Ulteriore valutazione di Salvia Haenkei come strategia innovativa per contrastare il fotoinvecchiamento della pelle e ripristinare l'integrità della barriera

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astratto:La pelle è la barriera essenziale del corpo umano che svolge molteplici funzioni. I fattori endogeni, insieme alle aggressioni esterne, influenzano continuamente l'integrità della pelle, portando a distinti cambiamenti strutturali che influenzano non solo l'aspetto della pelle ma anche le sue varie funzioni fisiologiche. L'alterazione delle funzioni di barriera comporta un aumento del rischio di sviluppare malattie e reazioni collaterali, per cui è evidente l'importanza di mantenere l'integrità della barriera epidermica e di rallentare il processo di invecchiamento cutaneo.crescita del pene cistancheLa Salvia Hankie (SH) è stata recentemente identificata come un potenziale agente anti-senescenza; il suo estratto è in grado di diminuire il livello di cellule senescenti influenzando il rilascio di ll.1a e riducendo la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS). In questo studio, l'estratto di SH è stato testato su una linea cellulare di cheratinociti umani (HaCaT) esposta a fattori di stress legati all'invecchiamento precoce delle cellule come i radicali liberi e la radiazione ultravioletta B. Abbiamo confermato che SH agisce come spazzino di ROS e ha trovato la sua capacità di ripristinare l'integrità della barriera cutanea rafforzando la struttura del citoscheletro, sigillando le giunzioni strette e aumentando il tasso di migrazione delle cellule. Alla luce di questi risultati, questo lavoro diventa rilevante, identificando il fazzoletto di Salvia come un composto utile per il trattamento antietà della pelle nelle prestazioni cliniche.

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introduzione

Una pelle sana e funzionante è essenziale per proteggere la disidratazione e la penetrazione di vari contro il 100 percento, microrganismi, allergeni, irritanti e radiazioni. L'esposizione quotidiana ad agenti estrinseci combinata con alcuni fattori intrinseci, come la genetica, il metabolismo cellulare, l'ormone e i processi metabolici, porta al naturale invecchiamento della pelle [1]. In particolare, il fenomeno dell'invecchiamento cutaneo è fortemente correlato alle radiazioni ultraviolette, all'inquinamento, all'uso ripetitivo dei muscoli e alla gravità [2, 3]. L'invecchiamento cutaneo, quindi, deriva da alterazioni strutturali e fisiologiche cumulative e dalla modulazione progressiva degli strati cutanei [2, 4, 5]. Anche se l'invecchiamento non è considerato una condizione patologica, ma piuttosto un processo biologico e inevitabile, la sua correlazione con una varietà di malattie della pelle è ormai consolidata. Considerando che le malattie cutanee legate all'età più rilevanti sono le malattie degenerative, le neoplasie benigne e maligne, ecc., risulta evidente l'importanza della cura della pelle per il trattamento o la prevenzione di alcuni disturbi cutanei.[6-8]. Al giorno d'oggi, le strategie antietà della pelle agiscono per invertire i segni cutanei ed epidermici dell'invecchiamento foto/cronologico. Sulla base dei loro approcci, possono essere classificati come segue: cure cosmetologiche, agenti topici, procedure invasive, agenti sistemici, prevenzione dei fattori esogeni dell'invecchiamento, correzione dello stile di vita e delle abitudini e medicina preventiva [9]. Esistono due gruppi principali di agenti che possono essere utilizzati come componenti di formulazioni antietà: 1. regolatori cellulari, come retinolo, peptidi e fattori di crescita, che agiscono direttamente sul metabolismo e sulla produzione del collagene; 2. Gli antiossidanti, come vitamine, polifenoli e flavonoidi, sono in grado di ridurre la degradazione del collagene [9].

Prove sostanziali supportano l'idea che l'invecchiamento cutaneo sia principalmente guidato dai ROS, generati durante il metabolismo cellulare ossidativo endogeno [10,11]. È noto che l'accumulo di ROS è responsabile del danno cellulare tra cui la perossidazione lipidica, il danno alle proteine ​​​​di membrana e la mutazione del DNA che portano ad alterazioni strutturali e funzionali della pelle. Nel corso del tempo, le cellule umane sono alla base di un naturale aumento dei livelli di ROS, associato alla parziale perdita delle difese antiossidanti. Questa inevitabile condizione è ulteriormente favorita dall'irradiazione ultravioletta giornaliera (UVR) che induce la sintesi di metalloproteinasi della matrice (MMP) e, di conseguenza, la distruzione del collagene mediata da MMP [12, 13]. Studi in vivo hanno dimostrato la relazione causale tra danno ossidativo mitocondriale, senescenza cellulare e fenotipi dell'invecchiamento [10, 14].

La senescenza cellulare è definita come un arresto stabile della crescita cellulare che si verifica in tutte le cellule umane durante l'invecchiamento [15-17]. Come risultato di eventi stressanti, come la sovraespressione dell'oncogene, la generazione di ROS e il danno al DNA (ad esempio indotto da UVR, in particolare da luce UVB), le cellule possono diventare prematuramente senescenti [18].benefici della salsa cistancheIn questo scenario appare evidente l'importanza di sviluppare strategie innovative in grado di prevenire l'accumulo di cellule senescenti o di ucciderle selettivamente, contrastando così l'invecchiamento ei disturbi associati all'invecchiamento. Recentemente, abbiamo identificato la Salvia hankie(SH), una pianta boliviana ricca di vitamina B e proprietà antiossidanti, come potenziale agente anti-senescenza [18].

L'accumulo di cellule senescenti nel tempo è noto come uno dei più importanti meccanismi attraverso i quali i tessuti subiscono il processo di invecchiamento, che sembra essere innescato principalmente dalla persistenza di un tipico stato infiammatorio. Infatti, nonostante le cellule senescenti non siano in grado di proliferare, possiedono un'elevata attività metabolica e producono efficacemente diverse molecole pro-infiammatorie [19]. Utilizzando un modello di epidermide umana della pelle (EpiSkin), è stato infatti dimostrato che l'estratto di SH diminuisce i livelli di cellule senescenti influenzando il rilascio di ILla e riducendo la generazione di ROS [18].

In condizioni omeostatiche, la pelle è un'efficace barriera che protegge dalle aggressioni esterne e dai fattori endogeni e regola la perdita di liquidi, elettroliti e proteine. Questo importante compito è principalmente attribuito all'epidermide, un epitelio dinamico e altamente stratificato. I due principali costituenti dell'epidermide sono lo strato corneo, lo strato esterno e le giunzioni strette (TJ), giunzioni intercellulari che sigillano i cheratinociti adiacenti nello strato granuloso [20]. Le aderenze cellula-cellula sono necessarie per mantenere l'integrità della barriera epidermica.cistanche tubulosa dosaggio redditQuesta importante funzione è svolta da giunzioni cellula-cellula specializzate: giunzioni aderenti (AJs), desmosomi e giunzioni strette. Queste strutture non solo consentono connessioni fisiche tra le cellule, ma nel complesso organizzano gli elementi citoscheletrici e modulano le vie di segnalazione coinvolte nello sviluppo, nella struttura e nella fisiologia dei tessuti. Recenti studi genetici hanno inaspettatamente rivelato un ruolo non canonico delle proteine ​​giunzionali, mettendo in evidenza l'importanza della diafonia giunzionale, delle interdipendenze e della compensazione per consentire la robustezza del tessuto [21].

Qui abbiamo studiato l'attività di un estratto di Salvia haenkei per comprendere il meccanismo molecolare responsabile dei suoi effetti protettivi sull'invecchiamento cutaneo foto/cronologico. Con questa prospettiva, i cheratinociti umani immortalati spontaneamente (HaCaT) sono stati utilizzati come modello in vitro e il meccanismo d'azione SH è stato analizzato sia in regime basale che in condizioni stressanti indotte dall'irradiazione H202 e/o UVB.

RISULTATI

Profilo sicuro dell'estratto di SH e proprietà antietà Lo stress ossidativo nella pelle gioca un ruolo importante nel processo di invecchiamento e nella patogenesi di diversi disturbi della pelle [22]. Matic et al. già dimostrato l'attività anti-senescenza della Salvia haenkei correlata anche alle sue proprietà scavenging [18]. Questi effetti protettivi potrebbero essere sfruttati per sviluppare un nuovo trattamento riparatore della pelle in grado di preservare l'integrità della barriera. Con l'obiettivo di studiare in profondità le proprietà di SH, è stata prima verificata l'attività dell'estratto sulla vitalità cellulare e la generazione di ROS nel modello cellulare HaCaT.

Cistanche può antietà

Il test di vitalità cellulare è stato eseguito per affrontare i possibili effetti citotossici dell'estratto di Salvia haenkei sui cheratinociti. Le cellule HaCaT sono state trattate con estratto SH （0.01-10 ug/ml） per 24 e 48 ore. La vitalità cellulare è stata valutata mediante il saggio di esclusione del trypan blue. Le figure 1A e 1B mostrano che il trattamento con l'estratto SH non influisce sulla vitalità cellulare, confermando il profilo di sicurezza dell'estratto sulle cellule HaCaT nelle condizioni sperimentali utilizzate.

L'attività dell'estratto di Salvia haenkei sulla generazione di ROS è stata analizzata nelle cellule HaCaT dopo 3-24 ore di trattamento e prima e dopo l'esposizione all'H2O2.

I risultati nella Figura 2A mostrano che SH è in grado di ridurre i livelli basali di ROS all'interno delle cellule, in particolare durante le 3-ore di trattamento. Oltre a un aumento significativo dei livelli di ROS dopo la stimolazione H-Oz (Figura 2C), SH è in grado di prevenire la produzione di ROS. L'estratto di SH (0.01 ug/ml) ha ridotto significativamente (-25 percento) la generazione di ROS indotta dallo stimolo ossidativo (Figura 2B), mostrando un effetto paragonabile a NAC dopo 3 ore di trattamento. 24 ore di trattamento SH sembrano essere ROS più efficaci per contrastare l'incremento, nel ridurre significativamente i livelli di ROS a 1 e 10 ug/ml (Figura 2B). Questi risultati confermano Salvia haenkei

gli effetti antiossidanti, come precedentemente osservato [18], mostrano un effetto antiossidante basale già a partire da trattamenti brevi; l'effetto nella prevenzione dell'aumento indotto dallo stimolo ossidativo è più rilevante per tempi di trattamento più lunghi.

È stato riportato che le radiazioni ultraviolette inducono un aumento dei livelli intracellulari di ROS nella pelle umana causando danni e invecchiamento precoce e altre patologie [23-25]. Pertanto, è stato valutato l'effetto dell'estratto SH sulla produzione di ROS mediata da UVB. Come previsto, i risultati nella Figura 3C mostrano un aumento significativo dei livelli di ROS intracellulari dopo la stimolazione UVB. Il trattamento con SH, che induce una tendenza a ridurre i livelli basali di ROS all'interno delle cellule (Figura 3A), è in grado di prevenire l'aumento indotto dalla stimolazione UVB (Figura 3B). 3 ore di trattamento SH inducono una tendenza a ridurre i livelli di ROS; un trattamento SH più lungo è più efficace nel contrastare lo stress ossidativo, mostrando una diminuzione significativa come riportato nella Figura 3A. Questi dati sottolineano l'attività antiossidante della Salvia haenkei anche nello stress ossidativo mediato dai raggi UVB.

Come accennato, prove crescenti suggeriscono che le cellule senescenti si accumulano nella pelle cronologicamente e fotoinvecchiata, contribuendo ad alterazioni e patologie cutanee legate all'età [26]. L'effetto di Salvia hankie è stato quindi valutato sui marcatori di senescenza p21 e p27 (che prevengono la fosforilazione della proteina del retinoblastoma (Rb) e con attività inibitoria sulla CDK2-ciclina E, rispettivamente [27]) dopo il foto-stress indotto da radiazioni ultraviolette. I risultati nella Figura 4 mostrano che l'irradiazione UVB induce un aumento significativo dei livelli di mRNA di p21 e p27 rispetto al controllo non stimolato.cistanche แอ ม เว ย์Una tendenza simile nella prevenzione dell'aumento si osserva nelle cellule trattate con SH. SH 1 ug/ml induce una significativa riduzione dei livelli di p21 rispetto al controllo stimolato da UVB, mentre le altre concentrazioni inducono una tendenza a ridursi (Figura 4A). I livelli di P27 sono significativamente ridotti dal pretrattamento con SH 0.01,0,1 e 10 ug/ml (Figura 4B).

È inoltre accertato che le cellule senescenti influiscono negativamente sul microambiente secernendo una miscela pro-infiammatoria di chemochine, citochine, ormoni della crescita e proteasi, nota come fenotipo secretorio associato alla senescenza (SASP) [28]. I risultati nella Figura 5 mostrano che la stimolazione UVB induce un aumento significativo dei livelli di mRNA di ILla (A), IL6 (B) e IL18 (C) rispetto al controllo non stimolato. Il pretrattamento con SH presenta una forte attività nel contrastare l'aumento dei livelli di citochine. Come mostrato nella Figura 5A, SH 10 ug/ml ha ridotto significativamente i livelli di ILla; l'aumento di IL6 è significativamente contrastato da SH 0.01,0.1 e 10 ug/ml (Figura 5B) mentre tutte le concentrazioni testate sono in grado di ridurre significativamente i livelli di IL18 (Figura 5C). Mantenimento della barriera cutanea Dati i risultati sopra riportati su una linea cellulare epiteliale, è stato valutato l'effetto dell'estratto di SH su diverse proteine ​​e processi coinvolti nel mantenimento della barriera cutanea e nella riparazione del danno tissutale.

Espressione di Sirtui-1

Diversi studi in vitro hanno riportato che le radiazioni UVB inducono una diminuzione dei livelli di proteina Sirtuinl (SIRT1) dei fibroblasti umani, indicando il coinvolgimento di SIRT1 nel danno mediato dagli UVB [29]. Quindi, l'effetto dell'estratto di Salvia haenkei sull'espressione della proteina Sirtuinl è stato valutato mediante saggio western blot (Figura 6). Come previsto, la stimolazione UVB ha indotto una significativa diminuzione dell'espressione della proteina SIRTI nelle cellule HaCaT. È stata quindi studiata l'attività dell'estratto di SH sui livelli di SIRT1. È interessante notare che i risultati mostrano che 1 ug/ml di estratto di SH, rispetto al controllo, ha indotto un aumento dell'espressione di SIRTl (più il 40 percento) in condizioni basali, indicando un potenziale effetto stimolante sui livelli di SIRT1. Come previsto, la stimolazione UVB induce una significativa riduzione dei livelli di SIRT1. I risultati mostrano che il pretrattamento con 0,01 ug/ml di estratto SH mostra un effetto migliorativo nei livelli di Sirtuin 1, rispetto al controllo trattato con UVB.

Saggio di guarigione delle ferite

I cheratinociti sono i principali costituenti dell'epidermide, fornendo una barriera tra l'organismo e l'ambiente. Pertanto, la loro proliferazione e migrazione svolgono un ruolo chiave nel mantenimento di una barriera efficace e nella guarigione delle ferite a seguito di lesioni [30, 31]. Pertanto, è stato valutato l'effetto di SH sulla migrazione delle cellule HaCaT. Le immagini nella Figura 7A mostrano che il trattamento con SH porta a una riduzione dello spessore del graffio indicando un effetto sulla migrazione delle cellule HaCaT. La Figura 7B riporta la costruzione del kymogramma della velocità di migrazione delle cellule HaCaT; le immagini mostrano un aumento dipendente dalla concentrazione della migrazione cellulare. Il grafico nella Figura 7C indica un aumento significativo della velocità di migrazione cellulare dopo 4-8 ore di trattamento con 0,01 ug/ml di estratto di SH. L'aumento massimo viene raggiunto nell'intervallo di 8-12 ore, in cui la velocità delle celle di velocità di migrazione cellulare è di circa il 165 percento rispetto al controllo. Questi dati, come i risultati ottenuti sulla proliferazione cellulare, indicano che la più bassa concentrazione di estratto di SH è in grado di indurre un aumento della velocità di migrazione cellulare non correlato ad un fenotipo iperproliferativo.

Manutenzione degli incroci stretti

Oltre allo strato corneo, le giunzioni strette (TJ) svolgono un ruolo importante nell'integrità della pelle, fungendo da barriera per l'acqua e i soluti e sono coinvolte nei processi di differenziazione, proliferazione, polarità cellulare e trasduzione del segnale delle cellule. Studi recenti hanno dimostrato che la luce UV altera l'espressione e la localizzazione delle singole proteine ​​della struttura del TJ, che a sua volta interrompe la funzione barriera della pelle [32].

Al fine di valutare l'effetto dell'estratto di Salvia haenkei come possibile agente protettivo contro l'interruzione dei TJ, l'espressione dell'occludina è stata misurata mediante immunocitochimica in seguito all'esposizione ai raggi UVB. Le immagini nelle figure 8A e 8B mostrano che il trattamento con entrambe le concentrazioni di SH induce un aumento dell'espressione della proteina occludina, promuovendo la formazione di giunzioni utili al mantenimento dell'integrità della barriera epidermica. Come previsto, in seguito all'esposizione alle radiazioni UVB, le cellule mostrano un anello di membrana irregolare e non definito (Figura 8A). Il trattamento SH, soprattutto alla concentrazione più alta, preserva la morfologia della membrana mantenendo la struttura paragonabile al controllo non stimolato. L'estratto di SH favorisce il rinforzo della giunzione e previene i danni indotti dall'esposizione ai raggi UVB, mantenendo la funzionalità della barriera cutanea.

Espressione filaggrina

L'effetto dell'estratto di Salvia haenkei sull'espressione della proteina filaggrina (FLG) è stato valutato mediante immunocitochimica. La filaggrina è una proteina strutturale fondamentale nello sviluppo e nel mantenimento della barriera cutanea. I risultati nelle figure 9A e 9B mostrano un aumento dipendente dalla concentrazione dell'espressione della proteina filaggrina dopo il trattamento per 24 ore con l'estratto di SH. Inoltre, l'espressione della proteina F-actina indica una distribuzione regolare delle cellule, a seguito del trattamento con SH, che porta ad una continuità strutturale ben organizzata della barriera epiteliale. Questi dati indicano che SH ha un impatto benefico sulla barriera cutanea, migliorando l'espressione della filaggrina, essenziale per la corretta formazione e funzione della pelle.

Espressione di metalloproteinasi

L'esposizione della pelle alle radiazioni ultraviolette induce alterazioni della matrice extracellulare (ECM) causando rughe, rilassamento cutaneo e rilassamento cutaneo, le principali caratteristiche dell'invecchiamento cutaneo. Le metalloproteinasi della matrice (MMP) sono le principali responsabili della degradazione dei componenti della ECM come collagene, elastina, fibronectina e proteoglicani [33].quanta cistanche prendereUn gran numero di studi sottolinea che l'esposizione della pelle all'irradiazione UV induce una sovraregolazione di diverse MMP, con un impatto sull'aspetto e sulla salute della pelle [34-37].

I risultati nella Figura 10 mostrano che la radiazione UVB aumenta l'espressione dell'mRNA della gelatinasi MMP-2 che degrada i collageni della membrana basale e i collageni strutturali denaturati [38]. Il trattamento con SH è in grado di ridurre significativamente i livelli di mRNA di MMP-2(SH 0.01-0.1-10 ug/ml） indicando l'attività dell'estratto di SH nel mantenimento dell'integrità strutturale del pelle, danneggiata dal foto-stress.

DISCUSSIONE

L'invecchiamento cutaneo è l'effetto cumulativo di fattori intrinseci ed estrinseci che portano a un declino della pelle, inducendo assottigliamento, rigidità e perdita di flessibilità. La pelle è la prima barriera tra l'organismo e l'ambiente, quindi il mantenimento della sua integrità funzionale e anatomica è fondamentale. Oltre ai processi naturali di invecchiamento e alle condizioni legate all'invecchiamento come diabete, menopausa, ecc., i fattori estrinseci possono concorrere ad influenzare la struttura della pelle; in particolare fotodanneggiamento, inquinamento o fattori legati allo stile di vita (fumo, dieta, stress emotivo, ecc.) possono ostacolare la struttura e le funzioni della pelle [39,40]. I cheratinociti sono i principali costituenti dell'epidermide, fornendo la base cellulare per la barriera più esterna; in questo lavoro, la linea cellulare di cheratinociti umani HaCaT è stata esposta a fattori di stress, come i radicali liberi e la radiazione ultravioletta B, al fine di imitare il naturale invecchiamento cutaneo, alterando così la funzione di barriera. La Salvia Hankie è stata recentemente identificata come un potenziale agente anti-senescenza suggerendo la sua possibile applicazione nell'invecchiamento cutaneo e nei disturbi legati all'invecchiamento cutaneo; pertanto, l'effetto di un estratto di questa pianta è stato studiato a fondo sui parametri relativi all'invecchiamento cutaneo, al mantenimento dell'integrità cutanea e alle condizioni fisiologiche. Si ritiene che la produzione di specie reattive dell'ossigeno o di radicali liberi attraverso i normali processi metabolici endogeni o UVR e l'inquinamento contribuiscano ai processi di invecchiamento della pelle. La pelle è vulnerabile a una varietà di reazioni redox e l'equilibrio redox è essenziale per il mantenimento dell'omeostasi cutanea. Basse concentrazioni di ROS esercitano attività fisiologiche, ma livelli aumentati di queste specie sono coinvolti nell'attivazione di vie con conseguente aumento della degradazione del collagene, accumulo di elastina, attivazione di metalloproteasi che degradano la matrice, ecc. [41]. Inoltre, i ROS svolgono un ruolo significativo nei processi patologici tra cui l'invecchiamento, l'infiammazione, le lesioni e la patogenesi di diverse malattie della pelle come la psoriasi e la vitiligine [42]. È interessante notare che l'estratto di Salvia haenkei ha dimostrato di ridurre i livelli di ROS in condizioni basali, condizioni di stress ossidativo e condizioni di stress indotte dall'irradiazione UVB, indicando un potenziale effetto protettivo contro le alterazioni mediate da ROS [22].

A sostegno dell'effetto antietà osservato in precedenza di Salvia fazzoletto, in questo lavoro, abbiamo evidenziato la capacità dell'estratto di SH di ridurre la senescenza nei cheratinociti stimolati dalle radiazioni UVB. I risultati mostrano che SH è in grado di ridurre l'espressione genica dei marcatori di senescenza p21 e p27, che sono stimolati dalla radiazione UVB. È interessante notare che l'estratto di SH mostra un'attività promettente nel ridurre la risposta infiammatoria favorita dal fotodanneggiamento nelle cellule, abbassando la trascrizione delle interleuchine. Inoltre, abbiamo dimostrato in modo interessante che l'estratto di Salvia haenkei induce l'espressione della proteina Sirtuinl non solo dopo lo stress ma anche in condizioni basali, mostrando un'attività promettente nel rallentare i processi di invecchiamento. La famiglia Sirtuin, e in particolare SIRT1, ha dimostrato di svolgere un ruolo nell'invecchiamento-fotoinvecchiamento, in particolare attraverso l'inibizione delle MMP e la successiva degradazione del collagene; numerosi studi hanno sottolineato il suo ruolo protettivo nel fotoinvecchiamento mediato da UVB. Composti naturali come lo juglone (5-idrossi-1,4- naftalendione) hanno dimostrato di riportare SIRT1 a livelli normali dopo il trattamento con UVB, suggerendo che SIRTI potrebbe svolgere un ruolo nella prevenzione della cancerogenesi indotta da UVB [29]. I nostri risultati indicano anche il possibile coinvolgimento delle sirtuine nel processo di riparazione dopo lo stress UVB e il loro ruolo nel mantenimento dell'omeostasi dell'epidermide.

I comuni disturbi infiammatori della pelle, come la dermatite atopica e la psoriasi, nonché i processi di invecchiamento, mostrano una ridotta funzione di barriera e la risposta delle cellule epidermiche all'interruzione della barriera può aggravare, mantenere o addirittura avviare tali condizioni. I risultati di questo lavoro hanno rivelato una forte capacità di SH di ripristinare l'integrità della barriera cutanea attraverso la modulazione di diverse proteine ​​coinvolte in questi processi. In particolare, è stata osservata una stimolazione della trascrizione dell'occludina e della filaggrina indicava un'azione di rinforzo sulle aderenze tra le cellule. La carenza ereditaria e acquisita di filaggrina colpisce la barriera epidermica, alterandone l'organizzazione

filamenti di cheratina del citoscheletro e struttura dell'involucro cornificato della pelle [43]. Inoltre, i difetti nell'espressione di FLG inducono una diminuzione del numero di granuli di cheratoialina, una marcata diminuzione della concentrazione del fattore di idratazione naturale (NMF) e l'alcalinizzazione del pH cutaneo [44]. Inoltre, le alterazioni delle claudine e delle proteine ​​occludine, che appartengono alle proteine ​​delle giunzioni strette (TJs), sono ben descritte riguardo ai processi di invecchiamento. I TJ sono responsabili della sigillatura dello spazio intercellulare tra le cellule epiteliali, per formare una barriera funzionale e sono coinvolti nella proliferazione e differenziazione cellulare [45]. È stato dimostrato che l'estratto di Salvia haenkei migliora l'espressione della filaggrina e preserva la localizzazione dell'occludina sulle membrane cellulari, alterata dalle radiazioni UVB. Un'ulteriore attività dell'estratto di SH nel mantenimento di una pelle sana è stata evidenziata dalla sua capacità di ridurre la trascrizione delle metalloproteinasi 2(MMP{4}}) della matrice, stimolate dai raggi UVB. La sovraregolazione delle MMP facilita l'invecchiamento e le patologie cutanee, degradando collagene ed elastina causando alterazioni della matrice extracellulare (ECM) [33, 38], quindi una riduzione di queste proteinasi è utile nel contesto dell'invecchiamento cutaneo.

Gli effetti positivi del trattamento SH osservati in questo studio sui parametri molecolari cutanei più comuni sono stati confermati anche da un recente studio clinico, condotto su una coorte di cinquanta donne caucasiche di età compresa tra 45 e 60 anni [46]. Salvia Hankie è stata somministrata in una formulazione in crema e diversi parametri, come arrossamento ed elasticità della pelle, profondità delle rughe e potenziale antiossidante, sono stati valutati sia da valutazioni cliniche che strumentali, nonché dall'autovalutazione dei soggetti. I risultati di questo studio rivelano l'efficacia di SH nel migliorare il declino della pelle quando applicato quotidianamente in un contesto di moderato invecchiamento cutaneo. Infatti, dopo 84 giorni di applicazione, la pelle delle donne risultava più elastica e presentava un minor numero di zone arrossate e rughe meno profonde. Inoltre, lo studio dimostra un progressivo aumento della capacità antiossidante della pelle in seguito all'applicazione quotidiana della crema [46].

Come riparo protettivo per il corpo dall'ambiente esterno, la pelle è costantemente esposta a potenziali lesioni, e quindi la guarigione delle ferite è un processo essenziale per la sopravvivenza di tutti gli organismi. Considerando la comprovata capacità di SH nel mantenere una pelle sana e senza imperfezioni, abbiamo ipotizzato che questo estratto potesse aiutare anche a migliorare la rigenerazione cutanea essendo utile nella riparazione delle lesioni cutanee. Pertanto, è stata finalmente presa in considerazione l'attività SH sulla migrazione dei cheratinociti, essendo un passaggio chiave nel ripristino della barriera cutanea dopo le lesioni. Il trattamento con l'estratto di SH ha rivelato un'interessante attività in grado di aumentare la velocità di migrazione di HaCaT, dimostrando un forte effetto sul ristabilimento della lesione epiteliale dopo le lesioni. Poiché la migrazione è un elemento critico nel processo di guarigione della ferita, i nostri dati, considerando anche l'attività non iperproliferativa dell'estratto, indicano un potenziale effetto degli estratti SH nel contrastare più rapidamente l'effetto di una lesione della barriera cutanea, riducendo il rischio di infezioni.

I nostri dati indicano l'estratto di Salvia haenkei come un composto utile sia per favorire il ripristino della barriera sia per smorzare la risposta allo stress epidermico. In concomitanza con il recente studio sull'uomo, questo lavoro fornisce ulteriori approfondimenti sui meccanismi coinvolti nell'effetto positivo dell'estratto sull'invecchiamento cutaneo.

Questo lavoro, a supporto dei precedenti lavori [18, 46], identifica in modo più peculiare il meccanismo molecolare legato all'efficacia della Salvia fazzoletto nella modulazione dei parametri cutanei, sottolineando l'importanza della Salvia fazzoletto come agente appetibile utile per l'anti-età e disturbi della pelle legati all'invecchiamento.

MATERIALI E METODI Coltura cellulare e irradiazione UVB

Le cellule HaCaT (cheratinociti umani immortalati spontaneamente) sono state coltivate in mezzo di Aquila modificato (DMEM) di Dulbecco ad alto contenuto di glucosio integrato con il 10% di siero bovino fetale (Life-Technologies, Waltham, MA, USA), 2 mM di glutammina, 100 U/ml di penicillina e 100 ug/ml di streptomicina (Lonza, Basilea, Svizzera). Le cellule sono state mantenute in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO2 nell'aria e incubate a 37 gradi.

Quando richiesto dal protocollo sperimentale, le cellule sono state esposte a una radiazione UVB di 30 KJ/m², fornita da una lampada PL-S Philips Medical Narrowband UVB. Per prevenire l'assorbimento della luce da parte del mezzo di coltura tissutale, questo è stato rimosso prima dell'irradiazione e sostituito con DMEM FBS e privo di fenolo rosso, seguendo il protocollo di irradiazione [47]. Dopo l'irradiazione UVB, le cellule sono state alimentate con un mezzo di crescita fresco o utilizzate per esperimenti seguendo il protocollo.

Vitalità cellulare-Saggio di esclusione blu di Trypan 35 x10³ cellule sono state piastrate su piastre da 12 pozzetti e, dopo l'incubazione notturna, sono state esposte a diverse concentrazioni di estratto idroetanolico di Salvia haenkei secondo protocolli sperimentali. L'estratto è stato gentilmente fornito da IBSA Farmaceutici Italia (Lodi, Italia) e presenta un contenuto di acido rosmarinico marcatore di 0,6% p/p mediante HPLC. Dopo il trattamento, le cellule sono state lavate, staccate con 0,25% di tripsina-0,2% EDTA e sospese in blu trypan (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) con un rapporto l: I in una soluzione media. Le cellule sono state contate utilizzando un emocitometro a camera di Burker.

Saggio di fluorescenza ROS

Il ROS è stato quantificato utilizzando 2',7'-diclorofluoresceina-diacetato (Hz-DCF-DA, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), come precedentemente descritto [48]. In breve, le cellule (5x10') sono state seminate in 96-piastre a pozzetti, lasciate aderire durante la notte e quindi esposte all'estratto SH per 3 o 24 ore. Come controllo positivo è stata utilizzata N-acetilcisteina 5 mM (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA).

Per la condizione di stress ossidativo, il livello di ROS è stato misurato dopo l'aggiunta di 50 μM Hz-DCF-DA in assenza o presenza di H2Oz [48]. L'intensità della fluorescenza DCF è stata misurata all'eccitazione 485 nm - emissione 535 nm, utilizzando un lettore di piastre multietichetta VICTOR X3 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

Per la valutazione dei livelli di ROS in condizioni di stress UVB, il protocollo è stato leggermente modificato, incubando le cellule nei trattamenti SH - 50 μM di soluzione Hz-DCF-DA in PBS. Dopo 25 minuti di incubazione a 37 gradi, la piastra è stata esposta alle radiazioni UVB e l'intensità della fluorescenza DCF è stata immediatamente misurata all'eccitazione 485 nm - emissione 535 nm, utilizzando un lettore di piastre multietichetta VICTOR X3 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

Microscopia ad immunofluorescenza

10cellule x104 sono state seminate su vetrini coprioggetto prerivestiti con collagene in 24-piastre a pozzetti, lasciate attaccare durante la notte e trattate con estratto SH secondo il protocollo. Per il rilevamento delle proteine ​​-catenina e occludina, le cellule sono state esposte a radiazioni UVB, come descritto nel protocollo sopra. Dopo l'irradiazione, le cellule sono state alimentate con un mezzo di crescita fresco o utilizzate per esperimenti seguendo il protocollo. Per il test di immunofluorescenza, 4 ore dopo l'irradiazione UVB, le cellule sono state lavate, fissate con formaldeide al 4%, permeabilizzate con Triton X{9}} allo 0,1% in PBS e colorate per 1 ora a 37 gradi con diversi anticorpi specifici per le proteine: anti-occludina monoclonale di topo (Invitrogen Life Technologies, Waltham, MA, USA), anti-filaggrina di topo (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Dopo il lavaggio con PBS, le cellule sono state incubate con anticorpi secondari/isotiocianato di fluoresceina (Alexa Fluor 488 anti-mouse o Alexa Fluor 536 anti-rabbit immunoglobulin G, Molecular Probes, Invitrogen Life Technologies, Waltham, MA, USA) e con falloidina per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo 10 minuti di trattamento con RNasi, i vetrini coprioggetto sono stati montati su vetrini utilizzando Mowiol 40-88 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) e aggiunto ioduro di propidio. Le immagini sono state acquisite tramite microscopio confocale LSM 800, ingrandimento 60X, software ZN 2.1 blue Edition (Carl Zeiss, Jena, Germania) e quantificate utilizzando il software ImageJ.

analisi statistica

L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando GraphPad Prism versione 7.02 per Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Salvo diversa indicazione, i risultati sono presentati come media più SEM. È stato utilizzato il test t di Student e i valori p<0.05 were="" considered="" statistically="">

Abbreviazioni

AJ:giunzione aderente; ECM: matrice extracellulare;FLG: filaggrina; Hz-DCF-DA: 2',7'-diclorofluoresceina-diacetato; H2Oz: perossido di idrogeno; MMP: metalloproteinasi della matrice; NAC: N-acetilcisteina; NMF:fattore; ROS: idratante naturale all'ossigeno reattivo

specie; SIRTl: Sirtuinl; SH: fazzoletto di Salvia; TJ: giunzione stretta; UVB: radiazione ultravioletta B.

Questo articolo è stato estratto da www.aging-us.com