Risposte favonoidi e fito-ossilipina nelle foglie del melograno (Punica Granatum L.) Parte 1

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Astratto:Il metil jasmonato (MeJA) prodotto nelle piante può mediare la loro risposta agli stress ambientali. È stato anche dimostrato che l'applicazione esogena di MeJA attiva le vie di segnalazione e induce l'accumulo di fitoalessina in molte specie vegetali. Per capire come le piante di melograno rispondono biochimicamente agli stress ambientali, l'analisi dei metaboliti è stata condotta nelle foglie di melograno sottoposte all'applicazione di MeJA e ha rivelato cambiamenti unici nei tannini idrolizzabili, nei flavonoidi e nelle fito-ossilipine. Inoltre, le analisi del trascrittoma e della qPCR in tempo reale di foglie di melograno trattate con mock e MeJA hanno identificato geni metabolici espressi in modo differenziale e fattori di trascrizione che sono potenzialmente coinvolti nel controllo diidrolizzabilevie del tannino, dei flavonoidi e della fito-ossilipina. Caratterizzazione molecolare, biochimica e bioinformatica dell'unicolipossigenasicon un'espressione sostenuta e indotta da MeJA ha mostrato che è in grado di ossidare gli acidi grassi polinsaturi, sebbene non si trovi nel compartimento subcellulare dove sono state prodotte fito-ossilipine non jasmonate (non JA). Questi risultati hanno suggerito collettivamente che mentre l'ampia soppressione di flavonoidi e antociani è almeno parzialmente controllata a livello trascrizionale, la biosintesi indotta di non-JAFito-ossilipineè probabilmente non regolamentato trascrizionalmente. Nel complesso, una migliore comprensione di come le foglie di melograno rispondono agli stress ambientali non solo promuoverà la salute e la produttività delle piante, ma avrà anche un impatto sulla salute umana poiché i frutti prodotti dalle piante di melograno sono una ricca fonte di composti nutrizionali.

Parole chiave:jasmonato di metile.Flavonoide·Antocianina· Acido grasso.Fito-ossilipina·Lipossigenasi

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introduzione

Quando vengono ferite o attaccate da erbivori e agenti patogeni, le piante producono ed emettono metil jasmonato (MeJA), che viene percepito dai tessuti vegetali non feriti e dalle piante vicine per attivare la risposta di difesa (Cheong e Choi 2003). Inoltre, è stato dimostrato che l'applicazione esogena di MeJA a una pianta suscita vie di segnalazione, nonché la produzione di proteine ​​​​correlate alla patogenesi e sostanze chimiche di difesa note come fitoalessine. Le fitoalessine fenoliche, ad esempio flavonoidi e antociani, hanno mostrato un aumento dell'accumulo in risposta al trattamento con MeJA in diverse piante, come Arabidopsis thaliana, uva (Vitis vinifera), banana (Musa acuminate), mela (Malus Domestica) e lampone rosso (Rubus idaeus). )(Pandey et al.2016; Portu et al.2015; De Geyteret al.2012; Shafiq et al.2011; Flo-res e Ruiz del Castillo 2014). La biosintesi di flavonoidi e antociani inizia con la formazione di naringenina calcone da cumaroil CoA e tre molecole di malonil CoA catalizzate dalla calcone sintasi (CHS) e la successiva isomerizzazione della naringenina calcone a naringenina da parte della calcone isomerasi (CHI). La naringenina viene quindi utilizzata per generare gli scheletri principali dei flavonoidi e degli antociani, che vengono ulteriormente modificati con gruppi funzionali glicosilici, metilici, idrossilici e prenilici per dare origine a diverse strutture e funzioni (Tian et al. 2008).

Cistanche può migliorare l'immunità

In addition to phenolic phytoalexins, the production of Phyto-oxylipins upon MeJA induction has also been reported in a few plant species (Deboever et al.2020). Phyto-oxylipins are oxygenated fatty acids and derivatives that play a role in plant growth, development, stress response, and innate immunity(Wasternack and Feussner 2018). The initial step of Phyto-oxylipin biosynthesis involves oxidation of polyunsaturated fatty acids(PUFAs) to fatty acid hydroperoxides (HPOs)by lipoxygenases(LOXs)(Andreou and Feussner 2009). Plant LOXs are grouped into two subfamilies according to their protein sequences; type ILOXs are highly homologous(>75 percento di somiglianza) e non contengono un peptide segnale, mentre i LOX di tipo II possiedono una somiglianza di sequenza complessivamente bassa (<35%)but all="" contain="" a="" chloroplast="" target="" peptide="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" plant="" loxs="" can="" also="" be="" classified="" based="" on="" enzymatic="" activities;9-loxs="" and="" 13-loxs="" target="" the="" c-9="" and="" c-13="" position="" of="" the="" fatty="" acid="" substrate,="" respectively="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" hpos="" generated="" by="" loxs="" can="" be="" further="" transformed="" to="" various="" phyto-oxylipins,="" such="" as="" hydroxy="" fatty="" acids="" by="" reductases,="" keto="" fatty="" acids="" by="" loxs,="" epoxy="" fatty="" acids="" by="" per-oxygenases(pxgs),="" and="" dihydroxy="" fatty="" acids="" by="" loxs="" or="" α-dioxygenase="" α-doxs).="" notably,13-hydroperoxy-linolenic="" acid(an="" hpo)produced="" from="" linolenic="" acid="" by="" 13-lox="" can="" initiate="" a="" series="" of="" reactions="" to="" form="" jasmonic="" acid(ja),="" meja,="" and="" the="" bioactive="" ja-isoleucine="">

Il melograno (Punica granatum L.) è una coltura orticola speciale apprezzata per gli abbondanti composti fenolici nei suoi frutti, come flavonoidi, antociani e tannini idrolizzabili (HT) che sono derivati ​​da un intermedio della via shikimate (Ono et al.2016 ). Finora molti studi si sono concentrati sul ruolo dei fenolici del melograno nell'alleviare lo stress e le malattie negli esseri umani (Wu e Tian 2017). Al contrario, poco si sa sulla funzione dei fenolici e di altri fitochimici nella difesa del melograno da fattori abiotici e biotici (ad es. ferite, agenti patogeni, induzione di MeJA) in foglie e frutti. Due recenti rapporti hanno valutato il trattamento MeJA pre-raccolta sulla qualità post-raccolta dei frutti di melograno (Koushesh Saba e Zarei 2019; Garcia-Pastor et al.2020). Gli antociani totali, i flavonoidi e i composti fenolici dei frutti trattati con MeJA, ma non le foglie, sono stati analizzati collettivamente utilizzando uno spettrofotometro. Uno degli studi ha anche analizzato singoli antociani mediante spettrometria di massa (Garcia-Pastor et al.2020). Tuttavia, non è chiaro come i tessuti delle piante di melograno, foglie o frutti, rispondano agli stress ambientali prima dell'allegagione.

Per iniziare a sezionare le interazioni tra piante di melograno e fattori ambientali, abbiamo studiato la risposta metabolica delle foglie di melograno all'applicazione MeJA esogena utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e la spettrometria di massa tandem con cromatografia liquida-ionizzazione elettrospray (LC-ESI-MS/MS) . Nelle foglie di melograno trattate con MeJA sono state osservate variazioni uniche di HT, flavonoidi e antociani, nonché alterazioni di lipidi, acidi grassi e fito-ossilipine. L'analisi comparativa del trascrittoma, convalidata dall'analisi qPCR in tempo reale, ha rivelato che i geni strutturali e/o regolatori coinvolti nel metabolismo di HT, flavonoidi, antociani e fito-ossilipina erano espressi in modo differenziale nelle foglie di melograno trattate con mock e MeJA. L'unico gene LOX che mostrava un'espressione sovraregolata sostenuta nelle foglie trattate con MeJA è stato sottoposto a un'ulteriore caratterizzazione molecolare, biochimica e filogenetica.

Materiali e metodi

Gli standard di glucosio -glucogallina e pentagalloile sono stati acquistati da Shanghai Yuanye Bio-Technology Co. Ltd (Shanghai, Cina). Le sostanze chimiche utilizzate nel test LOX sono state ottenute dai seguenti fornitori: 3-(dimetilammino)acido benzoico (DMAB)(Adamas Reagent, Co., Ltd., Shanghai, Cina), acido linoleico(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA),3-metil-2-benzotiazolinone (MBTH) ed emoglobina (Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, Cina).

Materiali vegetali I frutti e i semi del melograno (cv. Wonderful) sono stati generosamente forniti dall'Accademia di scienze agrarie e forestali di Panzhihua e identificati dal Dr. Binjie Ge al giardino botanico di Shanghai Chenshan. Un esemplare di voucher (n. CSHO173966) è stato depositato presso l'erbario del giardino botanico di Shanghai Chenshan, Shanghai, Cina. Le piantine di melograno sono state coltivate in una stanza di crescita a temperatura controllata per 6 settimane a 25 gradi e 16 ore di luce/8 ore di buio. Secondo quanto riferito, la concentrazione di MeJA per l'applicazione a spruzzo sui tessuti vegetali varia da 100 a 250 μM （Ku et al.2014; Hickman et al.2017). Diverse concentrazioni di MeJA sono state inizialmente applicate alle foglie di melograno, di cui 200μM MeJA ha portato a una risposta metabolica distinguibile nell'analisi preliminare ed è stato utilizzato per le analisi di metabolita e espressione genica descritte in questo studio. Prima del trattamento MeJA, metà delle piante di melograno è stata spostata in un'altra stanza di crescita con condizioni simili. Mentre le piante in una stanza di crescita sono state spruzzate con 200 μM di MeJA, quelle nell'altra stanza di crescita sono state spruzzate con acqua (ad es. controllo simulato). A 2-h,3-h,6- h,12-h,24-h, 30-h,36-h,48-h e{20}}h dopo il trattamento, parte da3 a 5 piante trattate con mock o MeJA sono state raggruppate, che costituiscono una replica biologica. Sono state raccolte tre repliche biologiche per gli esperimenti di trattamento simulato e MeJA; ogni replicato biologico è stato suddiviso in aliquote per la profilazione dei metaboliti e l'analisi dell'espressione genica.

Analisi del profilo metabolico

Le foglie di melograno sono state liofilizzate, pesate e macinate in una polvere fine usando perline di zirconia in un battitore di perline (Mixer Mill MM 400, Retsch GmbH, Haan, Germania) per gli anni '90 a 30 Hz. Per l'analisi HPLC, il campione di foglie è stato estratto in metanolo al 70% per 60 minuti sotto sonicazione e centrifugato a 13,{6}} rpm per 10 minuti. Il supernatante è stato trasferito in una fiala HPLC, di cui 30μL è stato iniettato su un HPLC a fase inversa (Agilent 1200, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) e analizzato come descritto in precedenza (Wil-son et al.2019). I metaboliti sono stati rilevati mediante assorbimento UV a 254 nm, 280 nm, 320 nm e 360 ​​nm. Sono state costruite curve di calibrazione standard di -glucogallina e pentagalloil glucosio; sono stati utilizzati per convertire le aree dei picchi che corrispondono ai tempi di ritenzione e agli spettri di assorbimento di -glucogallina e pentagalloil glucosio alle rispettive concentrazioni.

For LC-ESI-MS/MS analysis, the homogenized leaf sample(100 mg) was extracted in 1 mL of 70% methanol at 4℃Covernight.On the following day, the methanolic extract was centrifuged at 10,000×g for 10 min and the supernatant was passed through a CNWBOND Carbon-GCB SPE cartridge（ANPEL, Shanghai, China） and a 0.22-μm syringe filter(ANPEL) prior to metabolite analysis. The extract （2 μL） was analyzed using LC-ESI-MS/MS (Shim-pack UFLC, Shimadzu, Kyoto, Japan; QTRAP6500, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)and a reverse phase C1s column(ACQUITY UPLC HSS T3,1.8 βm, 2.1 mm×100 mm, Waters, Milford, MA, USA).Metabolites were eluted using solvents(A)water containing 0.04%acetic acid,and(B)acetonitrile containing0.04% acetic acid at a gradient of 0-11 min,95-5%A;11-12 min,5% A;12-12.1 min,5-95%A;12.1-15min,95%A.The flow rate was maintained at 0.4 mL min-1. Linear ion trap (LIT) and triple quadrupole(QQQ)MS scans were acquired in positive-and negative-ion modes. The turbo spray ion source was operated at 500℃C with an ionization voltage of 5500 V. The ion source gas I, gas I, and curtain gas were set at 55 psi,60 psi, and 25 psi, respectively. The collision gas (nitro-gen) was set at 5 psi. For the MRM analysis, declustering potential (DP)and collision energy(CE) were optimized for each precursor-product ion transition. For metabolite identification, the LC-ESI-MS/MS data were compared with an MS2T library of commercial standards and previously identified compounds published in mass spectral databases (when commercial standards are not available)(Chen et al.2013). Pomegranate metabolites were annotated based on the retention times, accumulate m/z values, and fragmentation patterns that match the MS2T library entries(Chen et al.2013). Metabolite quantification was performed using the MRM method as described by Dresen et al. (Dresen et al.2010). The biological replicates of each treatment (mock or MeJA)were averaged for comparative metabolite analysis. The Variable Importance in Projection(VIP) value was obtained from the Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis(OPLS-DA)model. Metabolites with ILog, FCl>1, and VIP>=1 sono stati considerati significativamente modificati.

Analisi del trascrittoma

L'RNA totale è stato estratto dalle foglie di melograno usando il reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e quantificato usando Nanodrop2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA). L'integrità dei campioni di RNA è stata verificata mediante separazione su gel di agarosio (nessuna degradazione visibile) e determinazione del rapporto OD20/28o (tra 1,8 e 2,2) utilizzando Nanodrop2000. L'arricchimento dell'mRNA dall'RNA totale è stato effettuato utilizzando le sfere magnetiche oligo (dT) (Invitrogen). Le librerie mRNA-Seq sono state costruite utilizzando il kit di preparazione della libreria RNA Truseq (Illumina, San Diego, CA, USA). L'analisi del trascrittoma è stata condotta su Illumina HiSeq4000 e sono stati ottenuti 55-60 milioni di 150- letture paired-end bp (PE150) per ciascuna libreria di campioni. I dati della sequenza grezza sono stati elaborati rimuovendo le sequenze dell'adattatore e short(<50 bp),="" low="" quality=""><30), and="" poly(="">10%)reads using SeqPrep (https://github.com/jstjohn/seqprep)and Sickle (HTTPS: GitHub. com/Joshi/sickle). Over 95% of the cleaned reads were uniquely mapped to the reference pomegranate genome for each sample library using HISAT2(Kim et al.2015) and the mapped reads were assembled using StringTie(Pertea et al.2015). The assembled transcriptome sequences were annotated using NCBI NR(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/). Transcript abundance was determined by the RNA-Seq by Expectation-Maximization(RSEM) method and expressed as Transcripts Per Kilobase Million(TPM)(Li and Dewey 2011). Differential gene expression analysis was performed using DESeq2 (Love et al.2014), with a thresh-old of the log, FCl>1 e valore P aggiustato<>

Analisi qPCR in tempo reale

L'RNA totale è stato estratto da foglie di melograno trattate con mock e MeJA utilizzando il kit per piante pure RNAprep (Tiangen Biotech Co., Ltd., Pechino, Cina). La trascrizione inversa (RT) è stata eseguita utilizzando l'RNA totale e il PrimeScriptTM RT Reagent Kit (Takara Bio Inc., Kusatsu, Japan). La PCR quantitativa (qPCR) è stata eseguita utilizzando il kit TB GreenTM Premix Ex Taq TM (Tli RNaseH Plus) ( Takara) e un sistema StepOnePlus Real-Time PCR (Ther-moFisher Scientific). L'analisi della curva di fusione è stata condotta e ha mostrato un singolo prodotto di amplificazione per ciascuna coppia di primer. Per l'analisi RT-qPCR, sono stati esaminati tre replicati biologici e ciascuno con tre replicati tecnici per campioni trattati con mock e MeJA. L'espressione genica è stata analizzata utilizzando il metodo comparativo C,(△AC) (Livak e Schmittgen 2001) e i livelli di significatività sono stati determinati utilizzando un test t di Student a due code. Le sequenze di primer per l'analisi qPCR in tempo reale e le efficienze di amplificazione delle coppie di primer sono mostrate nella Tabella S1.

Espressione e purificazione di proteine ​​ricombinanti e saggi enzimatici

Il frame di lettura aperto di Pgr025417 (che codifica per un presunto LOX) è stato sintetizzato per un utilizzo ottimale del codone in E. coli (Genewiz, Suzhou, Cina) e clonato in pET28a. Il plasmide ricombinante è stato trasformato in E. coli BL21 (DE3) cellule. Una coltura di 5-mL Luria Bertani (LB) con 50ug mL-Ikanamicina è stata avviata da una singola colonia e incubata per una notte con agitazione a 37°C. La coltura notturna è stata utilizzata per inoculare un 100-mL di terreno LB con 50 ug mL-'kanamicina e lasciato crescere fino a una OD600 di 0,5. L'isopropil{14}}D-tiogalattoside (IPTG) è stato quindi aggiunto a una concentrazione finale di 0,1 mM per l'induzione dell'espressione proteica. Dopo incubazione con agitazione a 16 gradi per 18 ore, le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione. I pellet cellulari sono stati risospesi nel tampone di lisi (50 mM NaH, PO, pH 7,4.300 mM NaCl, 10 mM imidazolo) e omogeneizzati utilizzando un disgregatore cellulare (Constant Systems Ltd, Northants, Regno Unito). Le proteine ​​marcate con i suoi sono state purificate utilizzando Perline Ni-NTA (ThermoFisher Scientific) con il tampone di lavaggio (50 mM NaH, PO, pH 7,4.300 mM NaCl, 25 mM imidazolo) e il tampone di eluizione (50 mM NaH, PO, pH 7,4.300 mM NaCl, 500 mM imidazolo). Le proteine ​​purificate sono state separate su un gel SDS-PAGE al 10 percento per la visualizzazione della purezza delle proteine. La concentrazione delle proteine ​​purificate è stata determinata utilizzando il saggio Bradford (Bradford 1976).

Per il test LOX, l'acido linoleico è stato utilizzato come substrato in un metodo colorimetrico a due fasi con lievi modifiche （Anthon e Barrett 2008）. La miscela di reazione 500-μL, comprendente Na-fosfato 50 mM, pH 6, DMAB 10 mM, acido linoleico 0,5 mM e varie quantità di proteine ​​ricombinanti purificate (1,5 mg mL -), è stato incubato a 25 gradi per 10 minuti. Una seconda soluzione (500 μL) contenente 0,2 mM MBTH e 0,1 mg mL-'emoglobina è stata aggiunta alla miscela di reazione, che è stata incubata per altri 5 minuti. La reazione è stata terminata aggiungendo 500μL 1% (p/v) di sodio lauril solfato. È stato determinato l'assorbimento della luce a 598 nm. Localizzazione subcellulare e analisi filogenetiche Una ricerca del genoma del melograno annotato (Qin et al. 2017) ha identificato 1l LOXs putativi a lunghezza intera (da 786 aa a 970 aa), inclusi Pgr025413, Pgr020032, Pgr025418, Pgr025417, PgrO18982, PgrO18980, PgrO16852(fullO16855 -sequenza di lunghezza in GenBank XP_031395793), Pgr009839, Pgr008562, Pgr025678 e PgrO13780. La localizzazione subcellulare e i siti di scissione dei peptidi segnale per i LOX del melograno sono stati previsti utilizzando TargetP 2.0(//www.cbs.dtu.dk/servi ces/TargetP/)(Almagro Armenteros et al.2019).

Analisi del sito vincolante TF

Per prevedere i siti di legame dei TF, 1000 bp a monte del codone di inizio ATG dei geni target sono stati ottenuti da GenBank e ricercati contro i TF di Eucalyptus Grandis in PlantRegMap (versione 5) (Tian et al.2020). Il valore di soglia per il legame l'identificazione del sito è stata impostata su P Minore o uguale a le-4. L'analisi statistica per la quantificazione del metabolita, il trascrittoma e i dati qPCR in tempo reale è descritta nelle rispettive sezioni.

Risultati

MeJA modula la segnalazione cellulare e le vie metaboliche nelle foglie di melograno

Per comprendere la risposta trascrizionale dell'intero genoma del melograno all'elicitazione di MeJA, i trascrittomi di foglie di melograno alle 2-h,{2}}h,24-h e 72-h dopo MeJA o trattamento simulato (ciascuno con tre repliche biologiche) sono stati analizzati (Fig. S1). Sono stati ottenuti circa 55 milioni di letture di sequenze grezze (2 × 150 bp paired-end) per ciascun trascrittoma con contenuto di GC intorno al 52% e valori Q30 compresi tra il 91,6 e il 95% (Tabella S2). Per tutti i trascrittomi, oltre il 96 percento delle letture della sequenza pulita è stato mappato sul genoma del melograno di riferimento (Qin et al.2017) (Tabella S3). La maggior parte delle trascrizioni assemblate era inferiore a 1000 bp (34,3 percento), 1000 bp— 2000 bp (32,9 percento) o 2000 bp—3000 bp (18,1 percento) (Tabella S4).

To identify pathways that are significantly enriched with differentially expressed genes (DEGs)at the above-mentioned time points, genes that show significantly different expression(log, FCl>1, rettificato P<0.05)between meja-="" and="" mock-treated="" leaves="" were="" compared="" to="" the="" kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes(kegg)database="" (fig.s1).="" application="" of="" meja="" modulated="" the="" expression="" of="" genes="" in="" plant="" hormone="" and="" mitogen-activated="" protein="" kinase="" (mapk)signaling="" pathways="" as="" well="" as="" fatty="" acid="" metabolism="" at="" all="" time="" points,="" with="" the="" only="" exception="" of="" those="" in="" plant="" hormone="" pathways="" at="" 24-h="" (fig.="" s1).="" while="" changes="" in="" aromatic="" amino="" acid="" metabolic="" (including="" the="" shikimate="" pathway)genes="" became="" evident="" at="" 6-h="" after="" meja="" treatment="" (fig.s1b),="" a="" surge="" of="" modified="" expression="" of="" flavonoid="" metabolic="" genes="" was="" observed="" for="" the="" 24-h="" and="" 72-h="" post-meja="" treatment="" leaves="" (figs.="" slc="" and="" s1d).="" shikimate="" and="" ht="" pathway="" genes="" and="" ht="" metabolites="" were="" induced="" in="" meja-treated="" pomegranate="" leave="" as="" revealed="" in="" the="" transcriptome="" and="" kegg="" pathway="" enrichment="" analysis,="" three="" shikimate="" biosynthetic="" path-way="" genes="" showed="" upregulated="" expression="" in="" meja-treated="" leaves="" relative="" to="" mock="" controls="" at="" 6-h,="" including="" 3-deoxy-d-arabinose-heptulosonate-7-phosphate="" synthase="" (dahps),="" 3-dehydrogenate="" synthase(dhs),="" and="" the="" bifunctional="" 3-dehydrogenate="" dehydratase/shikimate="" dehydrogenase="" (dhq/sdh;="" abbreviated="" as="" sdh)(figs.s1b="" and="" la).in="" particular,="" three="" isoforms="" of="" pomegranate="" sdhs="" were="" identified="" and="" showed="" differential="" expression="" in="" the="" transcriptome="" analysis,="" pgr020271,="" pgr019030,="" and="">

Per determinare se i cambiamenti nella quantità di trascrizioni dei geni biosintetici shikimate e HT possono influenzare il livello dei metaboliti derivati ​​da queste vie, i metaboliti fenolici sono stati estratti dalle foglie raccolte alle 24-h, 30-h. 36-h,48-h e 72-h dopo MeJA o un'applicazione simulata e analizzati mediante HPLC (Fig.2). Va notato che questi punti temporali sono stati scelti per tenere conto del tempo necessario per la sintesi proteica e la produzione e l'accumulo di metaboliti dopo i cambiamenti di espressione osservati dei geni biosintetici shikimate e HT a 6- h. I tempi di ritenzione e gli spettri di assorbimento di due metaboliti eluiti a 4,57 min (picco 1) e 24,98 min (picco 2) corrispondevano a quelli degli intermedi della via HT -glucogallina e leghe Penta-glucosio, rispettivamente (Figg. la e 2a). Entrambi i picchi hanno mostrato cambiamenti significativi nelle aree dei picchi integrati in più punti temporali (Fig.2b). In particolare, il picco 1 è aumentato nelle foglie trattate con MeJA rispetto ai controlli fittizi a 30-h, 36-h e 48-h (Fig.2b). È interessante notare che il picco 2 nelle foglie trattate con MeJA è inizialmente diminuito a 24-h, ma successivamente è aumentato a 30-h e 36-h prima di tornare a un livello simile ai controlli fittizi a 48- h e 72-h (Fig.2b). La riduzione della maggior parte dei flavonoidi e degli antociani, nonché l'aumento dei flavoni e dei flavonoli metilati, erano evidenti nelle foglie di melograno trattate con MeJA

To investigate whether exogenous application of MeJA may trigger broad-scale metabolic changes in pomegranate, metabolite profiling analysis was conducted on leaves collected at 72-h after mock- or MeJA treatment using LC-ESI-MS/MS. Metabolite annotation and quantification were performed using an MS/MS spectral tag (MS2T)library and multiple reaction monitoring(MRM), respectively. Of the 658 metabolites that were detected,29 showed increased and 73 exhibited decreased accumulation in MeJA-treated leaves compared to the mock controls (ILog, FCl>1; Tabelle S5 e S6). Per i metaboliti differenzialmente accumulati, si è verificato un arricchimento complessivo dei metaboliti coinvolti nel metabolismo secondario/specializzato delle piante (67 su 102), in particolare dei composti fenolici (63 su 102) (Tabella S6).

Tra i fenolici, nelle foglie trattate con MeJA è stata evidente una riduzione concertata di un'ampia gamma di flavonoidi e antociani (42 dei 73 composti diminuiti) (Fig. 3; Tabella S6). È interessante notare che tre flavoni e flavonoli mono o di-O-metilati, tra cui di-O-metil quercetina, crisoberil O-esosil-O-esoside e 5- O-esoside, sono stati aumentati nelle foglie trattate con MeJA (Fig. 3; Tabella S6). Diversi intermedi delle vie dei flavonoidi e delle antocianine, tra cui luteolina, crisoberillo, diidrokaempferolo, diidroquercetina, diidromiricetina, epicatechina, delfinidina e pelargonidina, erano rilevabili ma non hanno mostrato cambiamenti significativi nelle foglie trattate con MeJA (Fig.3; Tabella S5). I derivati ​​dell'idrossicina-namoile, gli isoflavoni e le cumarine erano tra gli altri fenolici che mostravano un accumulo ridotto all'induzione di MeJA (Tabella S6). Al contrario, due acidi fenolici, acido 2,3-diidrossibenzoico e acido protocatechuico (acido 3,4-diidrossibenzoico) e una cumarina, 6-metil cumarina, sono stati aumentati nelle foglie trattate con MeJA (Tabella S6).

Coerentemente con i flavonoidi e gli antociani in gran parte ridotti nelle foglie di melograno trattate con MeJA, le trascrizioni di due enzimi chiave per la biosintesi dei flavonoidi e degli antociani. CHS(Pgr005566) e CHI (Pgr025966), erano significativamente diminuiti a 6-h e 24-h dopo l'applicazione di MeJA secondo l'analisi del trascrittoma (Fig. 4). L'analisi qPCR in tempo reale è stata eseguita per esaminare l'espressione CHS e CHI con punti temporali aggiuntivi, tra cui 2-h, 3-h, 6-h,12-h,{{ 11}}h,48-h e 72-h (Fig.4). Le trascrizioni CHS sono cadute nelle foglie trattate con MeJA a 3-h e sono rimaste significativamente inferiori rispetto a quelle in finta controlli fino alle 72-h, con la diminuzione maggiore alle 12-h. Al contrario, la riduzione dell'espressione del CHI era significativa solo alle 24-h, 48-h e 72-h post-MeJA (Fig. 4).

Questo articolo è estratto da Planta (2021) 254:89 https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9