L'inibitore della farnesiltransferasi LNK-754 attenua la distrofia assonale e riduce la patologia amiloide nei topi Parte 2

Imaging dal vivo dei neuroni

Per gli esperimenti di imaging dal vivo, i neuroni sono stati preparati come sopra e placcati in piastre con fondo di vetro da 35 mm (MatTek # P35G-1.5-14C) per 7 giorni in coltura. LNK-754 10nM o lonafarnib è stato quindi aggiunto ai terreni condizionati, le colture di controllo sono state trattate con DMSO come veicolo. Dopo 48 ore di trattamento, i mezzi sono stati sostituiti con mezzi condizionati provenienti da piastre parallele di neuroni non trattate. 25nM di LysoTracker-Green DND-26 (#L7526, Invitrogen) sono stati aggiunti al terreno condizionato e i neuroni sono stati incubati per 30 minuti a 37 gradi.

I neuroni sono una parte importante del sistema nervoso, in grado di ricevere, elaborare e trasmettere informazioni e costituiscono la base materiale dell’intelligenza e del comportamento umano. L’immunità è una garanzia importante affinché il corpo umano possa resistere alle malattie. Può identificare e distruggere agenti patogeni e cellule anormali e mantenere la salute del corpo.

La ricerca mostra che esiste una forte connessione tra i neuroni e il sistema immunitario. I neuroni possono influenzare il sistema immunitario rilasciando una varietà di neurotrasmettitori, come norepinefrina, epinefrina, ecc. Questi neurotrasmettitori possono modificare l'attività delle cellule immunitarie, migliorare la proliferazione e la funzione delle cellule immunitarie e migliorare l'immunità del corpo. Allo stesso tempo, il sistema immunitario può anche influenzare la funzione dei neuroni attraverso vari percorsi. Le cellule immunitarie possono secernere una varietà di citochine e ormoni, influenzando la crescita, lo sviluppo e la funzione dei neuroni attraverso le vie immunitarie.

Inoltre, fattori psicologici e sociali possono influenzare l’immunità e la funzione neuronale. Emozioni negative come stress, ansia e depressione possono influenzare negativamente il sistema immunitario e i neuroni, riducendo l’immunità del corpo. Emozioni positive, relazioni sociali positive e uno stile di vita sano possono promuovere il sano sviluppo del sistema immunitario e dei neuroni.

Per riassumere, esiste una relazione interattiva e di reciproco sostegno tra neuroni e sistema immunitario. Mantenere la salute mentale, affrontare la vita in modo positivo e adottare buone abitudini di vita può favorire l’immunità del corpo e il sano sviluppo dei neuroni. Si può vedere che dobbiamo migliorare la nostra memoria. La Cistanche deserticola può migliorare significativamente la memoria, perché la Cistanche deserticola può anche regolare l'equilibrio dei neurotrasmettitori, come aumentare i livelli di acetilcolina e fattori di crescita. Queste sostanze sono molto importanti per la memoria e l'apprendimento. Inoltre, la carne può anche migliorare il flusso sanguigno e promuovere l’apporto di ossigeno, il che può garantire che il cervello riceva nutrienti ed energia sufficienti, migliorando così la vitalità e la resistenza del cervello.

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L'imaging time-lapse dei neuroni è stato eseguito utilizzando un microscopio a campo ampio Ti2. L'imaging è iniziato immediatamente a 30 minuti e è continuato per non più di 30 minuti. Sono state effettuate 1- esposizioni ogni minuto e sono state acquisite 20-30 aree separate per piatto entro 30 minuti. Le quantificazioni della distanza e della velocità delle particelle LysoTracker e le analisi del chimografo sono state eseguite utilizzando il software NIS Elements e descritte in dettaglio di seguito. In esperimenti separati, 1μM Lysosensor-Green DND-189 (#L7535, Invitrogen) è stato aggiunto a mezzi condizionati e le immagini catturate di neuroni vivi sono state scattate per non più di 15 minuti utilizzando un microscopio confocale Nikon A1 con un obiettivo 60X (NA 1.4) e il software NIS Elements.

Imaging dal vivo dei tessuti cerebrali

Ai topi 5XFAD di {{0}} mesi di età sono state iniettate ip ogni giorno per 3 settimane e al completamento del trattamento, i topi sono stati anestetizzati e perfusi con una soluzione contenente 1M KCl, 1M MgCl2, 0.1 mM chinurenato , 0,01 mM di acido DL-2-ammino-5-fosfonopentanoico, 5 mM di glutatione, 25 mM di glucosio, 125 mM di NaCl, 1,4 mM di NaH2PO4 e 25 mM di NaHCO3.

I cervelli sono stati quindi rapidamente sezionati in ACSF ossigenato ghiacciato contenente 2,5 mM di KCl, 85 mM di NaCl, 1,25 mM di NaH2PO4, 25 mM di NaHCO3, {{10}}.5 mM di CaCl2, 4 mM di 4 MgCl2, 75 mM di saccarosio, 25 mM di glucosio, 50uM C6H7NaO6, 0.1 mM chinurenato, 0.01 mM DL-2-Amino-5-acido fosfonopentanoico e 5 mM glutatione. Fette coronali da 300 μm sono state ottenute utilizzando un microtomo vibrante Compresstome VF-200 (Precision Instruments) e lasciate riposare per 30 minuti per il recupero a 32 gradi in una soluzione ACSF ossigenata contenente i seguenti 2,5 mM KCl, 85 mM NaCl, 1,25 mM NaH2PO4, NaHCO3 25 mM, CaCl2 0,5 mM, 4 MgCl2 4 mM, saccarosio 75 mM, glucosio 25 mM, C6H7NaO6 50 mM, chinurenato 0,1 mM, DL2-amino-5-acido fosfonopentanoico 0,01 mM e glutatione 5 mM.

Le fette sono state quindi trasferite su piastre con fondo in vetro da 35 mm (MatTek # P35G-1.5-14C) contenenti ACSF ossigenato con LysoTracker-Green 25nM e una diluizione 1:10,000 di 1 mg/ mL Tiazine Red (#S570435, Sigma Aldrich) che per il resto era identico all'ACSF utilizzato durante il periodo di recupero. La vitalità della fetta è stata confermata utilizzando l'imaging time-lapse dei tessuti. Le fette sono state incubate con LysoTracker-Green e Tiazine Red per 15 minuti a temperatura ambiente e quindi le regioni corticali del cervello sono state immediatamente riprese nella stessa soluzione a 32 gradi su un microscopio confocale Nikon A1 con obiettivo 60X (NA 1.4) e software NIS Elements per non più di 30 minuti.

Estrazione del cervello e immunoblotting

I topi sono stati anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di xilazina (15 mg/kg) e ketamina (100 mg/kg), perfusi con soluzione salina tamponata con fosfato (1XPBS) con fenilmetilsulfonil fluoruro (20 ug/ml), leupeptina (0,5 ug/ml), ortovanadato di sodio (20μM) e ditiotreitolo (0,1 mM), seguiti dalla rimozione del cervello. Tutti i tamponi utilizzati per l'estrazione delle proteine ​​contenevano il cocktail III di inibitori della proteasi (#535140, Millipore) e l'inibitore della fosfatasi Halt (#78420, Thermo Fisher Scientific). I tessuti dell'emisfero cerebrale sono stati pesati e omogeneizzati manualmente utilizzando un omogeneizzatore dounce 1:10 (p/v) in 1XPBS.

Dopo l'omogeneizzazione, i lisati sono stati centrifugati a 20,8{{10}}0 g per 30 minuti a 4 gradi. La frazione solubile (supernatante) è stata rimossa e il pellet è stato risospeso pipettando nel tampone del test di radioimmunoprecipitazione (RIPA) [50 mM Tris, 0,15 M NaCl, 1% ottilfenossipolietossietanolo (IGEPAL), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,1% SDS e 0,5 % desossicolato di sodio a pH8] da incubare in ghiaccio per 30 minuti.

I campioni sono stati sonicati (Misonix XL{{0}}) per 20 secondi su ghiaccio e quindi centrifugati a 20.800 g per 30 minuti a 4 gradi. La frazione solubile nel RIPA (supernatante) è stata rimossa e il pellet è stato risospeso in guanidina 5M (pH 8,0) per l'analisi delle proteine ​​insolubili. Ciascun campione è stato sonicato per 20 secondi sul ghiaccio, ruotato per 1 ora a temperatura ambiente e quindi centrifugato a 20.800 g per 30 minuti a 4 gradi. Per misurare la concentrazione proteica di ciascun campione è stato utilizzato il test dell'acido bicinconinico (BCA) (n. 23225, Thermo Fisher Scientific).

Per i western blot, 20 µg di proteine ​​di ciascun campione sono stati caricati su gel NuPAGE (Invitrogen) al 4–12% e separati utilizzando il tampone MOPS in condizioni ridotte e denaturate. Le proteine ​​sono state trasferite sulla membrana di difluoruro di polivinilidene e sviluppate utilizzando Pierce ECL (chemiluminescenza migliorata; Thermo Fisher Scientific). I segnali sviluppati sono stati visualizzati utilizzando ProteinSimple FCR (FluorChem R) e i successivi segnali chemiluminescenti sono stati quantificati utilizzando il software AlphaView (ProteinSimple). Tutte le macchie sono state analizzate utilizzando lo strumento di correzione del background locale ad eccezione del blot HDJ-2, che è stato analizzato utilizzando lo strumento Background Link insieme alla correzione del background multiregionale (software AlphaView).

UN 42ELISA

Per misurare l'A 42 negli omogenati dell'emisfero cerebrale di topi 5XFAD, è stato utilizzato un test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) disponibile in commercio (Thermo Fisher Scientific, KHB3441) seguendo le istruzioni del produttore per analizzare la guanidina e l'A 42 solubile in PBS negli emiencefali. Per misurare A 42 nel cervello dei topi hAPP/PS1, è stato utilizzato un ELISA disponibile in commercio (h amiloide 42 ELISA ad alta sensibilità, Te Genetics Company, Zurigo, Svizzera). L'ELISA è stata eseguita secondo il protocollo del produttore.

Immunofluorescenza del tessuto cerebrale di topo

Dopo la perfusione, i cervelli sono stati estratti e gli emiencefali sono stati fissati in formalina all'10% seguita da crioconservazione in soluzione di saccarosio al 30% in 1XPBS. È stato utilizzato un microtomo scorrevole congelatore per raccogliere sezioni coronali o sagittali da 30-μm. Le sezioni sono state posizionate in serie in una piastra a pozzetti 12- in una soluzione crioprotettiva (1xPBS, 30% saccarosio e 30% glicole etilenico) e conservate a -20 gradi fino all'uso. La colorazione con immunofluorescenza è stata eseguita lavando prima le sezioni tre volte in 1XTBS e quindi incubando le sezioni in glicina 16 mM in 1XTBS per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo altri 3 lavaggi in 1XTBS, le sezioni sono state bloccate in siero di capra al 5% in Triton X-100 allo 0,25% in 1XTBS per 2 ore a temperatura ambiente.

Le sezioni sono state quindi incubate durante la notte in anticorpi primari in una soluzione di 0,25% Triton X-100, 1% di albumina di siero bovino e 1XTBS a 4 gradi. L'immunocolorazione secondaria è stata quindi eseguita con anticorpi secondari marcati con AlexaFluor di asino a una concentrazione di 1:1000 (Thermo Fisher Scientific). ProLong Gold (#P36934, Thermo Fisher Scientific) è stato utilizzato per montare le sezioni prima di essere riprese su un microscopio a campo ampio Ti2 o su un microscopio confocale a scansione laser Nikon A1 per la quantificazione dell'immagine utilizzando il software Nikon NIS Elements per l'acquisizione.

Tutte le impostazioni di acquisizione sono rimaste le stesse tra i genotipi e tutte le immagini sono state acquisite nello stesso periodo di imaging per i singoli esperimenti (Centro della Northwestern University per la microscopia avanzata e Nikon Imaging Center).

Quantificazione dell'immagine

Cervelli di topo

La quantificazione con immunofluorescenza dell'immunocolorazione del tessuto cerebrale del topo è stata eseguita su 3-5 sezioni per animale, dalle coordinate Bregma di circa −0,94 a −2,55 mm, che sono state riprese utilizzando un obiettivo 10X su un microscopio a campo ampio Ti2. Le analisi di quantificazione, comprese le soglie di dimensione e intensità, sono state eseguite utilizzando il software Nikon NIS-Elements (Nikon Imaging Center della Northwestern University).

A seconda del segnale, sono state impostate le soglie utilizzando lo strumento Analisi generale in base alla dimensione, alla forma e al contrasto dell'oggetto, quindi sono state create maschere binarie per ciascun canale e regione di interesse. La soglia è stata eseguita separatamente su ciascun canale per isolare i segnali di interesse ottimizzando il rapporto segnale/rumore ed eliminando segnali di fondo non specifici. Per il calcolo dell'area coperta da LAMP1, BACE1 o LysoTracker-Green, nonché per le misurazioni dell'intensità della fluorescenza di LAMP1 e Lysosensor nei neuroni primari, le regioni di interesse sono state tracciate manualmente utilizzando NIS-Elements ed è stato creato uno strato binario per ciascuna regione di interesse.

Per calcolare il rapporto tra LAMP1 e A 42, l'area di LAMP1 nei neuriti distrofici è stata normalizzata all'area di A 42 su base individuale e sono stati quantificati i rapporti medi per topo tra i gruppi di trattamento. L'analisi del coefficiente di correlazione di Pearson per BACE1 e LAMP1 è stata eseguita utilizzando NIS-Elements in base alla placca su proiezioni di intensità massima di immagini Z-stack da 30 μm scattate utilizzando un microscopio confocale a scansione laser Nikon A1 con un passo di 1 μm.

Per calcolare il rapporto tra LysoTrackerGreen e Tiazine Red, l'area di LysoTracker-Green nei neuriti distrofici è stata normalizzata rispetto all'area di Tiazine Red su base individuale e il rapporto medio per topo è stato quantificato tra i gruppi di trattamento. Sono state utilizzate quattro sezioni coronali dalle coordinate Bregma da circa −1,70 a −2,55 mm per calcolare l'area o l'intensità di ciascun segnale in ciascuna rispettiva regione del cervello per ciascun topo. L'analisi dell'area coperta dalla placca e della dimensione della placca è stata eseguita utilizzando la media di cinque sezioni per topo dalle coordinate Bregma da circa -0,94 a -2,55 mm. La selezione della sezione, l'acquisizione delle immagini, il tracciamento delle immagini e le quantificazioni sono state eseguite da una persona in cieco rispetto ai gruppi di trattamento e ai genotipi.

Neuroni primari

Per la quantificazione dell'immunocolorazione LAMP1 nei neuroni primari del topo fissi, i somi sono stati tracciati manualmente in base alla morfologia utilizzando NIS-Elements ed è stata creata una maschera binaria per ciascuna regione di interesse e canale. La soglia è stata utilizzata per ottimizzare i segnali LAMP1 e distinguere LAMP1 nei neuriti, inclusi sia i dendriti che gli assoni, isolando i pixel di LAMP1 positivi per i pixel di tubulina.

I segnali LAMP1 del soma cellulare sono stati esclusi dall'area LAMP1 totale per analizzare le vescicole LAMP1 nei neuriti. Per l'analisi della motilità LysoTracker-Green nei neuroni, le immagini sono state quantificate utilizzando NISElements. La velocità e la distanza delle particelle LysoTrackerGreen totali in ciascun fotogramma sono state monitorate utilizzando la funzione di tracciamento automatico del movimento in NIS-Elements. È stata impostata e applicata una soglia a tutti i film in base alle dimensioni e all'intensità della fluorescenza delle particelle LysoTracker-Green per eliminare il rumore di fondo.

Per la generazione del chimografo, l'imaging time-lapse di singoli neuroni è stato eseguito su un microscopio confocale 60X e gli assoni sono stati identificati morfologicamente. La percentuale di frequenza delle particelle che si muovono in direzione anterograda o retrograda, o stazionarie, è stata quantificata dividendo il numero di particelle per ciascun gruppo per il numero totale di particelle. Per le analisi chimografiche, le particelle in movimento sono state definite come aventi una velocità superiore a 0,1μM/sec.

analisi statistica

Il software GraphPad Prism v8 è stato utilizzato per eseguire analisi statistiche, inclusa l'analisi della varianza (ANOVA) con test posthoc quando si confrontavano più di due campioni e test t non accoppiati quando venivano confrontati solo due campioni. I dettagli specifici del test, incluso il numero di repliche, il tipo di test post-hoc e i valori P, sono indicati nelle legende delle figure. Tutte le quantificazioni sono tracciate alla media ± SEM. La significatività è stata raggiunta quando il valore P era inferiore a 0,05, indicato da *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.

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