La deposizione sierica di amiloide P è una caratteristica sensibile e specifica della glomerulopatia simil-membranosa con depositi di IgG Kappa mascherati

Contatto: emily.li@wecistanche.com

Christopher P. Larsen1, Shree G. Sharma1, Tiffany N. Caza1, Daniel J. Kenan1, Aaron J. Storey2, Ricky D. Edmondson2, Christian Herzog2 e John M. Arthur2

PAROLE CHIAVE:glomerulonefrite; depositi mascherati; spettrometria di massa; glomerulopatia membranosa; depositi subepiteliali

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La glomerulopatia simil-membranosa con depositi di IgG kappa mascherati (MGMID) è un modello di glomerulonefrite recentemente descritto con un'istopatologia unica. Il pattern è caratterizzato da subepiteliale e/o mesangialeimmunedepositi che sono "mascherati", alla colorazione delle immunoglobuline mediante immunofluorescenza di routine ma si colorano fortemente per le catene leggere di IgG e kappa dopo la digestione della proteasi. I pazienti con questo pattern di glomerulonefrite sono più comunemente donne giovani che presentano proteinuria e una vaga storia di malattie autoimmuni come anticorpi antinucleari a basso titolo. Qui abbiamo confrontato il profilo della spettrometria di massa dei glomeruli microdissezionati con cattura laser da nove biopsie renali MGMID con otto biopsie che mostrano altri modelli di glomerulopatia membranosa. La proteina più significativamente aumentata in MGMID era l'amiloide P sierica. L'immunocolorazione ha mostrato l'amiloide P sierica colocalizzata con IgG nei glomeruli di MGMID ma non con glomerulopatia membranosa associata a PLA2R. L'amiloide P sierica era positiva nei glomeruli di tutte le 32 biopsie MGMID ma negativa nelle biopsie di altri tipi di glomerulopatie membranose come quelle associate a PLA2R e THSD7A. C'erano quattro biopsie con colorazione P amiloide glomerulare del siero tra le 173 biopsie che non soddisfacevano i criteri per MGMID o amiloidosi. Tutte e quattro queste biopsie con colorazione positiva dell'amiloide P sierica avevano un pattern membranoso di glomerulopatia con depositi di IgG kappa che differiva da MGMID solo per la mancanza di "mascheramento". Pertanto, la colorazione positiva all'interno dei depositi glomerulari per l'amiloide sierica identifica una forma unica di glomerulonefrite che probabilmente condivide un comune meccanismo fisiopatologico della malattia.

La glomerulopatia simil-membranosa con depositi di kappa di IgG mascherati (MGMID) è un pattern istopatologico di glomerulonefrite descritto nel 2014, che è stata la prima descrizione di quelli che sono stati definiti depositi glomerulari mascherati.1 L'istopatologia caratteristica di questa malattia include la presenza di mesangiale e subepiteliale depositi con vincolo IgG kappa. Curiosamente, sebbene la colorazione del componente 3 del complemento (C3) sia spesso evidente dall'immunofluorescenza di routine sul tessuto congelato, la colorazione Ig spesso maschera, il che significa che mostra una colorazione falsa negativa mediante immunofluorescenza di routine ma una colorazione positiva quando ripetuta su tessuto incluso in paraffina dopo la digestione della proteasi. Pertanto, a meno che il patologo non mantenga un alto indice di sospetto per questa entità, potrebbe essere erroneamente diagnosticata come glomerulopatia C3. Altre entità che sono state descritte per mostrare questo fenomeno di mascheramento nei depositi glomerulari includono la glomerulonefrite membranoproliferativa con depositi di Ig monotipici mascherati e la glomerulonefrite crioglobulinemica.2,3

I pazienti trovati per avere MGMID sulla biopsia sono più comunemente giovani femmine<40 years="" of="" age,="" and="" many="" have="" positive=""> serologic study results such as antinuclear antibodies, although few carry a diagnosis of any well-defined autoimmune disease such as lupus.4 Mean proteinuria in a recent case series of 41 patients was 3.5 g/24 h, and mean serum creatinine was found to be 1.4 mg/dl.4 The deposits of all reported cases that could be tested for IgG subclass were of the IgG1 kappa subclass. Despite this monotypic staining on biopsy, the vast majority of patients tested (>95 per cento) sono risultati negativi per Ig monoclonali mediante elettroforesi delle proteine ​​sieriche e non sono stati osservati casi associati a una neoplasia ematologica sottostante.4

È stato ipotizzato che i risultati clinicopatologici condivisi tra i pazienti con MGMID potrebbero essere indicativi di un comune meccanismo fisiopatologico molecolare che guida la loro malattia. La nostra intenzione nella prima segnalazione di questa entità era quella di definire una coorte per ulteriori analisi.1 Descriviamo qui la presenza della componente p amiloide proteica sierica (SAP) che si trova unicamente nei depositi di glomeruli MGMID. L'immunocolorazione per SAP nei depositi glomerulari è una tecnica sensibile e specifica per la diagnosi di MGMID che fornisce anche informazioni patogenetiche.

Figura 1|La componente P dell'amiloide sierica (SAP) è significativamente arricchita nei glomeruli microdissezionati da pazienti con glomerulopatia simil-membranosa con depositi di kappa di IgG mascherati. Per l'analisi statistica sono stati utilizzati valori di quantificazione assoluta normalizzati basati sull'intensità di MaxQuant (Istituto di biochimica Max Planck, Planegg, Germania). Le linee tratteggiate rappresentano i tagli euristici per il cambio di piega e il valore P. (a) Un grafico del vulcano che confronta 3 casi membranosi positivi al recettore della fosfolipasi A2 (PLA2R) con altri identifica 2 proteine ​​​​che sono valori anomali chiari nel quadrante in alto a destra. ( b ) Il grafico del vulcano che confronta 2 casi membranosi positivi al dominio 7A (THSD7A) contenenti trombospondina di tipo 1 con altri identifica 2 proteine ​​​​che sono valori anomali chiari con THSD7A che mostra il maggiore cambiamento di piega. (c) Un grafico del vulcano che confronta campioni di glomerulopatia membranosa con depositi di kappa di IgG mascherati con tutti gli altri tipi di casi membranosi identifica 6 proteine ​​che sono valori anomali chiari nel quadrante in alto a destra. C6, complemento componente 6; C7, complemento componente 7; CFHR1, proteina 1 correlata al fattore H del complemento; HP1BP3, proteina legante la proteina 1 dell'eterocromatina 3; HPRT1, ipoxantina fosforibosiltransferasi 1; IGHG3, Ig pesante costante gamma 3.

RISULTATI

Spettrometria di massa di glomeruli microdissezionati a cattura laser

L'analisi della spettrometria di massa di glomeruli microdissezionati con cattura laser da 9 casi di MGMID è stata confrontata con 8 casi di glomerulopatia membranosa (MG) inclusi 3 casi di MG positivo al recettore della fosfolipasi A2 (PLA2R), 2 casi di trombospondina di tipo 1 contenente dominio 7A ( THSD7A) – MG positivo e 3 casi di lupus MG. In questa analisi sono state identificate un totale di 1695 proteine. È stata condotta un'analisi di prova di principio per verificare se le proteine ​​coinvolte nella patogenesi della malattia di MG potessero essere rilevate mediante spettrometria di massa. Per ciascun tipo membranoso noto, l'abbondanza differenziale proteica è stata confrontata con i gruppi rimanenti utilizzando valori di quantificazione assoluta basati sull'intensità normalizzata (iBAQ). L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il test t di Welch e i risultati sono stati visualizzati su un grafico del vulcano. PLA2R era significativamente più abbondante nei casi di MG associato a PLA2R e mostrava il cambiamento di piega più forte (Figura 1a). THSD7A ha mostrato i cambiamenti di piega più forti nella MG associata a THSD7A, sebbene con un valore P maggiore a causa della bassa dimensione del campione in questo gruppo (n=2; Figura 1b). Nel complesso, questa analisi proof-of-principio ha dimostrato che la spettrometria di massa dei glomeruli microdissezionati mediante acquisizione laser può identificare proteine ​​significative per la patogenesi della malattia nella glomerulopatia membranosa.

Successivamente abbiamo cercato di identificare le proteine ​​potenzialmente coinvolte nella patogenesi di MGMID utilizzando questo approccio. Un totale di 6 proteine ​​erano significativamente più abbondanti nei campioni MGMID rispetto agli altri gruppi (Tabella 1). La proteina con il cambiamento di piega più alto era SAP (Figura 1c). Le restanti proteine ​​erano costituite da IgG Kappa, 3 proteine ​​del complemento e dalla proteina 3 legante la proteina 1 dell'eterocromatina (HP1BP3). SAP è stato considerato il candidato principale in quanto è stato rilevato in tutti i campioni MGMID e ha mostrato la maggiore differenza di abbondanza rispetto ai campioni non MGMID. Tutte le Ig identificate dalla spettrometria di massa nei glomeruli microdissezionati con acquisizione laser da casi di glomerulopatia membranosa con depositi di IgG kappa sono mostrate nella Tabella Supplementare S1. I conteggi spettrali mediante campionamento di tutte le proteine ​​che hanno mostrato un'abbondanza aumentata di $ 1 log2 nei campioni MGMID e un valore P #0.1 sono mostrati nella tabella supplementare S2.

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Colorazione SAP nei casi di glomerulopatia simil-membranosa

Un anticorpo policlonale di coniglio contro la proteina SAP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) ha mostrato una forte colorazione positiva lungo le membrane basali glomerulari dei casi con MGMID che si sono colocalizzati con IgG mediante analisi confocale. SAP non ha mostrato colocalizzazione con IgG nei glomeruli da MG associato a PLA2R (Figura 2). Un anticorpo policlonale di coniglio contro HP1BP3 è stato testato in 4 biopsie con MGMID e ha mostrato una colorazione negativa nei depositi glomerulari di tutti e 4 i casi.

La colorazione SAP è stata eseguita su un totale di 211renebiopsiecon glomerulonefrite (Tabella 2). Un totale di 36 casi con depositi di tipo immunitario sono risultati positivi per SAP. Tutti i casi che sono risultati positivi condividevano alcune caratteristiche istopatologiche tra cui la presenza di depositi mesangiali e subepiteliali con restrizione di IgG kappa e nessun cambiamento endocapillare o membranoproliferativo al microscopio ottico. SAP è risultato negativo in tutti i casi, con depositi mascherati che non erano MGMID, inclusi 3 casi di glomerulonefrite crioglobulinemica e 3 casi di glomerulonefrite membranoproliferativa mascherata. È risultato negativo anche in tutti i 19 casi di glomerulonefrite proliferativa con depositi di Ig monoclonali (PGNMID), inclusi i casi con IgG1 kappa (4 casi), IgG2 lambda (1 caso), IgG 3 kappa (8 casi) e IgG3 lambda (6 casi ). Tutti i 30 casi di glomerulopatia membranosa policlonale (PLA2R, THSD7A, lupus e segmentale) erano negativi per SAP. Sono state studiate anche altre forme di glomerulonefrite che sono risultate negative. Tra le glomerulonefriti associate all'infezione, 7 erano positive per la colorazione di IgG e 6 avevano evidenza di depositi di gobba subepiteliale. Come previsto, tutti i 6 casi di amiloidosi hanno mostrato una colorazione positiva nei depositi di amiloide. Tuttavia, il modello macchiato di deposizione era in netto contrasto con la colorazione granulare presente nei casi di MGMID. Le microfotografie rappresentative dei glomeruli sulla colorazione SAP da una varietà di diverse malattie renali sono mostrate nella Figura supplementare S1.

Tutti i 32 casi precedentemente identificati come MGMID erano positivi per SAP. Inoltre, è stata rilevata una colorazione positiva per SAP nei glomeruli da 4 su 25 casi di glomerulopatia membranosa con deposizione di IgG monotipica che non si è mascherata di routine

immunofluorescenza, inclusi 4 su 13 casi con IgG1 kappa, 0 su 2 casi con IgG1 lambda, 0 su 5 casi con IgG2 kappa, 0 su 4 casi con IgG3 kappa e {{ 12}} di 1 caso con IgG4 kappa. Complessivamente, 32 su 36 (89%) di glomerulopatia SAP-positiva erano mascherate e rientravano nella categoria MGMID, mentre gli altri 4 su 36 (11%) erano smascherati e diagnosticati come MG con depositi di IgG1 kappa. I pazienti con glomerulopatia membranosa monotipica che non mascheravano ma erano positivi per SAP avevano un'età media di 33 anni, con un rapporto femmine-maschio di 4:0. I casi con glomerulopatia membranosa monotipica che non mascheravano ma erano negativi per SAP avevano un'età media di 59,3 anni con un rapporto femmine-maschio di 15:4.

Tabella 1|Le proteine ​​sono aumentate significativamente nei glomeruli dei pazienti conglomerulopatia simil-membranosacon depositi di kappa di IgG mascherati, come mostrato dalla spettrometria di massa

Reattività del siero a SAP

I sieri di 22 pazienti con MGMID, 12 con glomerulopatia membranosa PLA2R-positiva e 6 controlli normali sono stati testati per la reattività delle IgG a SAP mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). Sebbene esistesse una certa variabilità tra i pazienti in ciascun gruppo, non vi era alcuna differenza significativa nella reattività delle IgG verso SAP tra i gruppi (Figura supplementare S2).

Figura 2|Colocalizzazione di IgG e componente P dell'amiloide sierica (SAP). (a-c) Gli esperimenti di immunofluorescenza eseguiti su un campione di biopsia renale da un paziente con diagnosi di glomerulopatia membranosa con depositi di kappa di IgG mascherati mostrano una colorazione granulare della membrana basale glomerulare per (a) SAP e (b) IgG. (c) C'è una forte colocalizzazione di SAP e IgG nei depositi della membrana basale glomerulare. (d-f) Gli esperimenti di immunofluorescenza eseguiti su un campione di biopsia renale da un paziente con 3 glomerulopatie membranose positive al recettore A2 delle fosfolipasi mostrano (d) colorazione negativa della membrana basale glomerulare per SAP e (e) colorazione positiva della membrana basale glomerulare granulare per IgG. (f) C'è una mancanza di colocalizzazione in questo paziente con glomerulopatie membranose associate al recettore delle 3 fosfolipasi A2. Per ottimizzare la visualizzazione di questa immagine, vedere la versione online di questo articolo nella Tabella 2|Risultati della colorazione della componente p dell'amiloide sierica (SAP) nelle biopsie renali

AA, amiloide A; AL, catena leggera amiloide; C3, complemento componente 3; GBM, membrana basale glomerulare; MG, glomerulopatia membranosa; MGMID, glomerulopatia membranosa con depositi di IgG kappa mascherati; MPGN, membranoproliferativo; glomerulonefrite; PGMNID, glomerulonefrite proliferativa con depositi monoclonali di IgG kappa; PLA2R, recettore della fosfolipasi A2; THSD7A, trombospondina di tipo 1 contenente dominio 7A.

DISCUSSIONE

MGMID è un modello di glomerulopatia recentemente descritto e unico caratterizzato da depositi subepiteliali e mesangiali che si colorano per IgG kappa da paraffina IF (Figura 3). I pazienti con questo pattern di glomerulopatia tendono ad essere donne giovani (età<40 years)="" and="" often="" have="" vague="" autoimmune="" phenomena.="" we="" report="" here="" the="" discovery="" by="" mass="" spectrometry="" of="" increased="" sap="" in="" the="" glomeruli="" of="" these="" patients="" and="" show="" positive="" staining="" for="" this="" protein="" in="" the="" glomerular="" deposits="" of="" 100%="" of="" cases="" diagnosed="" as="" mgmid.="" positive="" staining="" for="" sap="" was="" also="" tested="" in="" a="" wide="" variety="" of="" igmediated="" glomerulonephritis="" types="" and="" found="" to="" be="" present="" in="" 4="" of="" the="" 173="" cases="" tested="" that="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" or="" amyloidosis.="" all="" of="" these="" cases="" that="" stained="" positive="" for="" sap="" but="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" shared="" histopathologic="" fifindings="" with="" mgmid,="" including="" the="" pattern="" of="" immune="" deposition="" and="" igg1="" kappa="" restriction,="" only="" differing="" by="" the="" fact="" that="" they="" did="" not="" mask="" by="" routine="" immunofluorescence.="" additionally,="" these="" patients="" were="" demographically="" similar="" to="" mgmid="" patients="" in="" that="" they="" tended="" to="" be="" young="">

SAP è una proteina pentamerica 25-kDa all'interno della famiglia delle pentraxine che è codificata dal gene APCS ed è abbondante nel siero e come componente della membrana basale glomerulare.5 Sebbene l'esatta funzione di SAP non sia chiara, è nota per interagire nel plasma con un'ampia varietà di proteine, inclusi componenti del complemento, apolipoproteine ​​e regolatori della coagulazione e della proteolisi.6 Forma interazioni calcio-dipendenti stabili con i suoi ligandi, comprese proteine, lipoproteine ​​e DNA, proteggendoli dalla degradazione. SAP funge da molecola solubile di riconoscimento del pattern coinvolta nella risposta immunitaria innata, riconoscendo una varietà di pattern molecolari associati a patogeni e danni, inclusi componenti microbici e detriti cellulari apoptotici.7 L'interazione di SAP con agenti molecolari associati a patogeni o danni i modelli promuovono la clearance mediata dal complemento dei detriti cellulari apoptotici legandosi direttamente al componente 1q del complemento (C1q) e l'attivazione della via classica del complemento. Nonostante l'attivazione del complemento, è noto che SAP impartisce immunoregolazione, diminuendo i neutrofiliinfiammazioneall'interno dei tessuti attraverso una ridotta adesione endoteliale,8 ridotta funzione dell'elastasi9 e ridotto homing ai tessuti.10 SAP è anche noto per essere la principale proteina legante il DNA e la cromatina all'interno del plasma.11

Nella malattia, SAP è meglio conosciuto per essere una parte dei depositi di amiloidosi. Sebbene meno ben studiato, ci sono anche prove che potrebbe svolgere un ruolo nei modelli umani e animali di malattie autoimmuni. Anticorpi SAP sono stati identificati in pazienti conautoimmunemalattie, e l'espressione SAP ridotta ha dimostrato di promuovereautoimmunitànei modelli murini. Gli anticorpi contro SAP sono identificati nel 44% dei pazienti con lupus eritematoso sistemico, con titoli anticorpali correlati all'attività della malattia.12 È stato riscontrato che il deficit di SAP provoca lo sviluppo di autoimmunità spontanea nei topi C57BL/6 autoimmuni e nei topi non autoimmuni topi 129/Sv inclini quando incrociati con topi C57BL/6 (129/Sv x C57BL/6 F2)13 ma non nel solo ceppo 129/Sv, suggerendo che potrebbe essere necessaria una suscettibilità genetica sottostante affinché la carenza di SAP induca l'autoimmunità.14 Il i topi mostrano la produzione di anticorpi antinucleari, DNA anti-singolo filamento, anticorpi anti-DNA a doppio filamento e fattori reumatoidi. Sviluppano un proliferativoimmuneglomerulonefrite mediata da complessi, più spesso nelle femmine.13 In un modello murino di nefrite lupica in cui la glomerulonefrite è indotta dall'iniezione di auto-DNA attivato nel siero, la terapia genica SAP da parte di un vettore plasmidico ha ridotto la produzione di anticorpi anti-DNA a doppio filamento , deposizione di immunocomplessi e infiammazione renale e ha impedito l'insorgenza della nefrite lupica.15

Figura 3|Risultati della biopsia renale nella glomerulopatia simil-membranosa con depositi di kappa di IgG mascherati. Le microfotografie dalla biopsia mostrata nella Figura 2 sono mostrate qui. (a) Sono presenti picchi segmentali lungo le membrane basali glomerulari, da macchia d'argento Jones metenamina (ingrandimento originale × 400). (b) La microscopia elettronica rivela depositi subepiteliali presenti lungo la membrana basale glomerulare (ingrandimento originale × 12,000). (c) Colorazione di glomeruli negativa per IgG mediante immunofluorescenza di routine su tessuto fresco (immunofluorescenza diretta; ingrandimento originale × 400). (d) I glomeruli dello stesso caso sono positivi sul tessuto incluso in paraffina dopo la digestione della proteasi (immunofluorescenza diretta; ingrandimento originale × 400). (e) Glomeruli mostra la colorazione per kappa e (f) non lambda sul tessuto incluso in paraffina digerito con proteasi (immunofluorescenza diretta; ingrandimento originale × 400). Per ottimizzare la visualizzazione di questa immagine, consultare la versione online di questo articolo su www.rene-international.org.

Nonostante la restrizione della catena leggera osservata sulla biopsia, attualmente non ci sono prove che questa entità sia associata a disordini linfoproliferativi sottostanti o a Igs monoclonali circolanti.4 Pertanto, MGMID non dovrebbe essere considerato all'interno dello spettro della gammapatia monoclonale di importanza renale in questo volta. Anche il ruolo degli autoanticorpi SAP è incerto. A differenza di altre forme di glomerulopatia membranosa con una proteina specificatamente presente nei depositi immunitari, come la malattia associata a PLA2R,16 MGMID non sembra essere guidato da autoanticorpi diretti contro SAP, poiché non siamo riusciti a rilevare la reattività degli anticorpi sierici contro SAP nei pazienti con MGMID . Una spiegazione alternativa è che l'IgG kappa è presente come risultato della normale interazione tra queste 2 proteine ​​piuttosto che un'interazione autoimmune antigene-anticorpo, poiché la catena Ig kappa è nota per essere una parte del normale interactome della SAP sierica.6 Pertanto, sebbene utile per la diagnostica tissutale di questa entità, il test per gli anticorpi SAP nel siero non serve come diagnostica non invasiva in questo momento e il driver alla base di questa malattia rimane un mistero.

Gli esiti clinici in MGMID sono estremamente variabili e vanno dalla remissione spontanea alla progressione allo stadio terminalerenepatologiacon recidiva nel trapianto. L'analisi retrospettiva non è riuscita a mostrare alcuna associazione tra il trattamento utilizzato e l'esito clinico.4 La scoperta del coinvolgimento della SAP in questa malattia ha potenzialmente implicazioni per la terapia. I trattamenti mirati direttamente a SAP hanno mostrato risultati promettenti nel trattamento dell'amiloidosi.17,18 Inoltre, i risultati della spettrometria di massa indicano che le terapie mirate alla cascata del complemento potrebbero essere utili nel trattamento di questa forma di glomerulonefrite, dato che la maggior parte delle proteine ​​che sono state aumentate in MGMID i glomeruli sono correlati al complemento. Sono necessari ulteriori studi per identificare i biomarcatori di attività per questa malattia, così come le terapie.

Il motivo del mascheramento dei depositi immunitari nelle biopsie MGMID sull'immunofluorescenza di routine rimane un mistero. La presenza di SAP nei depositi solleva nuove possibili spiegazioni per questo fenomeno nei casi di MGMID. Ad esempio, è noto che le interazioni della proteina SAP sono fortemente Ca2þ-dipendenti,6 e molti dei mezzi di trasporto e dei tamponi utilizzati nell'elaborazione del tessuto bioptico renale per l'immunofluorescenza sono privi di Ca2þ. Questa assenza in vitro di Ca2þ potrebbe causare l'interruzione dei depositi immunitari in modo che non siano più disponibili per il rilevamento mediante immunofluorescenza sul tessuto congelato. Tuttavia, i depositi di immunocomplessi rimarrebbero disponibili per il rilevamento nel tessuto fissato in formalina come risultato dei legami chimici covalenti indotti dalla formalina tra le proteine ​​​​nel tessuto.

Descriviamo qui, per la prima volta, la presenza unica di SAP nei depositi glomerulari di MGMID. Inoltre, mostriamo quella colorazione direnebiopsieper SAP identifica casi con caratteristiche clinicopatologiche simili a quelle in MGMID, senza mascheramento, mediante immunofluorescenza di routine. Dati questi risultati, riteniamo che la colorazione positiva all'interno dei depositi glomerulari per SAP identifichi una forma unica di glomerulonefrite che condivide un meccanismo fisiopatologico comune della malattia. Fino alla recente descrizione della MGMID, questi casi sono stati diagnosticati in numerose categorie disparate che vanno dalla glomerulopatia C3 alla glomerulonefrite associata a infezione alla glomerulopatia membranosa atipica.1 La rapida evoluzione dei criteri diagnostici e la nostra comprensione di questa forma di glomerulonefrite evidenziano il potere della massa spettrometria per fornire informazioni fisiopatologiche sulla glomerulonefrite immuno-mediata.

METODI

Tecniche di elaborazione della biopsia renale

Sono state utilizzate tecniche standard di elaborazione della biopsia renale, inclusa la microscopia ottica, l'immunofluorescenza e la microscopia elettronica.19,20 Tutti i campioni di microscopia ottica sono stati colorati con ematossilina ed eosina, argento di Jones metenamina, tricromo di Masson e reagente acido periodico-Schiff. Tutte le sezioni di immunofluorescenza diretta sono state tagliate a 4 mm e fatte reagire con anticorpi antiumani di coniglio policlonali marcati con fluoresceina contro IgG, IgA, IgM, C3, C1q, fibrinogeno e catene k- e l-leggere (Dako, Carpenteria, CA) per 1 ora e risciacquato; un vetrino coprioggetto è stato applicato utilizzando mezzi di montaggio acquosi. Casi selezionati sono stati colorati per anticorpi anti-umani di topo policlonale marcati con fluoresceina contro IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). L'immunofluorescenza della paraffina è stata eseguita dopo la digestione della proteasi come descritto in precedenza.2,3 Un totale di 9 biopsie MGMID e 8 biopsie di controllo di confronto con glomerulopatia membranosa di altri tipi sono state selezionate per l'analisi della spettrometria di massa. Il protocollo di studio è stato approvato dal Solutions Institutional Review Board ed è conforme ai principi della Dichiarazione di Helsinki.

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Spettrometria di massa di glomeruli microdissezionati a cattura laser

Il tessuto bioptico renale da tessuto incluso in paraffina fissato in formalina è stato tagliato a uno spessore di 1 0 mm su vetrini con membrana Leica PET (Leica, Wetzlar, Germania). Questi vetrini sono stati poi colorati con ematossilina. I glomeruli sono stati microdissezionati in provette per microcentrifuga utilizzando un microscopio Leica DM60{{20}}}0B. I glomeruli microdissezionati sono stati lisati in sodio dodecil solfato al 2% e ditiotreitolo 0,1 M a 99 gradi per 1 ora ed elaborati mediante preparazione del campione assistita da filtro (FASP).21 Il lisato chiarificato è stato trasferito su concentratori Vivacon 500 (MWCO di 30 kDa; Sartorius , Gottinga, Germania). Il solfato di sodio dodecil è stato rimosso mediante lavaggi ripetuti con urea 8 M in tris(idrossimetil)-amminometano/Cl 0,1 M, pH 8,5; i campioni sono stati quindi alchilati con iodoacetammide 0,05 M. La iodoacetammide è stata rimossa mediante 3 lavaggi con urea 8 M/tris(idrossimetil)-amminometano/Cl 0,1 M, pH 8,5, seguiti da 3 lavaggi con bicarbonato di ammonio 0,05 M. Le proteine ​​sono state digerite con tripsina (grado di sequenziamento, Promega, Madison, WI) con un rapporto peso/peso di 40:1 a 37 gradi per 16 ore. I peptidi sono stati raccolti mediante centrifugazione e dissalati su punte C18- Stage (Thermo Scientific, Waltham, MA).

I peptidi digeriti sono stati analizzati mediante spettrometria di massa NanoLC-tandem utilizzando uno spettrometro di massa Thermo Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific). I peptidi sono stati caricati su una colonna a trappola a fase inversa (Integra-frit, New Objective, Woburn, MA) contenente 2,5 mm di resina ibrida di superficie caricata da Waters XSelte (Waters Corp., Milford, MA) accoppiata a una resina ibrida di 150 mm X 0.0Colonna analitica da 75 mm contenente la stessa resina in fase inversa utilizzata nella trappola. È stato quindi utilizzato un sistema di cromatografia liquida ultraperformance nanoAcquity (Waters Corp.) per generare un 60-gradiente minuto da 98:2 a 60:40 rapporto tampone A:B (tampone A ¼ 0,1% di acido formico , 0,5 percento di acetonitrile; tampone B ¼ 0,1 percento di acido formico, 99,9 percento di acetonitrile).

I peptidi sono stati eluiti dalla colonna con un ugello spray integrato (Picofrit, nuovo obiettivo) e ionizzati mediante elettrospray (2.0 kV) seguito da analisi di spettrometria di massa tandem utilizzando la dissociazione indotta da collisione a energia più elevata (HCD). Le scansioni di indagine dei precursori peptidici sono state eseguite con una risoluzione di 240 K (a 400 m/z) con un target di conteggio ionico 5 × 10⁵. La spettrometria di massa in tandem è stata eseguita mediante isolamento a 1,6 Th con il quadrupolo, la frammentazione dell'HCD con un'energia di collisione normalizzata di 30 e l'analisi della spettrometria di massa a scansione rapida nella trappola ionica. I dati ottenuti dalla spettrometria di massa in tandem sono stati ricercati rispetto al più recente database umano Uniprot contenente sia le voci Swiss Prot che TREMBLE utilizzando

MaxQuant (Istituto Max Planck di Biochimica, Planegg, Germania). La visualizzazione dei dati è stata eseguita utilizzando Scaffold v4.6 (Proteome Software, Portland, OR). Il tasso di falsa scoperta è stato fissato all'1 percento per le corrispondenze peptide-spettro. Per la quantificazione sono stati utilizzati i valori iBAQ normalizzati di MaxQuant. Le distribuzioni iBAQ per ciascun campione sono state aggiustate per la mediana per controllare le differenze di caricamento. I valori iBAQ uguali a zero sono stati rimossi dal set di dati. Per il test di ipotesi statistiche, è stato eseguito un 2-test t di Welch campione per ciascuna proteina utilizzando valori iBAQ normalizzati per i 2 gruppi. Se una proteina è stata rilevata solo in un gruppo, è stato eseguito un 1-test t di Welch campione, utilizzando il valore iBAQ più piccolo rilevato come ipotesi nulla.

Colorazione SAP

Le sezioni fissate in formalina e incluse in paraffina, tagliate a 3 mm, sono state deparaffifinite e il recupero dell'antigene è stato eseguito a 99 gradi. Le sezioni sono state fatte reagire con un anticorpo policlonale di coniglio anti-SAP policlonale (1:400; ThermoFisher, Waltham, MA) seguito da un secondario anti-coniglio di capra coniugato con X rosso rodamina che è stato adsorbito in fase solida per garantire una reazione crociata minima con l'uomo IgG (1:100; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pennsylvania). Ogni caso è stato eseguito con controlli positivi e negativi. La colorazione è stata valutata mediante microscopia a immunofluorescenza standard. È stato giudicato positivo se c'era una colorazione positiva dell'ansa capillare granulare nei glomeruli e negativa se non c'era un'ansa capillare

colorazione nei glomeruli. La colocalizzazione di IgG e SAP nelle membrane basali glomerulari è stata esaminata mediante microscopia confocale utilizzando un microscopio a scansione laser confocale Zeiss LSM 880 (Zeiss Microscopy, Jena, Germania). Per questa analisi, le IgG antiumane di coniglio policlonale (coniugato con isotiocianato di flfluoresceina) (1:40; Agilent, Santa Clara, CA) sono state fatte reagire con il tessuto recuperato dal calore dopo la colorazione per SAP come descritto sopra. Sono stati eseguiti controlli negativi per garantire la specificità dell'anticorpo omettendo gli anticorpi primari. Quattro casi di MGMID sono stati testati per la presenza di HP1BP3 (1:100; Thermo Fisher, Waltham, MA) mediante colorazione con immunoperossidasi.

Test per gli anticorpi sierici contro SAP

La proteina SAP (R&D Systems, Minneapolis, MN; {{0}}SAB-050) è stata diluita a 3 ng/ml in tampone carbonato-bicarbonato (pH 9,6) e rivestita su un {{ 6}}piastra bene Immulon H2 (Thermo Scientific) per una notte a 4 gradi . Le piastre sono state lavate x3 utilizzando 200 ml di tampone di lavaggio (1 × soluzione salina tamponata con fosfato e 0,05 percento di tween) e bloccate per 2 ore con tampone bloccante (1 × soluzione salina tamponata con fosfato, 0,05 percento tween, 1% di gelatina di pesce). Le piastre sono state quindi lavate × 3 con 200 ml di tampone di lavaggio. Venti microlitri di siero diluito (1:100 in tampone di lavaggio) sono stati aggiunti per pozzetto e incubati per 2 ore a temperatura ambiente. Le piastre sono state lavate × 7 con 200 ml di tampone di lavaggio seguito dall'aggiunta dell'anticorpo di rilevamento, IgG-HRP anti-umano (Jackson ImmunoResearchLaboratories; 309-035-003). Le piastre sono state lavate × 7 con 200 ml di tampone di lavaggio. Successivamente, il substrato di 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina perossidasi e il substrato di perossidasi Sol B sono stati miscelati in un rapporto 1:1 e 100 ml sono stati aggiunti alla piastra. La reazione è stata interrotta aggiungendo 100 ml di H2SO4 2M, lasciato sul banco per 20 minuti prima della lettura a 450 nm. Per il controllo per garantire che la proteina SAP sia legata alla piastra, abbiamo utilizzato anti-SAP di coniglio (Invitrogen, Carlsbad, CA; PA1-28361) in una diluizione seriale seguita da IgG-HRP anti-coniglio (Jackson ImmunoResearch Laboratories ; 111-035-144). Il controllo ha mostrato una buona correlazione tra la diluizione dell'anticorpo e l'assorbanza, con un valore medio R quadrato di 0,95.

Cistanche per migliorarerenefunzione

CHIARIMENTI

Tutti gli autori non hanno dichiarato interessi concorrenti.

SUPPLEMENTARE

MATERIALE File Supplementare (PDF)

Figura S1. Immagini rappresentative della colorazione SAP glomerulare da una varietà di malattie renali.

Figura S2. Studi di sieroreattività anti-SAP mediante test di immunoassorbimento enzimatico.

Tabella S1. Tutte le Ig identificate dalla spettrometria di massa nei glomeruli microdissezionati con acquisizione laser da casi di glomerulopatia membranosa con depositi di IgG kappa.

Tabella S2. I conteggi spettrali di un campionamento di tutte le proteine ​​hanno mostrato un aumento dell'abbondanza di $1 log2 nei campioni MGMID e un valore P # 0.1.

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