L'echinacoside Rb1 attenua la compromissione vascolare associata all'età modulando il percorso del gas6

ASTRATTO

Contesto:EchinacosideRb1 (Rb1) esercita molti effetti benefici e protegge dalle malattie cardiovascolari.

Obiettivo: indagare se Rb1 potrebbe attenuare la compromissione vascolare correlata all'età e identificare il meccanismo. Materiali e metodi: I topi femmina C57BL/6J di età compresa tra 2 e 18 mesi, assegnati in modo casuale ai gruppi Young, Young þ 20 mg/kg Rb1, Oldþ veicolo, Old þ 10 mg/kg Rb1 e Old þ 20 mg/kg Rb1, sono stati trattati giornalmente intraperitoneale iniettato con veicolo o Rb1 per 3 mesi. I segmenti dell'aorta toracica sono stati utilizzati per ispezionare la vasodilatazione dipendente dall'endotelio. I tessuti dell'aorta toracica sinistra sono stati raccolti per analisi di espressione istologica o molecolare, comprese proteine ​​​​correlate all'invecchiamento, marcatori rilevanti per calcificazione e fibrosi ed espressione di Gas6/Axl.

Risultati: Abbiamo scoperto che nel gruppo del veicolo Oldþ, l'espressione delle proteine ​​della senescenza e delle molecole di adesione cellulare erano significativamente aumentate, con un rilassamento dell'aorta toracica dipendente dall'endotelio peggiore (58,35% ± 2,50%) rispetto al gruppo Young (88,84% ± 1,20% ). Tuttavia, il trattamento con Rb1 ha ridotto significativamente i livelli di espressione di queste proteine ​​e preservato il rilassamento endotelio-dipendente nei topi anziani. Inoltre, il trattamento con Rb1 ha anche ridotto la deposizione di calcio, la deposizione di collagene ei livelli di espressione proteica del collagene I e del collagene III nei topi anziani. Inoltre, abbiamo scoperto che la downregulation dell'espressione della proteina Gas6 del 41,72% e dell'espressione dell'mRNA del 52,73% nei topi anziani rispetto ai topi giovani è stata abrogata dal trattamento con Rb1. Ma non c'era alcuna differenza significativa nell'espressione di Axl tra i gruppi.

Conclusioni: il nostro studio conferma che Rb1 potrebbe migliorare il danno vascolare, suggerendo che Rb1 potrebbe essere un potenzialeagente di compromissione vascolare correlato all'invecchiamento.

Acquista Cistanche ricco di echinacoside

introduzione

Nei prossimi 30 anni in Cina, si stima un aumento dal 12,6% al 26% degli adulti di età pari o superiore a 65 anni (Zhou e Walker 2021). Sebbene la durata della vita umana sia in aumento, le malattie legate all'età continuano a essere motivo di preoccupazione.Malattia cardiovascolaresono imalattie più comuniche colpiscono soggetti anziani.Invecchiamento vascolareaccompagnato da cambiamenti vascolari strutturali e funzionali è un importante fattore di rischio indipendente permalattia cardiovascolare(Lakatta e prelievo 2003). Le indagini epidemiologiche hanno dimostrato che l'82% dei pazienti che muoiono per malattie cardiovascolari ha 65 anni o più (Moslehi et al. 2012). Pertanto, esplorare il meccanismo della compromissione vascolare associata all'età e trovare agenti in grado di proteggere la funzione vascolare dal declino correlato all'età potrebbe svolgere un ruolo importante nel ridurre l'incidenza e la prevalenza dei disturbi cardiovascolari associati all'età negli anziani.

L'invecchiamento arterioso è stato implicato nella patogenesi della disfunzione vascolare e di varie malattie cardiovascolari ed è un segno distintivo dell'invecchiamento (Minamino e Komuro 2007). Le alterazioni vascolari derivanti dall'invecchiamento variano e includono disfunzione endoteliale, ipertrofia delle cellule muscolari lisce vascolari (VSMC), dilatazione arteriosa, riorganizzazione della matrice extracellulare (ECM), calcificazione vascolare e aumento del rapporto collagene-elastina con frammentazione e irrigidimento vascolare (Tolle et al. 2015). Brandes et al. (2005) hanno riferito che la disfunzione endoteliale legata all'età era comunemente caratterizzata da uno squilibrio nel rilassamento derivato dall'endotelio e nei fattori contrattili. Ulteriori studi di Herrera et al. (2010) hanno anche dimostrato che la disfunzione endoteliale era strettamente associata a un progressivo declino della vasodilatazione endotelio-dipendente. Tuttavia, non è ancora chiaro come l'invecchiamento influisca sulla vasodilatazione o inneschi squilibri nei fattori correlati e alla fine porti alla disfunzione vascolare. Acosta et al. (2008) hanno dimostrato che le cellule vascolari in fase di senescenza potrebbero produrre molecole di adesione, tra cui l'inibitore dell'attivatore del plasminogeno 1 (PAI-1), una proteina di adesione cellulare vascolare 1 (VCAM-1) e la molecola di adesione cellulare intercellulare{{ 14}} (ICAM-1). Si pensava che tutte queste molecole di adesione svolgessero un ruolo importante nel reclutamento dei monociti nei siti aterosclerotici e quindi avviassero il rimodellamento vascolare, con conseguente riduzione della compliance e aumento della rigidità (Acosta et al. 2008; Kovacic et al. 2011). La rigidità vascolare è la manifestazione più importante dell'invecchiamento vascolare. È attribuito al rimodellamento dell'ECM e contribuisce al declino della vasodilatazione. Precedenti studi hanno dimostrato che la rigidità vascolare e la senescenza delle VSMC sono attribuite alla calcificazione mediale e alla deposizione di collagene (Mauriello et al. 1992; McClelland et al. 2006; Nakano-Kurimoto et al. 2009; Wendorff et al. 2015; Kim et al. 2018 ). Pertanto, la disfunzione della vasodilatazione potrebbe derivare da calcificazione e fibrosi. La riduzione della deposizione di calcio o collagene può ritardare l'insufficienza arteriosa correlata all'invecchiamento.

EchinacosideRb1 (Rb1) è uno dei componenti attivi presenti nel ginseng. La ricerca ha riportato che Rb1 esercita molti effetti antisenescenza e anti-apoptotici benefici, in particolare nella protezione del miocardio e dell'endotelio (Zheng et al. 2017; Zhou et al. 2017; Zheng et al. 2020). Studi recenti hanno dimostrato che Rb1 può ridurre la calcificazione vascolare associata alla malattia renale cronica e l'espressione del collagene di tipo I nei ratti (Zhou et al. 2019b). I risultati hanno anche suggerito che Rb1 riduce l'espressione del collagene di tipo I (Kwok et al. 2012). Tuttavia, gli effetti di Rb1 sulla compromissione vascolare associata all'età non sono stati studiati.

È stato riportato che Rb1 inibisce la calcificazione vascolare attraverso la transattivazione in vitro del gene 6 (Gas6) specifico per l'arresto della crescita (Nanao-Hamai et al. 2019). Gas6, un membro della famiglia delle proteine ​​vitamina K-dipendenti, è implicato nella regolazione di molteplici funzioni cellulari dopo essersi legato al suo recettore Axl, un recettore tirosina chinasi di membrana (Nakano et al. 1997; Fridell et al. 1998; Yanagita et al. 2001). Alcuni studi hanno indicato che la via Gas6/Axl svolge un ruolo fondamentale nella biologia vascolare e in malattie come la calcificazione vascolare, il rimodellamento vascolare e l'aterosclerosi (Korshunov et al. 2006; Hurtado et al. 2010; Son et al. 2010). Ipotizziamo che Rb1 possa attenuare la compromissione vascolare correlata all'età sopprimendo la calcificazione e la fibrosi, che è potenzialmente associata alla regolazione della via Gas6/Axl.

Materiali e metodi

Reagenti sperimentali

Rb1 (purezza superiore al 98%) è stato ottenuto da Victory (Sichuan, Cina). Anticorpi contro p21Cip1 (ab188224), p16INK4a (ab51243), ICAM-1 (ab179707), VCAM-1 (ab134047), PAI-1 (ab222754) e GAPDH (ab181603) sono stati acquistati da Abcam (MA, Stati Uniti). Gli anticorpi contro il collagene I (14695), il collagene III (22734) e Axl (13196) sono stati acquistati da Proteintech Group (MA, USA). Gli anticorpi contro Gas6 (A8545) e p16INK4a (A0262) sono stati acquistati da ABclonal Technology (Hubei, Cina). Il tampone di Krebs-Henseleit (KH) modificato, la fenilefrina (un potente vasocostrittore) e l'acetilcolina (Ach, un donatore di NO dipendente dall'endotelio) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (MO, USA). Tutti gli altri reagenti utilizzati erano di grado analitico.

Animali e gestione

Questo studio è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Sun Yat-Sen University. La maggior parte degli studi sulla longevità ha mostrato effetti sulle femmine (Hsu et al. 2018; Qin et al. 2018); quindi, abbiamo eseguito il nostro studio a lungo termine utilizzando topi femmina. I topi femmina C57BL/6J di età compresa tra 2 e 18 mesi sono stati ottenuti dal Center of Experimental Animals, Sun Yat-Sen University. I topi sono stati alimentati con una dieta normale e alloggiati in condizioni controllate (24 ± 2 C e 50 ± 5 percento di umidità) con fotoperiodi luce/buio di 12 ore in condizioni specifiche prive di agenti patogeni. 40 giovani topi femmina C57BL/6J a 2 mesi di età sono stati assegnati in modo casuale ai gruppi Young e Young þ 20 mg/kg Rb1 (Young þ Rb1-20) (n ¼ 20 ciascuno). Questi topi sono stati trattati con un'iniezione intraperitoneale giornaliera di veicolo (soluzione fisiologica sterile) o 20 mg/kg di Rb1 disciolti nel veicolo per 3 mesi prima dell'eutanasia mediante asfissia da CO2 a 5 mesi di età. 60 topi femmina C57BL/6J di 18 mesi di età sono stati assegnati in modo casuale al veicolo Old þ, Old þ 10 mg/kg Rb1 (Old þ Rb1-10) e Old þ 20 mg/kg Rb1 (Old þ Rb 1-20) gruppi (n ¼ 20 ciascuno). I topi sopravvissuti fino alla fine di questo esperimento hanno ricevuto iniezioni intraperitoneali giornaliere del solo veicolo o Rb1 (10 o 20 mg/kg) per 3 mesi, dopodiché i topi sono stati soppressi a 21 mesi di età. Gli esperimenti sono stati ripetuti almeno tre volte con 4-5 topi per gruppo.

Materiali e metodi Reagenti sperimentali

Rb1 (purezza superiore al 98%) è stato ottenuto da Victory (Sichuan, Cina). Anticorpi contro p21Cip1 (ab188224), p16INK4a (ab51243), ICAM-1 (ab179707), VCAM-1 (ab134047), PAI-1 (ab222754) e GAPDH (ab181603) sono stati acquistati da Abcam (MA, Stati Uniti). Gli anticorpi contro il collagene I (14695), il collagene III (22734) e Axl (13196) sono stati acquistati da Proteintech Group (MA, USA). Gli anticorpi contro Gas6 (A8545) e p16INK4a (A0262) sono stati acquistati da ABclonal Technology (Hubei, Cina). Il tampone di Krebs-Henseleit (KH) modificato, la fenilefrina (un potente vasocostrittore) e l'acetilcolina (Ach, un donatore di NO dipendente dall'endotelio) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (MO, USA). Tutti gli altri reagenti utilizzati erano di grado analitico.

Animali e gestione

Questo studio è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Sun Yat-Sen University. La maggior parte degli studi sulla longevità ha mostrato effetti sulle femmine (Hsu et al. 2018; Qin et al. 2018); quindi, abbiamo eseguito il nostro studio a lungo termine utilizzando topi femmina. I topi femmina C57BL/6J di età compresa tra 2 e 18 mesi sono stati ottenuti dal Center of Experimental Animals, Sun Yat-Sen University. I topi sono stati alimentati con una dieta normale e alloggiati in condizioni controllate (24 ± 2 C e 50 ± 5 percento di umidità) con fotoperiodi luce/buio di 12 ore in condizioni specifiche prive di agenti patogeni. 40 giovani topi femmina C57BL/6J a 2 mesi di età sono stati assegnati in modo casuale ai gruppi Young e Young þ 20 mg/kg Rb1 (Young þ Rb1-20) (n ¼ 20 ciascuno). Questi topi sono stati trattati con un'iniezione intraperitoneale giornaliera di veicolo (soluzione fisiologica sterile) o 20 mg/kg di Rb1 disciolti nel veicolo per 3 mesi prima dell'eutanasia mediante asfissia da CO2 a 5 mesi di età. 60 topi femmina C57BL/6J di 18 mesi di età sono stati assegnati in modo casuale al veicolo Old þ, Old þ 10 mg/kg Rb1 (Old þ Rb1-10) e Old þ 20 mg/kg Rb1 (Old þ Rb 1-20) gruppi (n ¼ 20 ciascuno). I topi sopravvissuti fino alla fine di questo esperimento hanno ricevuto iniezioni intraperitoneali giornaliere del solo veicolo o Rb1 (10 o 20 mg/kg) per 3 mesi, dopodiché i topi sono stati soppressi a 21 mesi di età. Gli esperimenti sono stati ripetuti almeno tre volte con 4-5 topi per gruppo.

Determinazione del vasorilassamento negli anelli dell'aorta toracica

Dopo che gli animali sono stati soppressi, gli anelli dell'aorta toracica sono stati rimossi rapidamente e posti in una soluzione tampone KH fredda (118 mmol/L NaCl, 4,75 mmol/L KCl, 25 mmol/L NaHCO3, 1,18, mmol/L MgSO4 1. 18 mmol/L KH2PO4, 2,54 mmol/L CaCl2 e 11,1 mmol/L glucosio) e il grasso e il tessuto circostante sono stati accuratamente sbrigliati. La lunghezza degli anelli aortici era di circa 3 mm. I segmenti aortici sono stati sospesi su ganci in acciaio inossidabile, aerati in tampone KH e ossigenati continuamente con O2 al 95% a 37°C. Gli anelli aortici sono stati quindi collegati a trasduttori di forza FORT-10 per l'acquisizione dei dati MacLab. Una tensione passiva iniziale negli anelli aortici è stata impostata a 3 mN per 30 minuti per ottenere la stabilità dell'anello vasale prima di ulteriori sperimentazioni. Il tampone KH è stato sostituito ogni 10 min. La fenilefrina è stata aggiunta al bagno di tessuto ad una concentrazione di 105 mol/L per indurre vasocostrizione. Dopo aver raggiunto la stabilità dell'anello vasale, il vasorilassante Ach (10 9 –10 5 mol/L) è stato aggiunto al bagno tissutale in successione immediata per ottenere la curva dose-risposta. Il rilassamento ad ogni concentrazione è stato misurato ed è espresso come percentuale di forza generata in risposta alla fenilefrina.

Immunoistochimica

I tessuti dell'aorta toracica sono stati fissati in formalina, disidratati, inclusi in paraffina e tagliati in sezioni trasversali di 4 lm. Queste sezioni sono state incubate in tampone citrato (pH 6.0) e riscaldate al microonde per 10 minuti due volte dopo essere state sottoposte a deparaffinazione e reidratazione. Il siero di capra (10%) (Gibco, BRL, NY, USA) è stato utilizzato per bloccare il legame non specifico per 1 ora a 37°C, seguito da un'incubazione notturna con anticorpi primari contro p21Cip1 (1:1000) e p16INK4a (1:200 ) a 4 C in una scatola umida. Dopo tre lavaggi in PBS, sono stati aggiunti anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) (Abcam) e incubati per 60 minuti a 37°C, seguiti dalla colorazione con diaminobenzidina (1:100, Abcam). L'ematossilina è stata applicata per controcolorare i nuclei delle cellule. Le sezioni sono state coperte con gomma neutra e fotografate al microscopio Zeiss.

Colorazione con ematossilina-eosina (HE).

Le sezioni di aorta toracica incluse in paraffina sono state colorate con ematossilina per 2 minuti. Dopo il lavaggio e il trattamento con alcol acido all'1%, le sezioni sono state trattate con colorazione con eosina per 3 minuti. Successivamente, le sezioni sono state lavate, disidratate e trattate con xilene prima dell'osservazione microscopica. Le sezioni dell'aorta toracica sono state fotografate con un microscopio Zeiss.

Colorazione tricromica di Masson

Le sezioni di aorta toracica incluse in paraffina sono state colorate in ematossilina di ferro di Weigert per 10 minuti dopo essere state sottoposte a deparaffinazione e reidratazione e sono state quindi lavate con PBS per 5 minuti. I tessuti sono stati quindi colorati in soluzione Biebrich di fucsina acida scarlatta per 5 minuti e lavati in acqua distillata. Le sezioni sono state quindi sottoposte alcune volte a differenziazione e disidratazione in alcol al 75% e 90%, seguite dal risciacquo in acqua di rubinetto. Infine, le sezioni sono state ripulite in xilene e montate con un mezzo di montaggio. Le sezioni sono state visualizzate al microscopio. La deposizione di collagene interstiziale è stata indicata dalla colorazione blu-verde.

Colorazione rosso alizarina S

Per la colorazione della calcificazione aortica, le sezioni dell'aorta toracica sono state colorate con una soluzione S di rosso alizarina al 2% per 10 minuti e lavate con PBS. Quindi, le sezioni sono state immerse in acetone anidro per 30 s, una soluzione mista di acetone anidro e xilene (rapporto volumetrico ¼ 1:1) per 15 s e xilene anidro per 1 min. I sali interstiziali di fosfato di calcio sono stati indicati dalla colorazione rossa.

Macchie occidentali

Le aorte toraciche sono state poste nel tampone di lisi RIPA (HaiGene, Haerbin, Cina) integrato con un inibitore della proteasi (MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA) e quindi omogeneizzate mediante ultrasuoni su ghiaccio. Il lisato tissutale è stato centrifugato a 12,000 g a 4 C per 15 minuti e il supernatante è stato raccolto in una nuova provetta. Successivamente, la concentrazione proteica nel surnatante è stata determinata utilizzando un kit di analisi proteica BCA (Beyotime Institute of Biotechnology, Jiangsu, Cina). La SDS PAGE è stata eseguita con quantità uguali di proteine ​​da ciascun campione come descritto in precedenza (Zheng et al. 2020), e le proteine ​​sono state quindi trasferite alle membrane PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA, USA). Le membrane sono state incubate a 4°C durante la notte con uno dei seguenti anticorpi primari dopo essere state bloccate con il 5% di albumina di siero bovino (Gibco) per 1 ora a temperatura ambiente: p21Cip1 (1:1000), p16INK4a (1:1000), ICAM{ {16}} (1:1000), VCAM-1 (1:5000), PAI-1 (1:1000), collagene I (1:1000), collagene III (1:300), Gas6 (1:1000), Axl (1:500) e GAPDH (1:1000). Dopo essere state lavate, le membrane sono state incubate con un anticorpo secondario coniugato con HRP (Boster, Wuhan, Cina) per 1 ora a temperatura ambiente. Il legame dell'anticorpo secondario è stato analizzato utilizzando un kit ECL (EMD Millipore) e le intensità delle bande sono state analizzate utilizzando il software ImageJ (versione 1.41; National Institutes of Health, MD, USA). L'espressione GAPDH è stata utilizzata come controllo interno.

RT-PCR quantitativa in tempo reale (qPCR)

Innanzitutto, l'RNA totale è stato isolato dall'aorta toracica utilizzando un kit di estrazione dell'RNA universale TaKaRa MiniBEST (9767, TaKaRa) in conformità con i protocolli del produttore. La concentrazione di RNA è stata quindi misurata con uno spettrofotometro DS-11 FX (DeNovix). Successivamente, l'RNA estratto (1000 ng ciascuno per un sistema di reazione da 20 mL) è stato retrotrascritto in cDNA utilizzando PrimeScriptTM RT Master Mix (RR360A, TaKaRa) secondo le istruzioni del produttore in un sistema PCR ProFlex (Thermo Scientific ). Infine, i prodotti di trascrizione inversa sono stati utilizzati come modelli per un'ulteriore amplificazione PCR con SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa). Sono state utilizzate le seguenti sequenze primer: Gapdh: forward 50 -CAGCAACTCCCA CTCTTCCAC-30 and reverse 50 - TGGTCCAGGGTTTCTTAC TC-30; e Axl: avanti 50 -GGAACCCAGGGAATATCACAGG- 30 e indietro 50 -AGTTCTAGGATCTGTCCATCTCG-30; e Gas6 avanti 50 -TGCTGGCTTCCGAGTCTTC-30 e indietro 50 -CGGGGTCGTTCTCGAACAC-30. Ciascun pozzetto di reazione in una 96-pozzetto trasparente (Thermo Scientific) che conteneva 0,4 pmol/lL di primer forward e reverse, 1 SYBR Premix Ex Taq II (RR820A, TaKaRa) e 10 ng di cDNA. Il volume di reazione finale era di 20 mL e tutti i campioni sono stati analizzati in triplicato. L'amplificazione del cDNA è stata eseguita come segue: pre-denaturazione a 95 C per 30 s, seguita da 40 cicli di denaturazione a 95 C per 5 s e ricottura a 60 C per 35 s in QuantStudio5 (Thermo Scientific). Il metodo 2-DDCT è stato utilizzato per l'analisi quantitativa relativa dei dati raccolti. Il livello di espressione relativa dell'mRNA dei geni bersaglio è stato ottenuto confrontando i dati del gruppo sperimentale con quelli del gruppo di controllo con riferimento a Gapdh.

Email:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950