Risposta dell'espressione genica del gasteropode non bersaglio Physella Acuta al fenossicarb, un pesticida analogo dell'ormone giovanile

I pesticidi sono un problema ambientale. La ricerca di nuovi metodi di controllo dei parassiti si è concentrata su composti con effetti tossici bassi o nulli negli organismi non bersaglio. Gli analoghi dell'ormone giovanile (JH) interferiscono con il sistema endocrino degli artropodi. Tuttavia, la mancanza di effetti sulle specie non bersaglio richiede conferma. Questo articolo analizza l'impatto del Fenoxycarb, un analogo di JH, su Physella acuta, un gasteropode acquatico. Per 1 settimana, gli animali sono stati esposti a 0.01, 1 e 100 ug/L e l'RNA è stato isolato per analizzare l'espressione genica mediante retrotrascrizione e Real-Time PCR. Sono stati analizzati quaranta geni legati al sistema endocrino, ai meccanismi di riparazione del DNA, ai meccanismi di disintossicazione, allo stress ossidativo, alla risposta allo stress, al sistema nervoso, all'ipossia, al metabolismo energetico, al sistema immunitario e all'apoptosi. Tre dei geni, AchE, HSP17.9 e ApA, hanno mostrato risposte alla presenza di Fenoxycarb a 1 ug/L, senza risposte statisticamente significative nel resto dei geni e alle restanti concentrazioni. Dai risultati si può concludere che il Fenoxycarb mostra una debole risposta a livello molecolare in P. acuta nel tempo e nelle concentrazioni testate. Tuttavia, l’Aplysianina-A, un gene correlato all’immunità, è stato alterato, quindi l’effetto a lungo termine potrebbe essere rilevante. Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche per confermare la sicurezza del Fenoxycarb nelle specie non artropodi a lungo termine.

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Il pesticida Fenoxycarb (IUPAC: ethyl [{{0}}(4-phenoxy-phenoxy)ethyl] carbammato, CAS n. 72490-01-8) è un carbammato utilizzato per controllare vari insetti nocivi in colture e colture ornamentali1. Regola la crescita degli insetti imitando l'ormone giovanile, impedendo all'insetto di raggiungere la maturità2. Tuttavia, è stato osservato anche in altri artropodi 3–5. A livello molecolare, è stato osservato che media l'inibizione della proliferazione cellulare e l'apoptosi negli insetti6 e sovraregola i geni coinvolti nella sintesi degli ormoni giovanili nei ragni5. È considerato non dannoso per i vertebrati e le specie non bersaglio, ma colpisce insetti e altri artropodi5,7–9. È stato segnalato al di sotto del livello di rilevamento (0.0004 mg/l) da 24 a 48 ore dopo l'applicazione aerea agli stagni sperimentali10. Inoltre, è stato considerato che le concentrazioni nominali di 0,20, 0,80, 3,2, 13 e 50 ug/L erano predittive dei livelli ambientali11. Inoltre, il Fenoxycarb è considerato sicuro dal punto di vista ambientale grazie alla sua rapida degradazione10, con un tempo di dissipazione 50 (DT50) di 4,13 giorni nella colonna d'acqua e 15 giorni nel sedimento (database PPDB: http://sitem.herts.ac.uk/aeru /ppdb/en/Reports/304.htm) 1. Ha una bassa spinta verso i terreni adiacenti dai campi in cui viene applicato12, sebbene possa finire nelle acque superficiali a causa della deriva degli spruzzi, del deflusso o del drenaggio13. È stato vietato nell’UE ma è in uso nel Regno Unito, negli Stati Uniti e in Australia. L'Autorità europea per la sicurezza alimentare non ha considerato motivo di preoccupazione nei settori della tossicologia dei mammiferi e della valutazione del rischio per i consumatori l'uso del fenossicarb nelle mele e nelle pere14. Tuttavia, mentre è stato valutato un rischio basso per uccelli e mammiferi, macrorganismi e microrganismi del suolo non bersaglio e piante terrestri non bersaglio, è stato identificato un rischio elevato per gli organismi acquatici con una lacuna di dati sul rischio per gli invertebrati acquatici considerando il rischio modalità d'azione e le fasi di crescita più sensibili14. Sebbene sia considerato a bassa tossicità in caso di esposizione orale, cutanea o per inalazione, è stato proposto di classificarlo come una sostanza chimica con prove limitate di effetto cancerogeno perché può produrre tumori ai polmoni e al fegato nei topi inducendo la proliferazione del perossisoma, un meccanismo meno sensibile negli esseri umani14. Per questo motivo il fenossicarb è etichettato come molto tossico per la vita acquatica e sospettato di provocare il cancro. Nei vertebrati non è stato osservato alcun effetto sulla riproduzione nelle pecore15, ma è stato descritto che in neuroni corticali di ratto esposti per una settimana in coltura, il Fenoxycarb ha ridotto considerevolmente i livelli di ATP, il potenziale della membrana mitocondriale e il consumo di glucosio16. Inoltre, inibisce i recettori dell'acetilcolinesterasi e dell'acetilcolina nicotinica espressi negli ovociti di Xenopus laevis17 nel cervello di ratto. D'altra parte, alcuni rapporti mostrano che può influenzare negativamente la produzione di uova e il tasso di schiusa nei collemboli Yuukianura szeptyckii18, sebbene studi precedenti su Folsomia candida non abbiano mostrato tale effetto. Allo stesso modo, effetti avversi come l'inibizione della muta e la crescita della lunghezza corporea sono stati osservati quando il gamberetto Neocaridina davidi è stato esposto per due settimane a una concentrazione di soli 10 ug/L3, mentre il granchio Rhithropanopeus harrisii ha sperimentato una metamorfosi ritardata a 48 ug/L di Fenossicarb20. Tenendo insieme questi risultati, sono necessari ulteriori studi per conoscere l’impatto di questo pesticida sugli ecosistemi. Mancano informazioni sugli effetti del Fenoxycarb sugli invertebrati d'acqua dolce non artropodi, ma si prevede che sia innocuo per loro. Tuttavia, la scarsità delle conoscenze sulla fisiologia degli invertebrati, soprattutto per quanto riguarda il sistema endocrino, richiede la conferma di questo estremo. Questo lavoro mira a testare la tossicità del Fenoxycarb a livello di trascrizione, nel gasteropode d'acqua dolce Physella acuta (Draparnaud, 1805) esponendo gli animali per 1 settimana e analizzando il profilo di trascrizione ad un array che copre diversi percorsi cellulari rilevanti. La lumaca d'acqua dolce Physella acuta, conosciuta anche come Physa acuta, è una specie ermafrodita e cosmopolita. Vive in laghi e stagni e depone le uova in una massa di uova che richiede circa due settimane per svilupparsi. I giovani nati crescono per due mesi finché non raggiungono lo stadio adulto, si accoppiano e depongono le uova. La specie è facilmente coltivabile in laboratorio, quindi viene utilizzata negli studi di tossicità come rappresentativa dei gasteropodi21,22. Recentemente, abbiamo progettato un array per studiare la risposta alle sostanze tossiche a livello di espressione genica in questa specie23. Comprendeva 34 geni e 4 geni di riferimento. Inoltre, lo abbiamo esteso a 40 geni bersaglio, inclusi alcuni di essi per analizzare le alterazioni a livello di attività trascrizionale in diversi processi cellulari. La sequenza di nove geni viene descritta per la prima volta per questa specie ed estende il numero di geni che possono essere utilizzati come biomarcatori. Le sequenze codificano per proteine ​​legate al sistema endocrino (recettore della galanina di tipo 2 [GalR2], recettore correlato agli estrogeni [ERR], recettore beta del progestinico di membrana [MPR], estradiolo 17-beta-deidrogenasi 8 [Hsd17b8], e recettore dell'acido retinoico [RXR]), riparazione del DNA (poli-ADP-ribosio polimerasi I [PARP1], proteina di riparazione del DNA XRCC3 [XRCC3], potenziatore del gene del fattore nucleare del polipeptide leggero kappa nell'inibitore delle cellule B, alfa [IkBa]) e risposta allo stress (proteina da shock termico 70 B2-come [HSP70 B2]). Nel complesso, la matrice consente l'analisi delle alterazioni nel sistema endocrino, nei meccanismi di disintossicazione, nella riparazione del DNA, nel sistema nervoso, nell'apoptosi, nello stress ossidativo, nello stress, nell'epigenetica, nel sistema immunitario, nel metabolismo energetico e nel trasporto dei lipidi. In questo modo, la matrice mostra cambiamenti nei principali meccanismi coinvolti nella risposta allo stress e alla disintossicazione ma anche la risposta dei processi coinvolti negli effetti a lungo termine, come i meccanismi di modificazione epigenetica e di riparazione del DNA, che si attiverebbero in caso di eventuale effetto genotossico del composto. La sicurezza a livello ambientale è una preoccupazione di tutti i prodotti utilizzati come pesticidi. La ricerca di nuovi pesticidi con un impatto ridotto sulle specie non bersaglio richiede test su queste specie perché alcuni di essi possono avere un impatto basso. Tuttavia, la mancanza di conoscenza sulla fisiologia degli invertebrati richiede un lavoro sperimentale per confermarla. Fornirà inoltre ulteriori informazioni sulla fisiologia degli invertebrati, diminuendo il divario con i vertebrati e favorendo l'uso degli invertebrati come metodi alternativi che riducono l'uso dei vertebrati nei test di tossicità.

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Risultati

Identificazione delle sequenze.

Sono state identificate nove sequenze che codificano per diverse proteine ​​correlate al sistema endocrino (Hsd17b8, ERR, GalR2, MPR e RXR), alla risposta allo stress (HSP70B2) e ai meccanismi di riparazione del DNA (XRCC3, IkBa e PARP1). La dimensione della sequenza e la dimensione dell'ORF sono mostrate nella Tabella 1. Inoltre, vengono mostrate l'identità e la somiglianza a livello di amminoacidi con la proteina indicata. Il confronto del database ha mostrato omologia con proteine ​​di altri molluschi, principalmente gasteropodi, ad eccezione di MPR, che era omologa ad una proteina di origine bivalve. Il grado di omologia era elevato tranne nel caso di GalR2 e MPR, mentre ERR e HSP70 B2 mostravano un'identità superiore al 90%. La Figura 1 mostra lo schema delle proteine ​​con i diversi motivi che le caratterizzano. Tutti mostravano i domini caratteristici associati a quelle proteine, quindi si può concludere che le sequenze isolate corrispondono ai geni che codificano quelle proteine.

Profilo di espressione genica in risposta all'esposizione al Fenoxycarb.

Le lumache adulte sono state esposte a 0.01, 1 e 100 µg/L di Fenoxycarb per sette giorni per valutare la risposta a medio termine dei geni analizzati (Fig. 2, 3, 4, 5 6 , S1 e S2). Il fenoxycarb è un analogo dell'ormone giovanile che non si prevede abbia effetti sui non artropodi. Non è stata riscontrata alcuna risposta statisticamente significativa in quei geni correlati al sistema endocrino (Fig. 2), ai meccanismi di riparazione del DNA (Fig. 3), allo stress ossidativo (Fig. 4), all'apoptosi (Fig. 4), alla fase I (Fig. S1 ), fase II (Fig. S2) e fase III (Fig. S2) della disintossicazione, la maggior parte delle proteine ​​​​dello stress (Fig. 5), ipossia (Fig. 5), regolazione epigenetica (Fig. 6) e metabolismo energetico (Fig. .6). Solo tre geni sono stati modificati a 1 µg/L: acetilcolinesterasi (AChE) (chi quadrato=−16,144, p=0.029; Fig. 4), proteina da shock termico 17,9 (HSP 17,9) (chi quadrato=− 15,553, p=0.039; Fig. 5) e aplysianina A (ApA) (chi quadrato=− 20,333, p=0.002; Fig .6). Pertanto, i due geni analizzati in relazione al sistema nervoso (AChE) e all'immunità (ApA) hanno mostrato alcune alterazioni, suggerendo che potrebbero verificarsi alcuni effetti a medio termine sulla fisiologia di P. acuta, come il comportamento di ricerca del cibo o la suscettibilità alle infezioni batteriche.

Tabella 1. Informazioni sulle sequenze descritte per la prima volta. Sono indicate le dimensioni, l'omologia, l'identità e la somiglianza del DNA e delle proteine. Sono indicati il ​​numero contiguo o il numero di adesione.

Figura 1. HYPERLINK "sps:id::fg1||locator::gr1||MediaObject::0"Struttura e domini conservati delle proteine ​​Physella acuta codificate dalle sequenze identificate. Vengono mostrati i motivi caratteristici di ciascuna proteina. I domini sono stati definiti secondo la classificazione funzionale delle proteine ​​del Conserved Domains Database (CCD). La taglia è indicata dai numeri.

Figura 2. Livelli di trascrizione delle sequenze correlate al sistema endocrino (recettore degli estrogeni [ER], recettore correlato agli estrogeni [EER], recettore beta del progestinico di membrana [MPR], estradiolo 17-beta-deidrogenasi 8 [Hsd17b8], recettore della galanina 2 [GalR2] e il recettore dell'acido retinoico [RXR]) negli adulti acuti di Physella dopo esposizione in vivo a Fenoxycarb per sette giorni a 19 gradi. L'attività trascrizionale è stata quantificata mediante RT-PCR utilizzando la proteina ribosomiale L10 (rpL10), actina (Act), 6-fosfofrutto-2-chinasi/fruttosio-2,6-bifosfatasi 2 (PFKFB2 ) e gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) come geni di riferimento. Il confronto è stato eseguito con i controlli esposti al solvente. Vengono mostrate le scatole dei baffi. Ogni scatola corrisponde a 12 individui. La linea orizzontale all'interno del riquadro indica la mediana, mentre il 25° e il 75° percentile sono indicati dai confini del riquadro. I risultati più alti e più bassi sono rappresentati dai baffi. Il piccolo triangolo all'interno della casella indica la media e vengono mostrati i valori anomali (cerchi). Non sono state osservate differenze significative rispetto al controllo in questi geni (p<0.05).

Discussione

I progressi negli studi tossicologici richiedono l’estensione dei test di tossicità a livelli aggiuntivi oltre gli endpoint tradizionali come la sopravvivenza, la riproduzione o lo sviluppo. Al giorno d'oggi, viene spesso adottato un approccio molecolare per la valutazione della tossicità e richiede ulteriori presunti biomarcatori che valutino la modulazione di diversi processi cellulari e meccanismi fisiologici24-26. In questo senso, l’aggiunta di nuovi geni alla batteria di biomarcatori estende il numero di processi studiati e i livelli di risposta, a seconda del percorso analizzato. Pertanto, la descrizione di nuovi geni rappresenta un passo avanti verso l'estensione del valore di P. acuta negli studi tossicologici. Qui abbiamo descritto nove nuove sequenze che codificano per diversi recettori ormonali, un enzima coinvolto nella regolazione della concentrazione di estrogeni e androgeni attivi (Hsd17b8), una proteina dello stress e tre proteine ​​coinvolte nella riparazione del DNA. Questi geni possono migliorare l’analisi di diversi processi legati all’alterazione endocrina, alla genotossicità e allo sviluppo. Inoltre, tutti possono aiutarci a comprendere la risposta a diversi livelli dell’organizzazione, da quello molecolare a quello ecologico, fornendo approfondimenti sui meccanismi della sostanza tossica e sulle risposte degli organismi per mantenere l’omeostasi di fronte a un ambiente in cambiamento. D’altra parte, questi presunti biomarcatori aprono nuovi modi per valutare la tossicità prima della sua osservazione a livello individuale, prevenendo danni irreversibili che colpiscono la popolazione. Pertanto, come nella pratica clinica, sono necessari nuovi strumenti per identificare meglio gli eventi molecolari e ottenere una diagnosi precoce che aiuterà a rilevare l’inquinamento prima che causi effetti dannosi irreversibili sugli ecosistemi.

Figura 3. Attività trascrizionale dei geni legati alla riparazione del DNA. I livelli di mRNA della poli(ADP-ribosio) polimerasi I (PARP1), dell'inibitore di NFKB Iκ (IkBa), del complemento incrociato 3 per la riparazione dei raggi X (XRCC3), del componente del complesso di coesione RAD21 (RAD21) e della proteina di riparazione della rottura del doppio filamento RAD50 (RAD50) negli adulti acuti di Physella dopo l'esposizione in vivo a Fenoxycarb per sette giorni a 19 gradi. La RT-PCR è stata utilizzata per quantificare i livelli di mRNA e la proteina ribosomiale L10 (rpL10), actina (Act), 6-fosfofrutto-2-chinasi/fruttosio- 2,6-bifosfatasi 2 (PFKFB2) e la gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) sono stati utilizzati come geni di riferimento. Il confronto è stato eseguito con i controlli esposti al solvente. Vengono mostrate le scatole dei baffi. Ogni scatola corrisponde a 12 individui. La mediana è indicata dalla linea orizzontale all'interno del riquadro, mentre il 25° e il 75° percentile sono indicati dai confini del riquadro. I risultati più alti e più bassi sono rappresentati dai baffi. Il piccolo triangolo all'interno della casella indica la media e vengono mostrati i valori anomali (cerchi). Non sono state osservate differenze significative rispetto al controllo (p<0.05).

Per molto tempo, la ricerca di pesticidi con un impatto basso o nullo sulle specie non bersaglio è stata uno degli obiettivi chiave dell’agricoltura. Gli analoghi dell'ormone giovanile sono stati uno di questi pesticidi poiché imitano uno specifico ormone degli artropodi, riducendo drasticamente il rischio per altre specie. È noto che il Fenoxycarb influenza lo sviluppo e diversi processi cellulari negli insetti, aracnidi e crostacei8,13,18. Tuttavia, l’attuale scarsa conoscenza della fisiologia degli invertebrati rende necessario testarli su specie non bersaglio per garantirne il basso impatto. Il primo elemento da considerare è il fatto che la risposta si osserva a 1 ug/L di Fenoxycarb, che è la concentrazione intermedia utilizzata. È molto basso rispetto a quelli che hanno effetto su insetti e crostacei3,20,28. La mancata risposta a concentrazioni più elevate potrebbe essere dovuta ad una risposta più precoce, ripristinando la condizione normale al momento dell'analisi mediante l'azione di meccanismi di disintossicazione. Alla concentrazione più bassa, la mancanza di risposta osservata potrebbe essere dovuta al fatto che la quantità di sostanza tossica è inferiore alla concentrazione soglia necessaria per innescare un effetto. Un'altra possibilità potrebbe essere che sia necessario più tempo per raggiungere la concentrazione soglia. Infine, non può essere scartata nemmeno una presunta risposta a forma di U. Ulteriori ricerche che impiegano tempi di risposta diversi permetterebbero di chiarire i processi cellulari interessati e le conseguenze dipendenti dalla concentrazione.

Figura 4. Attività trascrizionale dei geni legati al sistema nervoso (acetilcolinesterasi [AChE]), stress ossidativo (catalasi [Cat], superossido dismutasi di rame-zinco [SOD CuZn] e superossido dismutasi di manganese [SOD Mn]) e apoptosi ( caspasi 3 [Casp3] e fattore 3 che induce l'apoptosi [AIF3]). Le lumache sono state esposte al Fenoxycarb per sette giorni a 19 gradi. La quantificazione mediante RT-PCR è stata eseguita utilizzando la proteina ribosomiale L10 (rpL10), actina (Act), 6-fosfofrutto-2-chinasi/fruttosio-2,6-bifosfatasi 2 (PFKFB2) e gliceraldeide-3- fosfato deidrogenasi (GAPDH) come geni di riferimento. Il confronto è stato eseguito con i controlli esposti al solvente. Vengono mostrate le scatole dei baffi. Ogni scatola corrisponde a 12 individui. La mediana è indicata dalla linea orizzontale all'interno del riquadro, mentre il 25° e il 75° percentile sono indicati dai confini del riquadro. I risultati più alti e più bassi sono rappresentati dai baffi. Il piccolo triangolo all'interno della casella indica la media e vengono mostrati i valori anomali (cerchi). Differenza significativa rispetto al controllo (asterisco) è indicata (p<0.05).

In questo lavoro, abbiamo testato la risposta a livello di espressione genica dell’analogo dell’ormone giovanile, Fenoxycarb, e abbiamo osservato una risposta che, sebbene debole, richiede ulteriori studi per garantire l’assenza di tossicità nei non artropodi. Come previsto, non è stato osservato alcun effetto nei geni legati ai meccanismi di riparazione del DNA o alla risposta allo stress. Non ci sono dati in letteratura sugli studi di questi geni, nemmeno negli insetti. Una situazione simile si verifica con il metabolismo energetico, sebbene esistano alcuni rapporti sull'impatto del fenossicarb sui lipidi e sui carboidrati dei crostacei3,4,29. Per quanto ne sappiamo, non esiste alcun rapporto precedente che analizzi la risposta dei meccanismi di disintossicazione in presenza di Fenoxycarb. In P. acuta non si riscontra alcun cambiamento nei geni analizzati coinvolti nella fase I, fase II e fase III della disintossicazione, suggerendo che altre proteine ​​diverse da quelle qui analizzate sono responsabili della biotrasformazione di questa sostanza chimica. Contrariamente ai nostri risultati, senza cambiamenti nei geni legati alla regolazione epigenetica, è stato descritto che l'esposizione per tre giorni a 50 µg/L di Fenoxycarb può sovraregolare l'istone deacetilasi nell'acqua fea Moina macrocopa4. Ciò potrebbe riflettere la sensibilità differenziale al composto, ma anche il fatto che i cambiamenti epigenetici nell'acqua sono legati alla imitazione degli effetti dell'ormone giovanile.

Figura 5. Attività trascrizionale dello stress (piccola proteina da shock termico 16.6 [sHSP16.6], piccola proteina da shock termico 17.9 [sHSP17.9], proteina da shock termico 60 [HSP60], affine da shock termico 70 4 [HSC70 (4 )], proteina da shock termico 70 B2-simile [HSP70B2], proteina regolata dal glucosio 78/proteina immunoglobulinica legante [Grp78/BiP] e proteina da shock termico 83 [HSP83]) e fattore inducibile dall'ipossia{{23} } geni alfa [HIF1]) nelle lumache adulte. Gli animali sono stati esposti per una settimana al Fenoxycarb a 19 gradi. L'attività trascrizionale è stata quantificata mediante RT-PCR utilizzando la proteina ribosomiale L10 (rpL10), actina (Act), 6-fosfofrutto-2-chinasi/fruttosio-2,6-bifosfatasi 2 (PFKFB2 ) e gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) come geni di riferimento. Il confronto è stato eseguito con i controlli esposti al solvente. Vengono mostrate le scatole dei baffi. Ogni scatola corrisponde a 12 individui. La mediana è indicata dalla linea orizzontale all'interno della scatola, mentre il 25° e il 75° percentile sono indicati dai confini della scatola. I risultati più alto e più basso sono rappresentati dai baffi. Il piccolo triangolo all'interno della casella indica la media e vengono mostrati i valori anomali (cerchi). Viene indicata la differenza significativa rispetto al controllo (asterisco) (p<0.05).

Figura 6. Attività trascrizionale dei geni correlati alla modulazione epigenetica (DNA metilasi I [DNMT1], lisina acetiltransferasi 6B [KAT6B] e istone deacetilasi 1 [Hda1]), all'immunità (aplysia nin-A [ApA]) e al metabolismo energetico ( glicogeno fosforilasi L [PYGL] e proteina simile al legame dell'ossisterolo 8 [OSBPL8]) negli adulti acuti di Physella dopo esposizione in vivo a Fenoxycarb per sette giorni a 19 gradi. L'attività trascrizionale è stata quantificata mediante RT-PCR utilizzando la proteina ribosomiale L10 (rpL10), actina (Act), 6-fosfofrutto-2-chinasi/fruttosio-2,6-bifosfatasi 2 (PFKFB2 ) e gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) come geni di riferimento. Il confronto è stato eseguito con i controlli esposti al solvente. Vengono mostrate le scatole dei baffi. Ogni scatola corrisponde a 12 individui. La mediana è indicata dalla linea orizzontale all'interno del riquadro, mentre il 25° e il 75° percentile sono indicati dai confini del riquadro. I risultati più alti e più bassi sono rappresentati dai baffi. Il piccolo triangolo all'interno della casella indica la media e vengono mostrati i valori anomali (cerchi). Differenza significativa rispetto ai controlli (asterisco) è indicata (p<0.05).

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L'effetto sull'AChE suggerisce un certo impatto sul sistema nervoso. Come affermato nell'introduzione, è stata osservata l'inibizione dell'attività dell'acetilcolinesterasi nel cervello di ratto e dei recettori nicotinici17, suggerendo che il Fenoxycarb può avere effetti nervosi su organismi non bersaglio. Studi sui recettori nicotinici hanno dimostrato che il meccanismo del Fenoxycarb non era competitivo30. Sebbene il Fenoxycarb sia stato utilizzato come analogo dell'ormone giovanile, sembra che abbia qualche effetto come il resto dei carbammati influenzando il sistema nervoso. La risposta osservata in P. acuta supporta un effetto nervoso e suggerisce che potrebbe influenzare la capacità della lumaca di sopravvivere alterando il sistema nervoso centrale. L'aumento osservato nella trascrizione potrebbe riflettere un tentativo di compensare l'inibizione dell'attività enzimatica. Ulteriori studi aiuterebbero a chiarire il presunto effetto sul comportamento della lumaca o sulla capacità di rispondere a situazioni che coinvolgono il sistema nervoso. In ogni caso è un dato di fatto considerare l’impatto che il Fenoxycarb può avere sulle specie non bersaglio nel medio e lungo termine. D’altro canto, la modulazione di sHSP17.9 suggerisce alcuni effetti, ma determinare il reale impatto sulla cellula è una questione complessa. Le piccole proteine ​​da shock termico sono diverse proteine ​​coinvolte nella risposta allo stress e correlate a molteplici processi cellulari, comprese le funzioni neurali. In questo senso, si è tentati di ipotizzare che sHSP17.9 possa codificare alcuni sHSP coinvolti nella fisiologia neurale, ma le difficoltà nello stabilire l'omologia richiedono cautela. Ulteriori ricerche forniranno ulteriori informazioni e potrebbero aiutare a definire il ruolo di questa proteina nella cellula. Come biomarcatori, il fatto che gli sHSP condividano il dominio alfa-cristallina ne facilita l'identificazione. Tuttavia, la loro elevata diversità nelle regioni N e C-terminali complica l'identificazione di omologie tra le specie.

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Di conseguenza, è necessario uno studio più approfondito di questa famiglia di proteine ​​per determinare il loro ruolo nel metabolismo cellulare e per stabilire omologie funzionali tra di loro. In ogni caso, l'alterazione osservata suggerisce che il Fenoxycarb abbia qualche effetto a medio termine su P. acuta, aumentando la possibilità che causi una certa riduzione del benessere della lumaca. L'aplysianina-A è una proteina coinvolta nella risposta immunitaria agendo come antibatterico. Questa glicoproteina antibatterica inibisce sia i batteri gram-positivi che quelli gram-negativi nell'Aplysia kurodai32. L'alterazione dell'attività trascrizionale può produrre una modulazione della risposta alle infezioni batteriche, rendendo P. acuta più sensibile ad esse. Un eccesso nella risposta o in un momento inadeguato potrebbero influenzare la capacità di risposta dell'organismo, selezionando quei batteri non sensibili all'ApA, rendendo l'animale più sensibile alle infezioni. L'impatto osservato in P. acuta suggerisce una presunta alterazione dell'immunità, essendo la prima volta che questa possibilità viene suggerita per il Fenoxycarb. Sono necessari ulteriori studi che coinvolgano più geni legati al sistema immunitario per confermarlo e determinare l’effetto sulla sopravvivenza a lungo termine della popolazione. Le prove attuali suggeriscono un basso impatto sull’ambiente del Fenoxycarb. Tuttavia, i risultati osservati nella specie non bersaglio P. acuta richiedono un’analisi approfondita perché l’esposizione può riflettere un impatto a lungo termine. Sebbene i dati a livello molecolare suggeriscano un effetto debole a breve termine, ulteriori analisi che testeranno altri parametri forniranno ulteriori prove. Per garantire l'innocuità del Fenoxycarb, è necessario analizzarlo in diverse specie non bersaglio che coprano diversi gruppi di invertebrati e testare gli effetti a breve e lungo termine a livello molecolare, cellulare e dell'organismo.

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