Una calmodulina presa di mira dall'impalcatura di miRNA659_26519 regola l'espressione di IL-17 nella risposta immunitaria precoce dell'ostrica Crassostrea gigas. Dev. Comp. Immunolo. 2021, 124, 104180. [CrossRef] [PubMed]

35. Lv, Z.; Li, C.; Zhang, P.; Wang, Z.; Zhang, W.; Jin, C.-H. miR-200 modula le attività antibatteriche dei celomociti e il priming dell'LPS prendendo di mira Tollip nell'Apostichopus japonicus. Immunolo ai crostacei e ai pesci. 2015, 45, 431–436. [RifCroce]

36. Li, C.; Zhao, M.; Zhang, C.; Zhang, W.; Zhao, X.; Duan, X.; Xu, W. miR210 modula il burst respiratorio nei celomociti di Apostichopus japonicus prendendo di mira il recettore Toll-like. Dev. Comp. Immunolo. 2016, 65, 377–381. [RifCroce]

37. Lv, M.; Chen, H.; Shao, Y.; Li, C.; Zhang, W.; Zhao, X.; Jin, C.; Xiong, J. miR-92a regola l'apoptosi dei celomociti nel cetriolo di mare Apostichopus japonicus prendendo di mira Aj14-3-3ζ in vivo. Immunolo ai crostacei e ai pesci. 2017, 69, 211–217. [RifCroce]

38. Shao, Y.; Li, C.; Xu, W.; Zhang, P.; Zhang, W.; Zhao, X. miR-31 collega il metabolismo dei lipidi e l'apoptosi cellulare nell'Apostichopus japonicus sfidato dai batteri prendendo di mira CTRP9. Davanti. Immunolo. 2017, 8, 263. [CrossRef]

39. Guo, M.; Wang, Y.; Fu, X.; Tao, W.; Li, C. circRNA1149 di Apostichopus japonicus sopprime l'apoptosi dei celomociti come miR-92una spugna per regolare l'espressione di Bax in risposta all'infezione da Vibrio Gorgeousus. Acquacoltura 2023, 562, 738812. [CrossRef]

40. Zuo, H.; Weng, K.; Luo, M.; Yang, L.; Weng, S.; Lui, J.; Xu, X. Un'inibizione mediata da MicroRNA-1 della via NF-κB da parte della via JAK-STAT nell'invertebrato Litopenaeus vannamei. J. Immunolo. 2020, 204, 2918–2930. [RifCroce]

41. Yang, H.; Xu, Z.; Guo, B.; Zhang, X.; Liao, Z.; Qi, P.; Yan, X. L'analisi integrata del miRNAoma e del trascrittoma rivela la regolazione della rete miRNA-mRNA nella cozza a guscio spesso infettata da Vibrio alginolyticus Mytilus coruscus. Mol. Immunolo. 2021, 132, 217–226. [CrossRef] [PubMed]

42. de Morales, JMGR; Puig, L.; Daudén, E.; Canete, JD; Pablos, JL; Martin, AO; Juanatey, CG; Adán, A.; Montalbán, X.; Borruel, N. Ruolo critico dell'interleuchina (IL)-17 nei disturbi infiammatori e immunitari: una revisione aggiornata delle prove incentrata sulle controversie. Autoimmune. Rev. 2020, 19, 102429. [CrossRef] [PubMed]

43. Kawaguchi, M.; Adachi, M.; Oda, N.; Kokubu, F.; Huang, S.-K. Famiglia di citochine IL-17. J. Clinica allergica. Immunolo. 2004, 114, 1265–1273. [CrossRef] [PubMed]

44. Starnes, T.; Broxmeyer, SE; Robertson, MJ; Hromas, R. Avanguardia: IL-17D, un nuovo membro della famiglia IL-17, stimola la produzione di citochine e inibisce l'emopoiesi. J. Immunolo. 2002, 169, 642–646. [CrossRef] [PubMed]

45. Gaffen, SL; Kramer, JM; Jeffrey, JY; Shen, F. La famiglia delle citochine IL-17. Vitam. Horm. 2006, 74, 255–282. [PubMed]

46. ​​Roberts, S.; Gueguen, Y.; de Lorgeril, J.; Goetz, F. Rapido accumulo di una trascrizione omologa dell'interleuchina 17 negli emociti di Crassostrea gigas in seguito all'esposizione batterica. Dev. Comp. Immunolo. 2008, 32, 1099–1104. [CrossRef] [PubMed]

47. Li, J.; Zhang, Y.; Zhang, Y.; Xiang, Z.; Tong, Y.; Qu, F.; Yu, Z. Caratterizzazione genomica e analisi dell'espressione di cinque nuovi geni IL-17 nell'ostrica del Pacifico, Crassostrea gigas. Immunolo ai crostacei e ai pesci. 2014, 40, 455–465. [RifCroce]

48. Gaffen, SL Struttura e segnalazione nella famiglia dei recettori IL-17. Naz. Rev. Immunol. 2009, 9, 556–567. [RifCroce]

49. Hata, K.; Andoh, A.; Shimada, M.; Fujino, S.; Bamba, S.; Araki, Y.; Okuno, T.; Fujiyama, Y.; Bamba, T. IL-17 stimola le risposte infiammatorie tramite le vie della chinasi NF-κB e MAP nei miofibroblasti del colon umano. Sono. J. Physiol. -Gastrointestinale. Fisiolo del fegato. 2002, 282, G1035–G1044. [RifCroce]

50. Niimoto, T.; Nakasa, T.; Ishikawa, M.; Okuhara, A.; Izumi, B.; Deie, M.; Suzuki, O.; Adachi, N.; Ochi, M. MicroRNA-146a si esprime nelle cellule T che producono interleuchina-17 nei pazienti con artrite reumatoide. Muscoloscheletrico BMC. Disordine. 2010, 11, 1–11. [RifCroce]

51. Srivastava, A.; Nikamo, P.; Lohcharoenkal, W.; Coperchio.; Meisgen, F.; Landén, NX; Ståhle, M.; Pivarcsi, A.; Sonkoly, E. MicroRNA- 146a sopprime l'infiammazione cutanea mediata da IL-17 ed è geneticamente associato alla psoriasi. J. Clinica allergica. Immunolo. 2017, 139, 550–561. [CrossRef] [PubMed]

52. Zhao, S.; Cheng, Y.; Kim, JG microRNA-146a sottoregola IL-17 e IL-35 e inibisce la proliferazione delle cellule staminali del legamento parodontale umano. J.Cell. Biochimica. 2019, 120, 13861–13866. [CrossRef] [PubMed]

53. Podsiad, A.; Standiford, TJ; Ballinger, Minnesota; Eakin, R.; Parco, P.; Kunkel, SL; Moore, BB; Bhan, U. MicroRNA-155 regola la risposta immunitaria dell'ospite alla polmonite batterica postvirale tramite la via IL-23/IL-17. Sono. J. Physiol. -Cellula polmonare. Mol. Fisiolo. 2016, 310, L465–L475. [RifCroce]

54. Xaus, J.; Comalada, M.; Valledor, AF; Lloberas, J.; López-Soriano, F.; Argilés, JM; Bogdan, C.; Celada, A. LPS induce l'apoptosi nei macrofagi principalmente attraverso la produzione autocrina di TNF-. Sangue J. Am. Soc. Ematolo. 2000, 95, 3823–3831.

55. Bannerman, DD; Goldblum, SE Meccanismi di apoptosi endoteliale indotta da lipopolisaccaridi batterici. Sono. J. Physiol.-cellula polmonare. Mol. Fisiolo. 2003, 284, L899–L914. [RifCroce]

56. Ottone, DM; Hollingsworth, JW; Cinque, M.; Li, Z.; Potts, E.; Toloza, E.; Foster, WM; Schwartz, DA L'inalazione cronica di LPS provoca cambiamenti simili all'enfisema nel polmone del topo associati all'apoptosi. Sono. J. Respirazione. Cella Mol. Biol. 2008, 39, 584–590. [RifCroce]

57. Drago, S.; Saffar, AS; Shan, L.; Gounni, AS IL-17 attenua gli effetti anti-apoptotici del GM-CSF nei neutrofili umani. Mol. Immunolo. 2008, 45, 160–168. [CrossRef] [PubMed]

58. Zhu, F.; Wang, Q.; Guo, C.; Wang, X.; Cao, X.; Shi, Y.; Gao, F.; Mac.; Zhang, L. IL-17 induce l'apoptosi delle cellule endoteliali vascolari: un potenziale meccanismo per la sindrome coronarica acuta umana. Clinica. Immunolo. 2011, 141, 152–160. [RifCroce]

59.Chang, Y.; Al-Alwan, L.; Audusseau, S.; Chouiali, F.; Carlevaro-Fita, J.; Iwakura, Y.; Baglole, CJ; Eidelman, DH; Hamid, Q. La delezione genetica di IL-17A riduce l'infiammazione indotta dal fumo di sigaretta e l'apoptosi delle cellule alveolari di tipo II. Sono. J. Physiol. -Cellula polmonare. Mol. Fisiolo. 2014, 306, L132–L143. [RifCroce]

60. Hou, W.; Jin, Y.-H.; Kang, HS; Kim, BS Interleuchina-6 (IL-6) e IL-17 promuovono sinergicamente la persistenza virale inibendo l'apoptosi cellulare e la funzione delle cellule T citotossiche. J.Virol. 2014, 88, 8479–8489. [RifCroce]

61. Wang, Q.; Coperchio.; Han, Y.; Ding, X.; Xu, T.; Tang, B. MicroRNA-146 protegge le cellule A549 e H1975 dall'apoptosi indotta da LPS e dalle lesioni infiammatorie. J. Biosci. 2017, 42, 637–645. [CrossRef] [PubMed]

62. Chen, Y.; Wu, Z.; Yuan, B.; Dong, Y.; Zhang, L.; Zeng, Z. MicroRNA-146a-5p attenua l'attivazione delle cellule stellate epatiche indotta da irradiazione e LPS e l'apoptosi degli epatociti attraverso l'inibizione della via TLR4. Morte cellulare Dis. 2018, 9, 1–16. [CrossRef] [PubMed]

63. Ding, Y.; Wang, L.; Zhao, Q.; Wu, Z.; Kong, L. MicroRNA-93 inibisce l'apoptosi dei condrociti e l'infiammazione nell'osteoartrosi prendendo di mira la via di segnalazione TLR4/NF-κB. interno J.Mol. Med. 2019, 43, 779–790. [RifCroce]

64. Wan, G.; Qualunque.; Tao, J.; Wang, Y.; Zhou, Q.; Yang, R.; Liang, Q. MicroRNA-129-5p allevia le lesioni del midollo spinale nei topi sopprimendo l'apoptosi e la risposta infiammatoria attraverso la via HMGB1/TLR4/NF-κB. Biosci. Rep. 2020, 40, BSR20193315. [CrossRef] [PubMed]

65. Ke, X.-F.; Zanna, J.; Wu, X.-N.; Yu, C.-H. Il microRNA-203 accelera l'apoptosi nelle cellule epiteliali alveolari stimolate da LPS prendendo di mira PIK3CA. Biochimica. Biofisica. Ris. Comune. 2014, 450, 1297–1303. [CrossRef] [PubMed]

66. Qi, P.; Tang, Z. La molecola Nrf2 innesca la difesa antiossidante contro l'esposizione acuta al benzo (a) pirene nella cozza dal guscio spesso Mytilus coruscus. Aquat Toxicol 2020, 226, 105554. [CrossRef]

67. Schmittgen, TD; Livak, KJ Analisi dei dati PCR in tempo reale mediante il metodo CT comparativo. Naz. Protoc. 2008, 3, 1101–1108. [RifCroce]