Schema di espressione di -tubulina, inversina e il suo bersaglio spettinato-1 e morfologia delle ciglia primarie nello sviluppo normale del rene umano e nelle malattie

edmund.chen@wecistanche.com

Astratto:L'espressione spaziotemporale delle proteine ​​-tubulina, inversione e spettinata-1 (DVL-1) associate alla via di segnalazione Wnt e la morfologia delle ciglia primarie sono state analizzate nello svilupporeni(14a-38a settimana di sviluppo), postnatale sano (1.5- e 7-anni) e umano patologicamente modificatoreni,compreso il displastico multicisticoreni(MCDK), glomerulosclerosi segmentaria focale (FSGS) e sindrome nefrosica di tipo finlandese (CNF). L'analisi è stata eseguita mediante doppia immunofluorescenza, microscopia elettronica, metodi semiquantitativi e statistici. La coespressione citoplasmatica di -tubulina, inversione e DVL-1 è stata osservata nei tubuli contorti prossimali (pct), nei tubuli contorti distali (dct) e nei glomeruli (g) dei tessuti analizzati. In occasionerenesviluppo, l'espressione complessiva di -tubulina, inversione e DVL-1diminuiva, mentre nel periodo postnatale aumentava leggermente. Le più alte espressioni di -tubulina e inversione caratterizzavano dct e g, mentre un alto DVL-1 caratterizzava pct. -tubulina, inversione e modelli di espressione DVL-1 in MCDK, FSGS e CNFrenidifferiva significativamente dal controllo sano. Rispetto a sanoreni, patologicamente modificatoreniaveva ciglia primarie dismorfiche. Dinamiche di espressione diverse di -tubulina, inversione e DVL-1 duranterenelo sviluppo potrebbe indicare che il passaggio dalla segnalazione Wnt canonica a quella non canonica è essenziale per la normalitàrenemorfogenesi. Al contrario, la loro espressione disturbata in patologicarenipotrebbe essere associato a ciglia primarie anormali, che portano a cronicomalattie renali.

Parole chiave:sviluppo del rene umano; -tubulina; inverso; DVL-1; MCDK; FSGS; CNF; rene, renale

CISTANCHE MIGLIORA LA MALATTIA RENALE/RENALE

introduzione 

Lo sviluppo del definitivo o metanefricoreniinizia durante la quinta settimana gestazionale (GW), che poi si differenzia continuamente per formare i reni permanenti [1,2]. Le interazioni di segnalazione tra il mesenchima metanefrico e la gemma ureterale garantiscono una corretta interazionerenesviluppo durante la nefrogenesi. In breve, la gemma ureterale induce la transizione mesenchimale-epiteliale (MET) nel mesenchima metanefrico, che si condensa e si formarenalevescicole, seguite da corpi a forma di virgola e a forma di S, e infine portano alla formazione di glomeruli [3]. In cambio, il mesenchima induce un'ulteriore ramificazione della gemma ureterale. I reni metanefrici diventano unità funzionali escretrici all'undicesima settimana di sviluppo umano. Tuttavia, la nefrogenesi è completata entro la 34a-36a settimana di sviluppo fetale, quando sono terminati più eventi di ramificazione, ma l'ulteriore processo di differenziazione dei reni continua nel periodo postnatale [4,5]. Le interruzioni di queste complesse interazioni provocano varie anomalie congenite del rene e del tratto urinario (CAKUT), tra cui displasia, malattia del rene policistico, displasia multicisticamalattie renali(MCDK), portando di conseguenza a cronicomalattie renali(MRC) [6].

In questo studio, ci siamo concentrati sull'aspetto delle ciglia primarie e sulla via di segnalazione Wnt, che svolge un ruolo importante durante la normale nefrogenesi e nelreneprocesso di riparazione, a seguito di acute o cronichemalattie renali[7]. L'esistenza delle ciglia primarie durante la nefrogenesi e il gran numero di svilupporenei difetti che si verificano nei pazienti con malattia ciliare sottolineano che la vera funzione primaria delle ciglia è necessaria per la normalitàreneorganogenesi [8,9]. Il ciglio primario è un organello a base di microtubuli importante per l'omeostasi dei tessuti, dove la -tubulina è il componente di base [10]. La perdita di acetilazione della -tubulina nelle cellule immortalate innesca la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT), implicando così che la -tubulina acetilata è importante nella stabilizzazione dei microtubuli [11]. Durante lo sviluppo umano, la via primaria Wnt mediata dalle ciglia consente la proliferazione cellulare, la differenziazione e la morfogenesi dei tessuti [12]. Un numero significativo di bambini con funzione delle ciglia primarie compromessa e via di segnalazione Wnt interrotta sviluppa CKD, dove congenitarenalei disturbi sono responsabili di quasi la metà dei casi [13]. La malattia cistica congenita più comune nei bambini è la displastica multicisticamalattie renali(MCDK) [14]. Cisti multiple che non comunicano [15] e mancano di normalitàrenaleparenchima sono reperti microscopici caratteristici per MCDK. La glomerulosclerosi focale segmentale (FSGS) è una delle malattie glomerulari più comuni che portano allo stadio terminalemalattie renali[16]. All'inizio, FSGS è caratteristico di essere focale, coinvolgendo solo una minoranza dei glomeruli e segmentale, comportando cambiamenti solo in un segmento del cerchio glomerulare [17]. La sindrome nefrosica congenita di tipo finlandese (CNF) è una rara malattia autosomica recessivamalattie renalirappresentato da un focolaio prenatale di ampia perdita di proteine ​​[18], associata a cistogenesi dei tubuli prossimali [19]. Molte forme di malattie glomerulari primarie sviluppano proteinuria a causa della barriera di filtrazione glomerulare danneggiata [20]. Una notevole quantità di studi implica che la lesione e la disfunzione dei podociti abbiano ruoli intrinseci nella patogenesi della proteinuria CKD [21]. Lo studio di Vukojevic et al. mostra un aumento del numero di podociti ciliati e scarsamente differenziati nel CNF [22]. Precedenti studi hanno indicato che la via di segnalazione Wnt/-catenina ha un ruolo fondamentale nel moderare la disfunzione dei podociti con proteinuria [23]. Esistono due principali vie di segnalazione Wnt, una nota come canonica -catenina-dipendente e l'altra non canonica, -catenina indipendente. Durante il mouserenesviluppo, la segnalazione canonica di Wnt è attiva sulle punte delle gemme ureteriche e nei corpi a forma di S [24]. Inoltre, Wnt tramite la segnalazione canonica ha rilevanza nel mantenimento del MET durante la nefrogenesi [25]. Vale a dire, il legame del complesso proteico contenente Dvl al recettore di membrana è obbligatorio per l'attivazione della via Wnt, mentre la disabilitazione dei componenti chiave di questa via provoca una mortalità perinatale precoce a causa dell'assenza della zona nefrogenica nelrene[25]. 

Una proteina cruciale come interruttore molecolare tra le vie di segnalazione Wnt canoniche e non canoniche è risultata essere l'inversione [26]. Sebbene siano state rilevate interazioni di varie proteine ​​con l'inversione, la sua esatta funzione non è stata ancora completamente chiarita. Nelrenalecellule epiteliali, l'inversione si trova nelle ciglia primarie, agendo come una proteina ciliare [27]. Inoltre, l'inversione forma un complesso stabile con la tubulina nelle colture direnalecellule, e colocalizzano in vivo [27,28]. L'inversione sembra giocare un ruolo essenziale nella morfogenesi precoce del sistema pronefrico e nella determinazione della simmetria sinistra-destra durante lo sviluppo [29,30]. Un evento significativo per le vie di segnalazione Wnt sia canoniche che non canoniche nel reclutamento del Dvl citoplasmatico sulla membrana cellulare. Poiché i risultati precedenti hanno mostrato che l'inversione e Dvl colocalizzano nelle cellule epiteliali renali, si può ipotizzare che l'inversione possa anche avere un ruolo nella segnalazione non canonica. La disregolazione della segnalazione Wnt mediata dall'inversione innesca una proliferazione aberrante nei tubuli [31]. I test genetici hanno rivelato una mutazione DVL-1 in pazienti con sindrome di Robinow autosomica dominante, che presenta disordini eterogenei in alcuni pazienti associati arenaleanomalie [32].

CISTANCHE MIGLIORERA' LA DIALISI RENALE/RENALE

Il modello di espressione dello sviluppo di -tubulina, inversione e DVL-1 è stato studiato in diversi modelli animali. Pertanto, la loro espressione nel pronefro di Xenopus laevis è stata confermata mediante microscopia intravitale [31], mentre sono stati trovati in linee cellulari derivate da cellule tubulari prossimali murine mediante microscopia confocale e spettrometria di massa [33]. Inoltre, la microscopia ottica e la doppia immunofluorescenza hanno rivelato la loro presenza in sezioni di topireni[34]. Studi su topi knockout per inversione hanno riportato cisti allargate e diffuse nelrenalemidollo e corteccia associati all'inversione viscerale del sito [35]. Nell'uomo, la mutazione dell'inversione è stata presentata con nefronoftisi infantile che ha portato all'interruzione della gravidanza [36]. Nonostante i numerosi studi surenale-tubulina, inversione e pattern e funzione di espressione DVL-1, al meglio delle nostre conoscenze, un pattern di espressione di queste proteine ​​nel tessuto umano fetale e postnatale non è stato ancora studiato e portato a una correlazione. Inoltre, non sono state riportate prove che considerino l'espressione di inversione e DVL-1 nel primo sviluppo umano. Pertanto, questo studio mirava ad analizzare il pattern di espressione spaziale e temporale di -tubulina, inversione e DVL-1 durante le fasi fetali e postnatali di esseri umani sanireni, così come inrenetessuti di MCDK, FSGS e CNFrenial fine di stabilire un possibile anello mancante tra queste entità. Vale a dire, proponiamo che i modelli di espressione disturbati delle proteine ​​-tubulina, inversione e DVL-1 potrebbero essere il processo di cistogenesi sottostante e una funzione anormale delle ciglia primarie che porta amalattie renali. 

Risultati

L'analisi dello sviluppo e del post-natalerenetessuti è stato eseguito su strutture nettamente differenziate delrene:tubuli contorti prossimali (pct), tubuli contorti distali (dct) e glomeruli (g). Durante le fasi di sviluppo analizzate e nel postnatalerenetessuti, -tubulina, inversione e DVL-1 hanno mostrato pattern di espressione positivi ma con differenze di intensità, distribuzione e quantità. L'analisi del patologicotessuto renaledi MCDK, FSGS e CNF è stato eseguito sul conteggio completo delle immagini delle cellule positive rispetto al controllo del tessuto renale sano.

2.1. Microscopia ottica, microscopia elettronica e immunoistochimica (-tubulina) di tessuto renale umano postnatale sano e patologicamente modificato

2.1.1. Luce renale postnatale sana

microscopia del postnatalereneil tessuto risulta ben definitorenestrutture, con una netta differenza tra midollo e corteccia e la formazione di pct, dct e g nella regione corticale. La colorazione immunoistochimica della -tubulina rivela la presenza di un ciglio primario al centro della superficie cellulare apicale di ciascuna cellula tubulare e in 0.018% ± 0,00014% SD sulla superficie delle cellule glomerulari. La microscopia elettronica mostra la presenza di un solo cilio primario derivante dal corpo basale sulla superficie cellulare apicale del tubulo (Figura 1a).

2.1.2. CNF

La maggior parte delle g analizzate sono più piccole e lobulate (80 percento), mentre la minoranza è di dimensioni normali o ipertrofiche (20 percento, n=100). Si trova sclerosi segmentale o globale di g, mentre pct e dct sono parzialmente dilatati e ricoperti da epitelio atrofico. Dal punto di vista ultrastrutturale, si osserva la perdita di microvilli e la diminuzione dell'altezza cellulare con multiframmentazione dei nuclei. Nei podociti, i processi del piede sono ampiamente persi. Le ciglia primarie tubolari sono disorganizzate, in particolare nelle cisti dei tubuli prossimali, mostrando cambiamenti nella lunghezza e nella posizione citoplasmatica (Figura 1b).

2.1.3. MCDK

Nel tessuto renale si possono trovare sporadiche g immature e mature.Reneil tessuto è pieno di numerose cisti ovali. Le cellule epiteliali colonnari coprono le cisti e sono circondate da tessuto connettivo lasso. La colorazione immunoistochimica a -tubulina mostra più ciglia primarie lunghe e disorganizzate sulla superficie delle cellule epiteliali (Figura 1c).

2.1.4. FSGS

Nel 90% di g si riscontra una sclerosi segmentaria estesa (n=100), associata a fibrosi interstiziale e segni di danno tubulare. La diminuzione dell'altezza delle cellule epiteliali con perdita di microvilli si trova nel microscopio elettronico, mentre le cellule endoteliali e le regioni mesangiali hanno un'ultrastruttura regolare. Nel microscopio elettronico, il ciglio estremamente lungo e dislocato (decentralizzato) viene osservato sulla superficie della cellula tubulare distale (Figura 1e). I podociti mostrano una perdita diffusa dei processi del piede con un ampio tessuto di microvilli. La colorazione immunoistochimica all'a-tubulina mostra più ciglia primarie lunghe e disorganizzate sulla superficie delle cellule epiteliali (Figura 1c).

2.2. Colorazione immunoistochimica per 心tubulina, inversione e DVL-1- e analisi statistica di reni umani postnatali in via di sviluppo e sani

Nella 14a, 15a e 16a settimana gestazionale, ilreneil tessuto si presenta con diversi stadi di sviluppo della formazione del nefrone: dalle coppe metanefriche,renalele fasi delle vescicole per comandare i nefroni a forma di S, formando così la zona nefrogenica nella corteccia esterna (Figura 2). La differenziazione di pct, dct e g può essere osservata nelle regioni corticali più vicine alrenemidollo. Durante il 22° GW, parti del midollo e della corteccia divennero chiaramente distintive, mentre nel 38° GW,renele strutture appaiono come altamente differenziate, contenenti forme mature di pct, dct e g

2.2.1. a-tubulina

Durante lo sviluppo, l'a-tubulina è fortemente espressa in tutto lo svilupporenestrutture, visualizzando principalmente la forma delle ciglia primarie sulle superfici delle cellule epiteliali parietali della capsula di Bowman, g, pct e dct. Entrorenetessuto, l'82-97 percento delle cellule PCT esprime a-tubulina, mentre in dct l'espressione scende dal 99 percento al 72 percento nel 38° GW (vedi Figura 3, Tabella 1). Tra i diversi stadi di sviluppo, l'espressione più forte di a-tubulina si trova nella g del 16° GWreni, contenente il 93 percento di cellule positive. flessuoso 14°, 15° e 22° GW (vedi Figura 3a, b, Tabella 1), circa il 70 percento delle cellule g esprime a-tubulina, mentre l'espressione minima si osserva nel 38° GW (p <0,01) con="" il="" 34="" percento="" delle="" cellule="" positive="" (figura="" 3c).="" nel="">renetessuto (1.5-anni e 7-annireni), la più forte immunoreattività all'a-tubulina si osserva sulla superficie cellulare apicale di pct e dct (Figura 3d-f). L'espressione di a-tubulina è presente anche nel citoplasma perinucleare del dct e nelle cellule epiteliali parietali della capsula di Bowman. l'a-tubulina macchia tuttorenalestrutture con una media del 50 percento di cellule positive in pct, 94 percento in dct e 85 percento in g (Figura 3f). Macchie Dct significativamente diverse da PCT (p < 0,0001).="" tutte="" le="" strutture="" studiate="" sono="" positive="" all'a-tubulina,="" con="" il="" 77%="" di="" cellule="" positive="" in="" pct,="" il="" 72%="" in="" dct="" e="" il="" 58%="" in="" g="">

Figura 3. Colorazione di immunofluorescenza di -tubulina e DAPI nei tessuti renali umani in via di sviluppo e postnatale (a-e). Reni del 14°, 15°/16°, 38° GW (a–c);renidi 1.5- e 7-bambini di un anno (d,e). La colorazione positiva della -tubulina (frecce) è mostrata in ciascuna struttura della corteccia attraverso le fasi dello sviluppo e postnatale (a-e), i tubuli contorti prossimali (pct), i tubuli contorti distali (dct) e i glomeruli (g). I dettagli delle ciglia primarie in pct (d) e dct (a–c, e) sono mostrati come inserti con ingrandimento maggiore (riquadro bianco). Ingrandimento ×40, barra della scala 100 µm. La distribuzione delle cellule positive alla tubulina per struttura durante i diversi stadi di sviluppo e nel periodo postnatale è mostrata nel grafico (f). Il grafico (g) (numero complessivo di cellule proteine ​​positive nelle strutture osservate) mostra l'espressione proteica correlata al tempo di sviluppo (regressione lineare) e l'interrelazione tra -tubulina e DVL-1 attraverso lo sviluppo e la maturazione (ANOVA a due vie seguita da test post hoc di SIDAK). I dati sono mostrati come media ± DS.

La distribuzione delle cellule -tubulina-positive per struttura durante i diversi stadi di sviluppo e nel periodo postnatale è mostrata nel grafico (f). Il grafico (g) (numero complessivo di cellule proteine ​​positive nelle strutture osservate) mostra l'espressione proteica correlata al tempo di sviluppo (regressione lineare) e l'interrelazione di -tubulina a DVL-1 attraverso lo sviluppo e la maturazione (ANOVA a due vie seguita da test post hoc di Sidak). I dati sono mostrati come medie ± SD.

2.2.2. Colorazione a doppia immunofluorescenza per inversione e colorazione nucleare DVL-1 e DAPI nello sviluppo e nell'espressione di inversione dei reni postnatali sani nel tessuto renale in via di sviluppo e postnatale

Nel 14°, 15° e 16° GW, l'inversione mostra una forte espressione granulare in g e una lieve espressione granulare nel citoplasma di pct e dct (Figura 4a, b), mentre nel 22° e 38° GW (vedi Figura 4c), il forte l'espressione positiva si osserva in g (Tabella 1). Tra il 14° e il 22° GW, circa il 50 percento delle celle esprime la versione. Nel 16° GW, le cellule PCT esprimono l'inversione nel 73 percento delle cellule, mentre decrescono al 29 percento delle cellule (p <0,05) nel="" 38°="" gw="" (vedi="" figura="" 4f).="" l'espressione="" positiva="" dell'inversione="" si="" trova="" in="" circa="" l'80-90="" percento="" delle="" cellule="" dct="" e="" g="" nel="">renetessuti del 14° e 16° GW, con l'espressione più bassa in dct del 38° GW (p <{3}}.{5}}5, p=""><0,0001, rispettivamente)="" dove="" il="" 66%="" delle="" cellule="" era="" positivo.="" in="">reni, pct si colora fortemente sulla membrana cellulare apicale, mentre il dct si colora principalmente sulla membrana cellulare basale e nel citoplasma perinucleare (Figura 4d, e). A quel punto, abbiamo trovato espressione di inversione in tutti gli investigatirenalestrutture, inclusi pct, dct e g, con un'espressione media di cellule positive del 92 percento per pct, 88 percento per dct e 90 percento per g (Figura 4f). Non abbiamo osservato una differenza significativa nella forza del segnale dell'espressione di inversione tra le strutture. La più alta espressione di inversione si trova in g, con una media del 94 percento di cellule positive (Figura 4f). È stata trovata una differenza significativa confrontando la colorazione di g (dove il 94% delle cellule si colora positivamente) con pct, dove il 58% delle cellule si colora positivamente (p <{11}}.01) e="" con="" dct,="" dove="" il="" 49%="" delle="" cellule="" è="" positivo="" (p="">< 0,0001,="" figura="">

DVL-1 Espressione nel tessuto renale in via di sviluppo e postnatale

Si osserva un'espressione da lieve a forte di DVL{{0}} nel citoplasma di pct, dct e g nel periodo fetale (vedi Figura 4a-c, Tabella 1). In PCT, il 76-86 percento delle cellule esprime DVL-1 nel 14°-22° GW, mentre nel 38° GW ci sono il 57% di cellule positive (Figura 4g). Nel 14° e 15° GW, il 68–70 percento delle cellule esprime DVL-1, nel 16° e 22° GW, il numero di cellule positive scende a 42–5{{41} } percento , mentre nella 38a espressione GW (p < 0,001),="" si="" osserva="" nel="" 19="" percento="" delle="" cellule="" dct.="" l'espressione="" di="" dvl-1="" aumenta="" in="" g="" durante="" le="" fasi="" fetali:="" nel="" 14°="" gw="" è="" del="" 6%,="" mentre="" nel="" 15°,="" 16°="" e="" 22°="" gw="" aumenta="" al="" 10%="" (p=""><0,01). nel="" 38="" gw,="" il="" 14="" percento="" delle="" cellule="" g="" esprime="" dvl-1="" (figura="" 4="" g).="" nel="" periodo="" postnatale,="" l'immunoreattività="" dvl-1="" è="" dispersa="" nel="" citoplasma="" (tabella="" 1)="" di="" pct="" e="" dct="" (figura="" 4d,e).="" il="" segnale="" si="" trova="" in="" tutte="" le="" strutture="" studiate="" ma="" principalmente="" nel="" citoplasma="" perinucleare.="" l'intensità="" dell'espressione="" dvl-1="" è="" significativamente="" più="" alta="" in="" pct="" rispetto="" a="" dct="" e="" g="" (p="">< 0,01).="" il="" 39-45%="" delle="" cellule="" in="" pct="" e="" dct="" esprime="" dvl-1,="" mentre="" in="" g,="" il="" 21%="" delle="" cellule="" è="" positivo="" (figura="" 4="" g).="" non="" abbiamo="" trovato="" una="" differenza="" significativa="" tra="" la="" percentuale="" di="" cellule="" immunoreattive="" in="">renalestrutture. La percentuale di cellule immunoreattive DVL-1 è rispettivamente del 34% in PCT, 36% in dct e 27% in g (Figura 4g).

Figura 4. Doppia colorazione con immunofluorescenza di inversione (verde), DVL-1 (rosso) e DAPI (blu) nei tessuti renali in via di sviluppo e postnatale (14th-38th GW, 1.5- e {{6) }}tessuti renali di un anno). La colorazione positiva (frecce) è mostrata in ciascuna struttura durante tutte le fasi di sviluppo (a-c) e il periodo postnatale (d, e). Microfoni uniti insieme a strutture di interesse nella corteccia: tubuli contorti prossimali (pct), tubuli contorti distali (dct) e glomeruli (g). La colocalizzazione di inversione/DVL-1 (punta di freccia) è mostrata in microfotografie unite. Le colorazioni di controllo negativo sono mostrate come inserti sull'inversione e DVL-1 (a). Gli eritrociti possono essere visti come cellule fortemente colorate vicino a dct. I dettagli sono mostrati come inserti con ingrandimento maggiore. Ingrandimento ×40, barra della scala 100 µm. La distribuzione cellulare dinamica positiva dell'inversione e DVL-1 nelle strutture renali (pct, dct, g) durante le fasi di sviluppo e postnatale è mostrata nei grafici (f, g). Il grafico (h) mostra l'espressione proteica (numero complessivo di cellule positive nelle strutture) correlata al tempo di sviluppo (regressione lineare) e l'interrelazione dell'inversione a DVL-1 attraverso lo sviluppo e la maturazione (ANOVA a due vie seguita dal test post hoc di Sidak ). I dati sono mostrati come medie ± SD.

La coespressione di inversione e DVL-1 è osservata nel citoplasma del rene g, dct e pct durante lo sviluppo (vedi Figura 4a-c, fusione). Nel periodo postnatale, la coespressione di inversione e DVL-1 caratterizza diversi compartimenti cellulari di cellule tubulari in pct e dct, mentre la coespressione in g è caratterizzata dalla forte prevalenza dell'espressione di inversione (vedi Figura 4d, unisci ). Nei reni postnatali 7-anno, la coespressione di inversione e DVL-1 è osservata nelle cellule tubulari di dct e pct e in g dove l'espressione di inversione prevale leggermente rispetto a DVL-1 (Figura 4e, unisci).

2.2.3. Differenze nell'espressione di -tubulina, inversione e DVL-1 tra diversi stadi di sviluppo renale e reni postnatali

Il numero di cellule -tubulina-positive nella percentuale di tessuto renale fetale era statisticamente significativamente più alto rispetto al 7-tessuto renale dei bambini di un anno (13° (p <{5}}.0{ {11}}1),="" 15="" (p="">< 0.0001)="" e="" 16="" (p="">< 0.00001)="" gw).="" il="" dct="" delle="" prime="" fasi="" fetali="" (13°,="" 15°,="" 16°="" e="" 22°="" gw)="" aveva="" più="" cellule="" positive="" rispetto="" al="" 38°="" gw="" e="" al="" tessuto="" renale="" di="" bambini="" di="" 1.5-anno="" (p=""><0,0001, rispettivamente,="" figura="" 3f).="" quando="" sono="" stati="" confrontati="" diversi="" stadi="" di="" sviluppo,="" abbiamo="" riscontrato="" livelli="" inferiori="" di="" espressione="" di="" inversione="" nel="" pct="" del="" 13°="" (p=""><0,0001), 15°="" (p=""><0,00001), 22°="" (p=""><0,001) e="" 38°="" (p=""><0,0001) gw="" rispetto="" a="">renalefazzolettino del bambino di 1.5-anno. In dct, è stata trovata una minore espressione di inversione statisticamente significativa confrontando il tessuto renale dal 16° GW al 38° GW (p < 0.0001).="" inoltre,="" è="" stata="" osservata="" una="" minore="" espressione="" di="" inversione="" in="" dct="" nel="" tessuto="" renale="" del="" bambino="" di="" 7-anni;="" confrontando="" il="" 13°,="" 15°="" (p="">< 0,001,="" entrambi),="" 16°="" e="" 1.{15}}tessuto="" renale="" di="" un="" anno="" con="" dct="" di="" 7-tessuto="" renale="" di="" un="" anno="" (p="">< 0,00001,="" rispettivamente,="" figura="" 4f).="" il="" segnale="" osservato="" dell'espressione="" dvl-1="" attraverso="" i="" diversi="" stadi="" ha="" rivelato="" che="" pct="" del="" 13="" (p="">< 0,01),="" 15,="" 16="">< 0.001,="" respectively)="" and="" 22nd="" (p="" <="" 0.0001)="" gw="" had="" higher="" expression="" of="" immunoreactive="" cells="" compared="" to="" the="" pct="" of="" 7-year-old="" children="" kidney="" tissue.="" dvl-1="" immune-expression="" in="" dct="" of="" the="" kidney="" from="" 13th="" and="" 15th="" gw="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" 38th="" gw="" tissue="" (p="" <="" 0.0001,="" respectively,="" figure="">

2.2.4. Relazione tra espressioni di -tubulina e inversione di DVL-1 nello sviluppo e nel tessuto renale postnatale

-Le espressioni di tubulina e di inversione sono state confrontate con l'espressione di DVL-1 durante le fasi di sviluppo e nel tessuto renale postnatale. -tubulina aveva un'espressione statisticamente più alta in tutte le fasi osservate, rispetto all'espressione di DVL-1 (p < 0.001,="" figura="" 3g).="" attraverso="" tutte="" le="" fasi="" osservate,="" l'inversione="" ha="" avuto="" un'espressione="" più="" elevata="" rispetto="" a="" dvl-1="" (p=""><0,0001, figura="" 4="">

2.2.5. Confronto della colorazione immunoistochimica con -tubulina, versione e DVL-1- e analisi statistica del tessuto renale alterato patologicamente (MCDK, CNF, FSGS) -tubulina La differenza della colorazione con -tubulina in MCDK, FSGS e CNF era statisticamente significativa in confronto al tessuto renale postnatale sano come gruppo di controllo (p <{7}}.0001, rispettivamente).="" i="" tessuti="" renali="" displastici="" avevano="" un'espressione="" significativamente="" più="" alta="" rispetto="" al="" gruppo="" di="" controllo,="" mentre="" fsgs="" e="" cnf="" hanno="" mostrato="" un'espressione="" di="" -tubulina="" significativamente="" inferiore="" rispetto="" al="" controllo="" sano="" (figura="">

Inversione

L'inversione è espressa nel citoplasma delle cellule epiteliali disorganizzate e nei tubuli di MCDK (Figura 5a). In CNF, l'espressione di inversione caratterizza g e dct, mentre mostra meno intensamente nelle cisti PCT (Figura 5b). In FSGS, l'inversione è fortemente espressa in g e dct ma meno intensamente nelle cisti PCT (Figura 5c). L'espressione spaziale dell'inversione ha mostrato un tasso di colorazione più elevato statisticamente significativo nei tessuti renali sani (Figura 5g) rispetto a MCDK, FSGS e CNF (p <{4}}.0001,>

Figura 5. Doppia colorazione di immunofluorescenza di inversione (verde), DVL-1 (rosso) e DAPI (blu) nei tessuti renali patologici in MCDK (a), CNF (b) e FSGS (c): tubuli (t) , glomeruli (g), cisti PCT (c), l'altezza delle cellule epiteliali PCT (*). La struttura e la co-localizzazione cellulare dell'inversione e DVL-1 (punte di freccia) sono mostrate nelle sezioni unite con i dettagli negli inserti con ingrandimento maggiore. Le colorazioni di controllo negativo sono mostrate come inserti sull'inversione e DVL-1 (a). Ingrandimento ×40, barra della scala 10{{20}} µm. Relazione di -tubulina (d) e inversione (e) con l'espressione DVL-1 in MCDK, FSGS e CNF (ANOVA a due vie seguita dal test post hoc di SIDAK). La differenza nell'altezza delle cellule epiteliali (f) di FSGS, CNF e MCDK rispetto al controllo sano (ANOVA unidirezionale seguito dal test post hoc di Tukey, n=50). La differenza nella percentuale di cellule positive complessive di -tubulina, inversione e DVL-1 in MCDK, CNF e FSGS rispetto al controllo sano (g-i), ANOVA unidirezionale seguita dal test post hoc di Tukey). I dati sono mostrati come medie ± SD. Le differenze significative sono indicate dal valore p (* p < 0,05,="" **="" p="">< 0,01,="" ****="" p="">< 0,0001).="" dvl-1="" dvl-1="" è="" espresso="" in="" modo="" molto="" lieve="" solo="" nei="" tubuli="" disorganizzati="" di="" mcdk,="" mentre="" in="" cnf="" la="" sua="" espressione="" caratterizza="" dct="" e="" g="" (figura="" 5a,="" b).="" in="" fsgs,="" dvl-1="" si="" osserva="" come="" lieve="" reattività="" in="" g,="" dct="" e="" pct="" (figura="" 5c).="" i="" tessuti="" renali="" sani="" colorati="" con="" dvl-1="" hanno="" mostrato="" un="" tasso="" di="" colorazione="" significativamente="" più="" alto="" (figura="" 5="" h)="" in="" contrasto="" con="" mcdk="" e="" fsgs="" (p=""><0,0001, entrambi),="" mentre="" non="" è="" stata="" trovata="" alcuna="" differenza="" significativa="" per="">

2.2.6. Relazione tra le espressioni di -tubulina e inversione a DVL-1 nel tessuto renale patologicamente modificato (MCDK, CNF, FSGS)In MCDK, FSGS e CNF, la -tubulina è colorata in modo significativamente più alto di DVL-1 (p < 0.0001,="" rispettivamente,="" figura="" 5d).="" l'inversione="" è="" risultata="" significativamente="" più="" alta="" rispetto="" a="" dvl-1="" in="" mdck="" (p=""><0,0001) e="" in="" fsgs="" (p=""><0,01, figura="">

2.2.7. Differenze nell'altezza delle cellule epiteliali dei tubuli contorti prossimali tra controllo sano e tessuto renale patologicamente modificato (MCDK, CNF, FSGS)L'altezza delle cellule epiteliali PCT (n {0}} per gruppo) è stata confrontata tra le cellule dei tubuli nei tessuti renali sani e i tessuti renali patologicamente modificati (Figura 5b, c, f). L'altezza media delle cellule epiteliali in HC era 12,91 µm ± 1,847 µm ed era significativamente più alta rispetto a CNF e FSGS (p <{14}}.0001, rispettivamente).="" l'altezza="" media="" delle="" cellule="" in="" pct="" cnf="" era="" 9,011="" µm="" ±="" 1,453="" µm,="" mentre="" in="" fsgs="" era="" 8,114="" µm="" ±="" 0,9248="" µm.="" le="" cellule="" epiteliali="" pct="" di="" mcdk="" non="" hanno="" mostrato="" cambiamenti="" significativi="" nell'altezza="" (12,17="" µm="" ±="" 1,476="" µm)="" rispetto="" a="">

2.2.8. Differenze nella lunghezza delle ciglia primarie tra controllo sano e tessuto renale alterato patologicamente (MCDK, CNF, FSGS)

La lunghezza del ciglio primario (n= 50 per gruppo) è stata confrontata tra HC e tessuti renali patologicamente modificati (Figura 6c). I tessuti renali sani e l'MCDK sono stati colorati con -tubulina per rassicurare la specificità della colorazione del cilio di tubulina (Figura 6a, b). Nei tessuti renali sani, il ciglio primario era lungo 5,065 µm ± 1,229 µm, mentre in MCDK, CNF e FSGS erano significativamente più lunghi (p<0.0005, respectively).="" primary="" cilium="" length="" in="" mcdk="" was="" 9.908="" µm="" ±="" 2.434="" µm,="" in="" cnf="" 13.65="" µm="" ±="" 3.218="" µm,="" while="" in="" fsgs="" was="" significantly="" longer,="" 18.29="" µm="" ±="" 4.717="" µm,="" when="" compared="" to="" hc=""><0.0001) and="" other="" pathological="" kidney="" tissues="" of="" mcdk=""><0.0001) and="" cnf=""><>

Discussione

Lo scopo del nostro studio era di indagare un'espressione immunoistochimica di a-tubulina, inversione e DVL-1 nel fetorenaletessuto e tessuto renale postnatale. Inoltre, volevamo esplorare se l'espressione e il pattern di colorazione di a-tubulina, inversione e DVL-1 sono disturbati in diverse malattie renali rispetto al controllo sano. Vale a dire, nonostante il vasto interesse degli altri ricercatori sul ruolo di a-tubulina, inversione e DVL-1 durante lo sviluppo del rene, la maggior parte degli studi precedenti ha utilizzato animali o modelli sperimentali in vitro. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo studio che ha mostrato espressione e localizzazione di a-tubulina insieme a inversione e DVL-1 nei reni umani fetali e postnatali e che ha esplorato l'espressione delle proteine ​​menzionate nel rene malattie, come MCDK, FSGS e CNF. Abbiamo anche analizzato i cambiamenti nella lunghezza e nell'aspetto delle ciglia mediante microscopia ottica ed elettronica, poiché il nostro studio precedente ha già indicato che i disturbi ciliari possono essere associati alla cistogenesi in FSGF e CNF [19].

Nella via canonica di segnalazione Wnt, il legame dei ligandi Wnt ai recettori recluta Dvl [37]. I processi del MET e la via della polarità cellulare planare durante le prime fasi della morfogenesi renale sono controllati dalla segnalazione Wnt. Mediando la via Wnt, le ciglia primarie controllano la proliferazione cellulare, la differenziazione e la morfogenesi dei tessuti [12] organizzando il citoscheletro cellulare e l'orientamento cellulare, nonché l'allungamento della struttura tubulare [2,38]. Nel nostro studio, -tubulina, inversione e DVL-1 erano tutti presenti nelle strutture renali e tutti colocalizzati non solo durante lo sviluppo del rene fetale ma anche nel tessuto renale da 1.5- e {{9 }}bambini di un anno. Questi risultati sono in accordo con l'attivazione della via di segnalazione Wnt che si è verificata già durante la tubulogenesi [39]. Inoltre, i nostri risultati hanno rivelato che l'espressione di -tubulina e inversione sono reciprocamente correlate a DVL-1 e che mostrano una differenza statisticamente significativa tra i loro modelli di espressione. Ciò è in correlazione con i modelli sperimentali, poiché la mutazione dell'intera famiglia di proteine ​​Dvl nei topi si traduce in una mancanza di processo di gastrulazione, mentre le mutazioni che non includono l'intera famiglia di proteine ​​mostrano difetti nel posizionamento delle ciglia nodali insieme a difetti d'organo [40] . Risultati precedenti hanno suggerito che l'inversione ha un ruolo nella migrazione cellulare in Xenopus pronephros. Poiché quel segmento è correlato all'ansa dei mammiferi di Henle e ai tubuli distali, ciò potrebbe indicare l'importanza dell'inversione durante lo sviluppo del rene anche nell'uomo [41]. In accordo con tale premessa, studi precedenti hanno rivelato che la mutazione del gene di inversione potrebbe causare nefronoftisi di tipo 2, che è mediata da un'espressione anormale di DVL-1 [42]. Nonostante il ruolo del ciglio primario sia controverso nella regolazione della via di segnalazione Wnt, abbiamo scoperto che -tubulina si colocalizzava con inversione e DVL-1 nei campioni renali analizzati. Inoltre, studi precedenti hanno evidenziato che il ciglio primario insieme all'inversione regola la degradazione di Dvl influenzando la via di segnalazione Wnt [43]. Nelle malattie renali umane associate allo sviluppo di cisti, sono state osservate localizzazione e funzione anormali delle ciglia primarie [19]. Allo stesso modo, il presente studio ha anche confermato i cambiamenti morfologici della formazione di ciglia primarie in condizioni patologiche come CNF, FSGS e MCDK. Risultati precedenti hanno riconosciuto che l'eccessiva attivazione della via canonica Wnt in seguito a danno renale porta a cambiamenti strutturali irreversibili del tessuto renale [44]. Al contrario, al ciglio primario è stato assegnato il ruolo di passare dal percorso Wnt canonico a quello non canonico nell'assistenzarenaleriparazione. Inoltre, è stato riscontrato che l'eccessiva attivazione della via canonica Wnt nel tessuto renale trapiantato ha un valore predittivo positivo nei confronti della fibrosi renale [45]. Se il percorso canonico Wnt prevale a scapito di quello non canonico, supporta la teoria della fibrosi renale come risultato. I nostri risultati sull'espressione ridotta della tubulina e dell'inversione in CNF e FSGS implicano l'inattività del percorso Wnt non canonico, soprattutto perché entrambe le condizioni tendono a portare allo stadio terminalemalattia renale.Vale a dire, si ritiene che la normale localizzazione e funzione del ciglio primario possa essere un fattore nel mantenimento di un percorso Wnt regolare e, quindi, un prerequisito per il normale sviluppo. Al contrario, se la via Wnt è potenziata, può provocare una proliferazione e differenziazione cellulare disregolata che porta alla cancerogenesi [46]. Come precedentemente descritto, il percorso canonico Wnt è obbligatorio per l'inizio del MET e la formazione del nefrone, mentre il suo disturbo potrebbe portare arenaleipoplasia [47]. I nostri risultati supportano questa idea rivelando l'espressione più bassa di DVL-1 con la più alta espressione di -tubulina in MCDK rispetto al controllo sano. Questi risultati possono implicare l'attivazione più bassa della via canonica Wnt, che potrebbe essere una causa alla base dell'assenza di formazione di nefroni. Al contrario, l'espressione più alta di tubulina con l'espressione DVL-1 più bassa potrebbe spiegare i risultati di più cisti poiché non vi è allungamento organizzato e polarizzazione cellulare guidati dal percorso Wnt non canonico. Studi precedenti avevano anche dimostrato che l'inversione inibisce la via di segnalazione canonica Wnt prendendo di mira Dvl per la degradazione [26]. Questo passaggio nella loro interazione è risultato necessario per inibire la segnalazione canonica di Wnt nel mantenimento del normale allungamento e posizionamento del tubolare. La mutazione di inversione provoca una sovraregolazione della segnalazione canonica di Wnt, che successivamente ha provocato una proliferazione anormale nelle cellule tubulari. Questo passaggio si è dimostrato cruciale nella cistogenesi [42], mentre il knockout dell'inversione nei topi porta alla malattia del rene policistico [48]. Secondo la teoria delrenalecistogenesi, l'inversione è considerata una "micoproteina", a causa della sua localizzazione nelle ciglia primarierenalecellule tubulari. Nel nostro studio, le ciglia primarie erano presenti sulla superficie cellulare apicale delle cellule tubulari in tutte le fasi analizzate, mentre durante le fasi fetali l'espressione di -tubulina era più forte rispetto al periodo postnatale.

CISTANCHE MIGLIORA IL DOLORE RENALE/RENALE

Precedenti studi hanno dimostrato che la funzione primaria delle ciglia può essere influenzata dalla disregolazione della -tubulina durante lo sviluppo, che può portare a cistogenesi, sviluppo renale anormale e possibile malattia renale cronica durante l'infanzia [31,49]. Ciò è in accordo con i nostri risultati sulle ciglia primarie accorciate e dismorfiche osservate in MCDK o con ciglia multiple ed estremamente allungate o dislocate trovate nei tubuli dilatati di CNF e FSGS rispetto al controllo sano. Per supportare il fatto che le vie di segnalazione Wnt, canoniche e non canoniche, regolate dalle ciglia primarie, sono considerate obbligatorie per il normale sviluppo del rene, abbiamo riscontrato una colorazione significativamente inferiore di inversione e DVL-1 in MCDK rispetto al controllo sano [31,49]. Diverse dinamiche del pattern di espressione di -tubulina, inversione e DVL-1 durante le diverse fasi di sviluppo del rene possono indicare il passaggio tra la via di segnalazione Wnt canonica e non canonica durante la normale morfogenesi renale. Suggeriamo che il loro interscambio determini la trascrizione nella via canonica o nell'ordine di migrazione cellulare e polarizzazione durante lo sviluppo del rene in una via di segnalazione non canonica. Il loro equilibrio e la loro espressione in tutte le strutture renali studiate implicano il loro ruolo importante nel normale sviluppo del rene. Durante il normale sviluppo renale (dal 13° GW al 38° GW), l'espressione complessiva di -tubulina, inversione e DVL-1 diminuisce man mano che il tessuto renale acquisisce una morfologia matura. Nei tessuti renali di 1.5- e 7-anno, -tubulina e inversione hanno mostrato un leggero aumento dell'espressione che supporta il fatto che il percorso non canonico Wnt rimane attivo dopo la nascita. Al contrario, DVL-1 persiste con un modello di espressione ridotto, cosa che potrebbe aggiungere a una conclusione che il percorso canonico Wnt è silenziato nel tessuto renale sano. Come risultato di condizioni renali patologiche, le cellule epiteliali del rene potrebbero reagire con la ricomparsa di EMT e fibrosi [50] associate alla riattivazione della via canonica Wnt [44]. Pertanto, i disturbi di -tubulina, inversione e DVL-1 riscontrati nei reni malati potrebbero essere il meccanismo patologico sottostante e il risultato del passaggio dalla via non canonica a quella canonica Wnt nel rene in via di sviluppo, alludendo al passaggio da rene reversibile a rene irreversibile danno. Inoltre, cambiamenti nella loro prenatale e postnatalerenaleil pattern di espressione potrebbe essere associato a una compromissione della funzione renale nell'età adulta, portando a malattie congenite e insufficienza renale cronica.

4. Materiali e metodi

4.1. Campioni umani

Campioni di tessuto renale fetale sono stati raccolti dopo l'interruzione della gravidanza al 14°, 15°, 16°, 22° e 38° GW presso il Dipartimento di Ginecologia e Ostetricia dell'University Hospital Center di Spalato. Tutto il materiale fetale acquisito è stato esaminato da un patologo e per lo studio sono stati utilizzati solo tessuti senza segni di anomalie, macerazioni o morte intrauterina e con cariogramma normale. Le cartelle cliniche delle madri sono state esaminate prima della raccolta del campione e in caso di problemi di salute che potrebbero influenzare l'esito della gravidanza, i tessuti renali sono stati esclusi dallo studio. La maturità è stata determinata dalla circonferenza cranica, dalla circonferenza addominale e dalla lunghezza del femore [51] in correlazione con i calendari mestruali delle pazienti. Campioni di tessuto renale di 1.5- e 7-anno sono stati raccolti dopo decessi accidentali. I campioni sono stati ottenuti presso il Dipartimento di Patologia del Centro Ospedaliero Universitario di Spalato. I campioni dei tessuti renali displastici multicistici (MCDK) sono stati ottenuti dopo la perdita di gravidanza, la glomerulosclerosi focale segmentale (FSGS) e la sindrome nefrosica di tipo finlandese (CNF) a causa della nefrectomia. Tutto il materiale acquisito è stato esaminato e valutato da un patologo, che ha classificato le diagnosi. Il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico della Scuola di Medicina dell'Università di Spalato (20 maggio 2016) in conformità con la Dichiarazione di Helsinki e i suoi aggiornamenti (classificazione n.: 003-08/16-03/0001, registro n.: 2181-198-03-04-16-0024, 20 maggio 2016) [52].

4.2. Immunoistochimica

La fissazione del campione di tessuto raccolto è stata elaborata con paraformaldeide al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 24 ore a 22°C. Dopo la disidratazione in etanolo al 100%, i campioni sono stati incorporati in paraffina, come descritto in precedenza [53]. I campioni sono stati tagliati in sezioni spesse 5 µm utilizzando un microtomo e successivamente montati su vetrini da microscopio. Per verificare la conservazione dei tessuti, ogni 10 sezioni è stata colorata con ematossilina ed eosina [54]. La departfemminizzazione e l'immunoistochimica sono state eseguite come descritto in precedenza [2,55,56]. Dopo il risciacquo in PBS, i vetrini per microscopio sono stati incubati durante la notte con anticorpi primari in una camera umida a 22 ◦C (sistema di colorazione dei vetrini StainTray; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Gli anticorpi primari utilizzati erano l'anticorpo monoclonale di coniglio anti-tubulina alfa (diluizione 1:1000; ab179484, Abcam, Cambridge, Regno Unito), l'anticorpo anti-inversione policlonale di coniglio (diluizione 1:100; ab65187, Abcam, Cambridge, Regno Unito), il DVL monoclonale di topo -1 anticorpo (diluizione 1:150; sc-8025, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) e anticorpo policlonale anti-gamma tubulina di coniglio (per verificare la colorazione primaria specifica delle ciglia con alfa- tubulina, diluizione 1:500; ab11321, Abcam, Cambridge, Regno Unito). Dopo il risciacquo in PBS, gli anticorpi secondari sono stati somministrati per un'ora come elencato: donkey anti-rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 (diluizione 1:400; ab150073, Abcam, Cambridge, UK) e capra anti-mouse IgG H&L, TRITC (diluizione 1:400; ab6786, Abcam, Cambridge, Regno Unito) 4',{43}}diamidino-2-fenilindolo dicloridrato (DAPI) è stato utilizzato per la colorazione dei nuclei e dopo un 2-min incubazione, i vetrini sono stati lavati in PBS e ricoperti con mezzo di montaggio e coprioggetti. La colorazione aspecifica è stata prevenuta utilizzando il blocco proteico (ab64226; Abcam, Cambridge, Regno Unito) prima dell'applicazione dell'anticorpo primario. Come controllo negativo è stato condotto un test di preadsorbimento, mentre la specificità degli anticorpi secondari è stata verificata omettendo gli anticorpi primari dalle procedure di colorazione.

4.3. Microscopio elettronico

Fissazione direnei tessuti sono stati eseguiti in paraformaldeide al 4% per 24 ore, seguita da post-fissazione in tetrossido di osmio all'1% per 1 ora. Il processo di disidratazione è stato eseguito con serie di etanolo e terminato con l'incorporamento in resina LX 112 [22]. Sezioni sottili di un micrometro sono state colorate con blu di toluidina e studiate per selezionare sezioni ultrasottili. Sezioni ultrasottili con uno spessore di 0,05 micrometri sono state esaminate dopo la colorazione con acetato di uranile e citrato di piombo. Per ottenere le microfotografie è stato utilizzato il microscopio JEOL 1200 EX.

4.4. Analisi genetica

Come precedentemente descritto [19], utilizzando i leucociti dal sangue periferico, è stato estratto il DNA genomico. È stata trovata una mutazione omozigote missenso nel gene NPHS1 (c.1096A > C; p.Ser366Arg) che ha confermato la diagnosi di sindrome nefrosica congenita di tipo finlandese (CNF) [57].

CISTANCHE MIGLIORERA' L'INFEZIONE RENALE/RENALE

4.5. Analisi dei dati

L'analisi della sezione è stata eseguita su un microscopio a fluorescenza FL utilizzando 3 canali di fluorescenza FL (Olympus BX51, Tokyo, Giappone). Le immagini sono state catturate dalla fotocamera digitale DP71 (Olympus, Tokyo, Giappone) con ingrandimento ad alta potenza (×40). Solo ilrenalecortex contenente tubuli contorti prossimali (pct), tubuli contorti distali (dct) e glomeruli (g) erano di interesse. Le immagini sono state quindi elaborate dal software ImageJ (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA, https://imagej.nih.gov/ij/ (accesso il 15 ottobre 2018), 1997–2021. ) e Adobe Photoshop (Adobe Inc., San Jose, California, USA) per un'ulteriore valutazione. Prima del conteggio delle celle, è stato utilizzato lo strumento ImageJ dei canali divisi. Successivamente, la foto microscopica dell'immunofluorescenza originale è stata sottratta dal canale rosso o verde (a seconda di quale fosse il canale originale) utilizzando lo strumento ImageJ del calcolatore di immagini per prevenire la dispersione del segnale. I valori al di sotto del livello di soglia 50 sono stati considerati negativi. Abbiamo contato segnali immunoreattivi in ​​cellule di almeno 20 strutture (pct, dct o g) per stadio o numero complessivamente positivo di cellule per micro foto di displastico multicisticorenetessuto, FSGS e CNF. Abbiamo classificato le cellule come positive se il segnale di immunofluorescenza si è accumulato a qualsiasi livello della membrana, del citoplasma o del nucleo al di sopra del valore 50 misurato sul software ImageJ utilizzando il comando di soglia. Le cellule negative sono state classificate come cellule con assenza di immunoreattività. Due ricercatori indipendenti hanno analizzato i dati.

4.6. Analisi semiquantitativa

L'intensità del segnale di colorazione -tubulina, inversione e DVL-1 è stata valutata da due ricercatori indipendenti utilizzando il software ImageJ. L'intensità complessiva del segnale è stata misurata dopo che l'immagine è stata impostata nel 8-tipo di bit; in seguito, l'intensità della colorazione del marcatore è stata valutata nel 20 PCT, dct e g misurando l'area delineata della struttura. Se i risultati tra i valutatori erano diversi, un terzo ricercatore indipendente ha chiarito il dubbio. L'intensità massima del segnale per -tubulina era 84,125 ± 3,214 SD, per l'inversione era 71,50 ± 2,715 SD e per DVL-1 80.916 ± 1,875 SD. La saturazione più alta del colore del segnale sulle fotografie del microscopio è stata contrassegnata come 3 (66,66–99,99 percento dell'intensità complessiva dell'immagine del segnale), seguita da 2 (33,33–66,66 percento) per l'intensità intermedia del segnale e 1 (0,33 percento –33,33 percento) per bassa intensità del segnale (Tabella 1.).

4.7. Analisi statistica

Per la determinazione delle differenze tra stadi e strutture, è stato eseguito il test di Kruskal–Wallis, seguito dal post hoc di Dunn utilizzando il software GraphPad Prism (Graphpad Software Inc., San Diego California, USA, www.graphpad.com (accesso il 15 ottobre 2018.)). Il numero di cellule positive è stato espresso in percentuale come valore medio ± deviazione standard (SD), mentre la significatività statistica è stata riconosciuta a p < 0,05.="" il="" numero="" di="" strutture="" analizzate="" era="" 4200="" in="" 35="" campioni,="" con="" un="" numero="" complessivo="" di="" 135.256="" cellule="" contate.="" abbiamo="" utilizzato="" 2-way="" anova="" con="" il="" test="" post="" hoc="" di="" sidak="" per="" testare="" le="" differenze="" nell'espressione="" di="" -tubulina,="" inversione="" e="" dvl-1="" in="" diversi="" stadi="" di="" sviluppo.="" per="" studiare="" l'espressione="" proteica="" relativa="" al="" tempo="" di="" sviluppo,="" abbiamo="" utilizzato="" la="" regressione="" lineare.="" l'anova="" unidirezionale="" seguita="" dal="" test="" post="" hoc="" di="" tukey="" è="" stata="" utilizzata="" per="" esplorare="" le="" differenze="" nell'espressione="" di="" -tubulina,="" inversione="" e="" dvl-1="" in="" soggetti="">renetessuto rispetto ai tessuti di MCDK, FSGS e CNF. Le differenze nell'espressione delle proteine ​​tra MCDK, FSGS e CNF sono state studiate con 2-way ANOVA seguito dal test post hoc di Sidak. L'ANOVA unidirezionale seguita dal test post hoc di Tukey è stata utilizzata per valutare le differenze nella lunghezza delle ciglia e nell'altezza delle cellule epiteliali del PCT tra controllo sano e patologicorenetessuti. I dati sono stati mostrati come valore medio ± deviazione standard (DS) con differenza statistica riconosciuta a p <>