Il metabolismo del glutatione contribuisce all'induzione dell'immunità allenata

Astratto:

Il sistema immunitario innato mostra caratteristiche di memoria eterologa, che sono caratterizzate da risposte più forti a una sfida secondaria. Questo fenomeno chiamato immunità addestrata si basa sul ricablaggio epigenetico e metabolico delle cellule immunitarie innate. Poiché la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) è stata associata al fenotipo dell'immunità addestrata, abbiamo ipotizzato che l'aumento dei livelli di ROS e la principale molecola redox intracellulare glutatione svolgano un ruolo nell'induzione dell'immunità addestrata. Qui mostriamo che l'inibizione farmacologica dei ROS in un modello in vitro di immunità addestrata non ha influenzato la reattività cellulare; la modulazione dei livelli di glutatione ha ridotto la produzione di citochine pro-infiammatorie nei monociti umani. Si è scoperto che i polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) nei geni coinvolti nel metabolismo del glutatione sono associati a cambiamenti nella capacità di produzione di citochine proinfiammatorie dopo l'immunità allenata.

Inoltre, le concentrazioni plasmatiche di glutatione sono state positivamente associate alla produzione ex vivo di IL-1, un biomarcatore dell'immunità allenata, prodotto dai monociti di individui vaccinati con BCG. In conclusione, il metabolismo del glutatione è coinvolto nell'induzione dell'immunità allenata e sono necessari studi futuri per esplorare le sue conseguenze funzionali nelle malattie umane.

L'immunità umana è molto importante perché ci protegge da malattie e infezioni. Il sistema immunitario è un sistema complesso composto da molte cellule, tessuti e organi diversi. Lavorano insieme per affrontare vari agenti patogeni all'interno e all'esterno. Nella ricerca, abbiamo scoperto che Cistanche deserticola polisaccaride e verbascoside possono migliorare l'attività degli enzimi del tessuto cardiaco e cerebrale e rafforzare la cavità addominale. La funzione fagocitaria delle cellule e la risposta proliferativa dei linfociti hanno evidenti effetti sul miglioramento dell'immunità.

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Parole chiave:

glutatione; immunità allenata; macrofagi; metabolismo; memoria immunitaria innata.

1. Introduzione

Fino a poco tempo fa, si pensava che l'immunità adattativa fosse l'unico componente della difesa dell'ospite caratterizzato dalla capacità di conservare la memoria, adattando le risposte delle cellule T e B a uno specifico antigene.

Tuttavia, un numero crescente di ricerche recenti ha anche attribuito caratteristiche di memoria eterologa al sistema immunitario innato, un processo chiamato immunità addestrata [1]. I monociti esposti per un breve periodo a Candida albicans, il componente della parete cellulare fungina -glucano, o anche a stimoli sterili come lipoproteine ​​a bassa densità ossidate (ox-LDL), mostrano una maggiore produzione di citochine pro-infiammatorie su una stimolazione secondaria non correlata molto tempo dopo il lo stimolo iniziale è stato rimosso [2,3].

Inoltre, studi epidemiologici hanno dimostrato che la vaccinazione contro la tubercolosi con Bacillus Calmette-Guérin (BCG) aumenta la funzione antimicrobica delle cellule immunitarie innate, inducendo successivamente una protezione non specifica contro le infezioni non correlate e diminuendo la mortalità per tutte le cause [4].

L'immunità addestrata è radicata nei cambiamenti epigenetici che modulano l'accessibilità dei geni della risposta pro-infiammatoria per il meccanismo trascrizionale della cellula. Il ricablaggio epigenetico nelle cellule immunitarie innate addestrate è accompagnato da cambiamenti metabolici che promuovono percorsi come la glicolisi, la fosforilazione ossidativa e la biosintesi del colesterolo [5,6]. I metaboliti derivati ​​da questi percorsi segnalano molecole e cofattori che possono a loro volta modulare l'attività degli enzimi modificanti la cromatina. Il glutatione (GSH) è il principale antiossidante che preserva l'equilibrio redox intracellulare ed è stato suggerito che contribuisca ai cambiamenti epigenetici [7].

Inoltre, gli stimoli che inducono l'immunità allenata, come BCG e oxLDL, aumentano la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) dei macrofagi dopo stimolazione secondaria [8-10]. Abbiamo ipotizzato che l'aumento dell'attività metabolica dei macrofagi addestrati aumenterebbe anche i livelli di ROS e modulerebbe il GSH, che a sua volta influenzerebbe la forza delle risposte immunitarie addestrate.

2. Materiali e metodi

2.1. Isolamento di cellule mononucleari del sangue periferico umano (PBMC) e monociti

Buffy coat da donatori sani sono stati ottenuti dopo il consenso informato scritto (Sanquin Blood Bank, Nijmegen, Paesi Bassi). L'approvazione etica è stata ottenuta dal CMO Arnhem-Nijmegen (NL32 357.091.10). L'isolamento è stato eseguito mediante centrifugazione a densità differenziale su Ficoll-Paque (GE Healthcare, Chalfont St Giles, Regno Unito). Successivamente, l'isolamento dei monociti è stato eseguito con una centrifugazione in gradiente di densità Percoll iperosmotico (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) e lavato una volta con soluzione salina tamponata con fosfato freddo (PBS) priva di pirogeni. Le cellule sono state risospese e successivamente coltivate in terreno modificato olandese RPMI 1640 (Invitrogen, Waltham, MA, USA) integrato con 5 µg/mL di gentamicina (Centraform, Etten-Leur, Paesi Bassi), 2 mM Glutamax (Gibco, Waltham, MA, USA ) e 1 mM di piruvato (Gibco). Per garantire la massima purezza, i monociti isolati da Percoll sono stati lasciati aderire a piastre a fondo piatto di polistirene (Corning, Sigma-Aldrish, New York, NY, USA) per 1 ora a 37 ◦C 5% CO2 e poi lavati una volta con PBS caldo.

2.2. Modello di immunità addestrato in vitro

I monociti aderenti sono stati coltivati ​​come precedentemente descritto [11]. In breve, 105 monociti sono stati seminati su piastre 96-pozzetti a fondo piatto (Greiner, Kremsmünster, Austria) e incubati con 1 µg/mL di -glucano o 5 µg/mL di vaccino BCG (InterVax, Toronto, ON, Canada) in RPMI con il 10% di siero umano in pool. -1,3-(D)-glucano ( -glucano) da Candida albicans è stato gentilmente fornito dal Professor David Williams (College of Medicine, Johnson City, TN, USA).

Quando indicato, le cellule sono state preincubate con {{0}}.5µM difenileneiodonio (DPI), 50 µM a-tocoferolo (AT) (Sigma-Aldrich), 0,5 µM acido ascorbico (AA), 1 mM N-acetil cisteina (NAC) (Sigma-Aldrich) o 100 µM DL-butionina sulfoximina (BSO) (Sigma-Aldrich) per 1 ora prima dell'aggiunta di -glucano. Dopo 24 ore, le cellule sono state lavate una volta con PBS caldo e lasciate differenziare in RPMI integrato con il 10% di siero umano in pool per 5 giorni. Il mezzo è stato aggiornato il giorno 3 della coltura. Al giorno 6, i macrofagi sono stati restimolati con 10 ng/mL di lipopolisaccaride di Escherichia coli (LPS; sierotipo 055:B5, Sigma-Aldrich) per ulteriori 24 ore.

2.3. Quantificazione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS).

I monociti/macrofagi sono stati coltivati ​​per 2 ore, 24 ore o 6 giorni, lavati, staccati con PBS freddo e incubati con 5 µM H2DCFDA (Life Technologies, Waltham, MA, USA) in PBS per 30 min a 37 ◦C. Le cellule sono state analizzate mediante citometria a flusso (CytoFlex, Beckman Coulter, Brea, CA, USA). L'analisi dei dati è stata eseguita utilizzando il software Kaluza 2.1. Gli aggregati cellulari sono stati eliminati in base all'altezza della dispersione in avanti (FSC) rispetto al grafico dell'area FSC e la popolazione di monociti/macrofagi è stata controllata in base all'FSC e alla dispersione laterale (SSC). I dati sono presentati come media ± SEM e analizzati con il test di Friedman seguito dai test di confronto multiplo di Dunn. Un p-value inferiore a 0.05 è stato considerato statisticamente significativo, come indicato dagli asterischi (* p < 0,05).

2.4. Dati di sequenziamento dell'RNA di monociti umani stimolati in vitro

L'analisi dell'espressione genica dei monociti esposti in vitro a -glucano è stata eseguita utilizzando dati RNA-seq precedentemente pubblicati [12]. In breve, i PBMC sono stati isolati mediante centrifugazione in Ficoll-Paque (GE Healthcare). I monociti sono stati purificati utilizzando la selezione negativa con perline per cellule positive CD3 plus (cellule T), CD19 plus (cellule B) e CD56 plus (cellule NK) (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germania). Le cellule sono state coltivate seguendo il modello di immunità addestrato in vitro descritto ed esposte a 5 µg/mL -glucano. I monociti sono stati raccolti a 4 ore e 24 ore dopo l'esposizione. I geni correlati alla risposta antiossidante e al metabolismo del glutatione sono stati estratti dall'elenco di geni significativamente dinamici (p <0.05, FC > 2,5, RPKM > 1) nel modello di immunità addestrato da monociti a macrofagi in vitro. I dati sono presentati come log10 del rapporto tra monociti trattati con -glucano e monociti non stimolati.

2.5. Quantificazione del glutatione

L'analisi quantitativa del glutatione intracellulare ridotto (GSH) e ossidato (GSSG) è stata eseguita utilizzando la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) come precedentemente descritto [13].

In breve, il mezzo di crescita è stato rimosso e le cellule in coltura sono state lavate con PBS caldo (37 °C) e spente con azoto liquido per arrestare il metabolismo. Le cellule sono state successivamente raschiate via dalle piastre ed estratte utilizzando una soluzione fredda (−80 ◦C) di metanolo/cloroformio/acqua, 8.1:0.9:1 (vol/vol/vol) . Gli estratti sono stati mantenuti congelati su ghiaccio secco per almeno 30 min e successivamente centrifugati per 20 min a 18,{{1{{30}}}× g a -4 ◦C. Il pellet proteico è stato conservato per la quantificazione delle proteine ​​mentre i surnatanti contenenti i metaboliti intracellulari sono stati essiccati sotto un leggero flusso di azoto e i campioni NMR sono stati preparati sciogliendo il materiale essiccato con 0,22 mL di tampone fosfato 0,15 M (pH 7,4) in acqua deuterata contenente 0,05 sale sodico mM trimetilsilil propionico-d4- come standard interno per la referenziazione e la quantificazione NMR. Uno spettro NMR 1D 1H è stato raccolto per ciascun campione su un NMR Bruker Avance II da 14,1 T (600 MHz per 1H), utilizzando la sequenza di impulsi noesygppr1d (Topspin v3.0, Bruker Biospin Ltd, Karlsruhe, Germania). Tutti gli spettri sono stati elaborati e importati nella suite Chenomx NMR 8.4 (suite Chenomx NMR, v8.0, Edmonton, AB, Canada) per la quantificazione del glutatione.

Tutte le concentrazioni sono state normalizzate alla massa proteica totale di ciascun campione. Quest'ultimo è stato quantificato sciogliendo il pellet proteico in tampone (1:1, 1% SDS: 8M Urea (0.25M Tris pH:8)) con sonicazione. La concentrazione proteica è stata quindi misurata utilizzando il kit di analisi proteica PierceTM BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) secondo il suo manuale.

2.6. Modelli di immunità addestrati in vitro e in vivo per l'analisi genetica e metabolica

Nel modello in vitro, i monociti aderenti sono stati incubati con terreno di coltura solo come controllo negativo, 2 µg/mL di -1,3-(D)-glucano o 5 µg/mL BCG (coorte 300BCG : ceppo BCG-Bulgaria, Intervax, Canada), per 24 ore a 37 °C in presenza di un pool di siero umano al 10%. Il giorno 6, le cellule sono state nuovamente stimolate per 24 ore con 200 µL di RPMI o LPS 10 ng/mL (sierotipo 055: B5; Sigma-Aldrich).

Nel modello in vivo, adulti sani sono stati vaccinati con una dose standard di 0.1 ml di BCG per via intradermica nella parte superiore del braccio sinistro e il sangue è stato raccolto prima e 14 e 90 giorni dopo la vaccinazione. In ogni visita, 5 × 105 PBMC sono state stimolate con Staphylococcus aureus ucciso dal calore (106 CFU/mL) o lasciate non stimolate a 37°C con il 5% di CO2. Le citochine secrete sono state misurate in entrambi i modelli dopo 24 ore di stimolazione e l'aumento della risposta delle citochine indotto dagli stimoli di allenamento è stato utilizzato come misura per l'immunità allenata [14].

2.7. Analisi genetica

L'analisi genetica è stata eseguita utilizzando una coorte di individui sani di discendenza dell'Europa occidentale dal progetto Human Functional Genomics [15]. La coorte 300BCG è composta da 325 adulti provenienti dai Paesi Bassi (44% maschi e 56% femmine, fascia di età 18-71 anni). Lo studio è stato approvato dal comitato etico locale CMO region Arnhem-Nijmegen, NL58553.091.16. I campioni di DNA di individui (n=325) sono stati genotipizzati utilizzando il chip SNP disponibile in commercio, Infinium Global Screening Array MD v1.0 di Illumina. 0.7.0 ottico con impostazioni predefinite è stato utilizzato per l'identificazione del genotipo [16]. Sono stati esclusi i campioni con un call rate inferiore o uguale a 0.99, così come le varianti con equilibrio di Hardy-Weinberg (HWE) inferiore o uguale a 0,0001 e frequenza allelica minore (MAF) inferiore o uguale a a 0,001. I filamenti di varianti sono stati allineati e identificati rispetto al pannello di riferimento di 1000 genomi utilizzando Genotype Harmonizer [17]. Abbiamo quindi imputato i campioni sul server di imputazione del Michigan utilizzando il consorzio di riferimento umano (HRC r1.1 2016) come pannello di riferimento e abbiamo filtrato le varianti genetiche con un R2 <0,3 per la qualità dell'imputazione e MAF <5 percento [18], risultando in circa 4 milioni di polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) per la mappatura QTL di follow-up. Sia i dati del genotipo che quelli delle citochine sulle risposte immunitarie addestrate in vitro sono stati ottenuti per un totale di 267 individui dalla coorte di 300 BCG. Tre campioni sono stati esclusi a causa dell'uso di farmaci (di cui uno identificato come valore anomalo genetico) e un campione era dovuto all'insorgenza del diabete di tipo 1 durante lo studio.

In primo luogo, il cambiamento di piega della produzione di citochine tra cellule addestrate e non addestrate è stato preso come misura per l'entità della risposta immunitaria addestrata. Dopo il controllo di qualità per la distribuzione delle citochine e dopo aver escluso i valori anomali genetici, abbiamo mappato i cambiamenti di piega trasformati in log della produzione di citochine ai dati del genotipo utilizzando un modello di regressione lineare con età e sesso come covariate per correggere le distribuzioni del cambiamento di piega della produzione di citochine. Abbiamo utilizzato un cutoff di p <9, 99 × 10-3 per identificare suggestive associazioni di loci di tratto quantitativo (QTL) che influenzano le risposte immunitarie addestrate. Utilizzando il modello di immunità addestrato in vivo, sono stati ottenuti sia i dati del genotipo che quelli delle citochine per un totale di 296 individui.

Oltre ai valori anomali descritti per la mappatura QTL in vitro, sono stati esclusi 18 individui vaccinati la sera, risultando in 278 campioni prima della mappatura QTL. In primo luogo, i livelli di citochine grezze sono stati trasformati in log e i rapporti di produzione di citochine tra le visite sono stati presi come il cambiamento di piega della produzione di citochine. Il cambiamento di piega della produzione di citochine è stato mappato ai dati del genotipo utilizzando un modello di regressione lineare con età e sesso come covariate. Abbiamo utilizzato un limite di p <9, 99 × 10-3 per identificare associazioni QTL suggestive che influenzano le risposte immunitarie addestrate. Il pacchetto R Matrix-eQTL è stato utilizzato per la mappatura QTL delle citochine [19].

2.8. Analisi Metabolomica

I livelli di metaboliti degli individui della coorte di 300 BCG sono stati misurati prima della vaccinazione con BCG. Le caratteristiche metaboliche sono state misurate e annotate dal General Metabolics (Zurigo, Svizzera) utilizzando la spettrometria di massa a tempo di volo a iniezione di flusso (TOF-M a iniezione di flusso) [20]. I metaboliti non mirati sono stati annotati secondo il database dei metaboliti umani (HMDB). Tutte le misurazioni metabolomiche sono state eseguite in duplicati e il valore medio è stato calcolato per ciascun campione per metabolita. L'analisi di correlazione di Spearman è stata eseguita sui metaboliti e sui cambiamenti di piega delle citochine ex vivo sulle risposte prima della vaccinazione. Per testare la relazione tra i livelli di glutatione e gli SNP di interesse identificati nell'analisi genetica, è stata eseguita un'analisi di regressione lineare con età e sesso inclusi come covariate per ciascun SNP.

2.9. Quantificazione e analisi delle citochine

La produzione di citochine è stata determinata utilizzando kit ELISA commerciali per IL{{0}}, IL-6 e TNF (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) seguendo le istruzioni del produttore. I dati sono presentati come media ± SEM e analizzati con misure ripetute a due vie ANOVA seguite dai test di confronto multipli di Sidak. Un valore p inferiore a 0.05 è stato considerato statisticamente significativo, come indicato dagli asterischi (* p <0,05).

3. Risultati

3.1. L'immunità addestrata indotta da glucano e BCG innesca una produzione sostenuta di specie reattive dell'ossigeno

L'aumento del rilascio di ROS è stato precedentemente descritto come una caratteristica del fenotipo dell'immunità allenata [21]. I monociti esposti a -glucano o BCG per 2 ore e 24 ore mostrano un aumento dei ROS. È interessante notare che questo aumento è stato sostenuto e presente dopo 5 giorni di riposo nei mezzi di coltura (Figura 1A). Livelli di ROS potenziati sono accompagnati da cambiamenti trascrizionali di diversi geni antiossidanti nei monociti esposti a -glucano per 24 ore (Figura 1B). La superossido dismutasi mitocondriale SOD2 e diverse molecole contenenti tiolo sono sovraregolate, vale a dire la perossido reduttasi dipendente dalla tioredossina 1-6 (PRDX 1-6) e la sulfiredossina 1 (SRXN1). Anche l'espressione di tioredossina (TXN) e tioredossina reduttasi (TXNRD), rilevanti spazzini di ROS contenenti tiolo, è aumentata.

Figura 1. L'aumento dei livelli di ROS dei monociti addestrati non contribuisce alla loro maggiore produzione di citochine proinfiammatorie. (A) Livelli di ROS a 2 ore, 24 ore e 6 giorni dopo l'esposizione dei monociti a -glucano e BCG (n=6/9 donatori, raccolti da 2/3 esperimenti indipendenti. Test di Fridman test di confronto multiplo di Dunn) . (B) Livelli di espressione dei geni coinvolti nella difesa antiossidante nei monociti esposti a -glucano per 24 ore rispetto alle cellule non stimolate. L'espressione è presentata come log10(rapporto). TNF e IL-6 prodotti da macrofagi addestrati con -glucano dopo un pretrattamento di 1 h con (C) 0.5µM DPI (n=6 donatori, raggruppati da 2 esperimenti indipendenti) e (D ) 1 mM NAC, 50 µM AT o 0,5 µM AA (n=6 donatori, raccolti da due esperimenti indipendenti, ANOVA a due vie, test di confronti multipli di Sidak). (media ± SEM, * p <0,05).

Tuttavia, né l'inibizione del principale produttore di ROS NADPH ossidasi con difenileniodonio (DPI) né l'aggiunta delle molecole antiossidanti -tocoferolo (AT) e acido ascorbico (AA) prima dell'incubazione con -glucano, hanno modulato l'aumentata reattività dei macrofagi. Nei macrofagi esposti alla secrezione di -glucano, TNF e IL-6 24 ore dopo che la restimolazione di LPS non è stata modificata da questo approccio farmacologico (Figura 1C, D).

Tuttavia, l'esposizione al solo DPI ha aumentato la produzione di IL-6 dopo la stimolazione con LPS. (Figura 1C). Il pretrattamento con il generale ROS scavenger N-acetil cisteina (NAC) ha causato una diminuzione della produzione di TNF e IL -6 rispetto alle cellule esposte al solo glucano (Figura 1D). Presi insieme, dimostriamo che l'aumento della produzione di ROS gioca un ruolo minore nell'aumento della produzione di citochine dell'immunità addestrata indotta da -glucano. Inoltre, l'immunità allenata sostenuta da livelli aumentati di ROS potrebbe essere alleata alla modulazione del glutatione antiossidante cellulare, poiché il NAC non è solo uno scavenger di ROS ma può anche agire come precursore per la sintesi del glutatione.

3.2. Il metabolismo del glutatione influenza le risposte immunitarie addestrate

I monociti esposti a -glucano per 24 ore mostrano livelli più elevati della forma ossidata di glutatione (GSSG), che è dai livelli di ROS più elevati trovati in questo momento (Figura 2A). Dopo il periodo di riposo, la forma ridotta del glutatione (GSH) tende ad aumentare nei macrofagi allenati, senza alterazione delle concentrazioni della forma ossidata.

Figura 2. I livelli di glutatione sono modulati dall'esposizione al -glucano. (A) Livelli intracellulari di glutatione ridotti e ossidati nei monociti dopo 24 ore di esposizione con 1 µg/mL -glucano e 5 giorni dopo il periodo di riposo (n=4 donatori, riuniti da due esperimenti indipendenti). (B) Espressione di geni coinvolti nel metabolismo del glutatione in monociti esposti a -glucano per 4 ore e 24 ore. L'espressione è presentata come log10(rapporto). (C) TNF e IL-6 prodotti da macrofagi addestrati con -glucano dopo un pretrattamento di 1 h con 100 µM BSO (n=9 donatori, raggruppati da tre esperimenti indipendenti, * p <0,05 ANOVA a due vie , test di confronti multipli di Sidak) (media ± SEM).

I geni che codificano per le subunità dell'enzima limitante la velocità glutammato cisteina ligasi (GCLC e GCLM) mostrano una maggiore espressione a 4 ore dopo la stimolazione del -glucano rispetto ai monociti di controllo. Anche la glutatione reduttasi (GSR), la glutatione perossidasi 7 (GPX7) e gli enzimi della famiglia della glutaredossina (GLRX, 2, 5) sono sovraregolati al punto temporale di 24 ore (Figura 2B), suggerendo non solo un aumento della sintesi ma anche una maggiore tasso di riciclaggio del glutatione. L'inibizione farmacologica dell'attività di GCL con butionina sulfoximina (BSO) prima dell'esposizione a -glucano porta a una diminuzione della produzione di IL-6 dopo la restimolazione di LPS (Figura 2C). Pertanto, la modulazione esogena dei livelli di glutatione, o l'integrazione con l'aggiunta del precursore NAC, o la sua diminuzione bloccando l'enzima GCL con BSO, ha smorzato l'aumentata reattività del -glucano alla stimolazione secondaria.

Per indagare ulteriormente se la variazione genetica nei geni coinvolti nel metabolismo del glutatione influenza l'immunità addestrata, la mappatura QTL è stata eseguita utilizzando una coorte di 325 individui sani. Abbiamo testato se gli SNP comuni con una frequenza allelica minore (MAF) > 0.05 nei geni rilevanti per il metabolismo del glutatione fossero associati a cambiamenti nella capacità di produzione di citochine proinfiammatorie dei monociti dopo l'addestramento in vitro di -glucano e BCG (Figura 3A, C).

Allo stesso modo, abbiamo anche valutato l'impatto di queste varianti genetiche sull'immunità addestrata in vivo indotta dalla vaccinazione BCG di 278 individui sani (Figura 3B, C). Diversi SNP all'interno di una finestra di 250 kb di geni coinvolti nel metabolismo del glutatione sono stati associati in modo suggestivo (p-value <9,99 × 10−3) con sovraregolazione della secrezione di IL-1, TNF e IL-6 dopo l'allenamento (Figura 3A, B).

Nella stessa coorte, abbiamo misurato i metaboliti plasmatici coinvolti nel metabolismo del glutatione prima della vaccinazione con BCG. Gli SNP identificati nelle analisi in vitro e in vivo erano significativamente associati alle concentrazioni circolanti di glutatione (valore p < 0.05) (Figura 3D). Inoltre, abbiamo trovato un'associazione positiva tra la concentrazione plasmatica di glutatione e la produzione di IL-1 ex vivo 90 giorni dopo la vaccinazione con BCG in seguito all'esposizione in vitro allo stimolo eterologo Staphylococcus aureus (Figura 3E). L'up-regulation della produzione di IL-1 mediante vaccinazione BCG è anche positivamente associata alla concentrazione circolante di altri metaboliti coinvolti nel metabolismo del glutatione, come metionina, cisteina, glutammato e glicina (Figura 3E). Nel complesso, i geni coinvolti nel metabolismo del glutatione contenenti QTL per risposte eterologhe innate, a LPS (Figura 3A) o a S. aureus (Figura 3B) e la correlazione tra i livelli sierici di glutatione e la produzione di IL-1 ex vivo, indicano entrambi un ruolo di questo percorso nella creazione di immunità addestrata.

Figura 3. Il glutatione è associato a caratteristiche immunitarie addestrate. Heatmap dei valori p di associazione (p <9,99 × 10−3) tra SNP mappati a geni coinvolti nel metabolismo del glutatione e l'entità della capacità di produzione di citochine da parte di monociti addestrati in vitro con (A) -glucano e BCG (n=251 volontari sani per IL-6 e n=238 volontari sani per TNF ) e (B) risposte di addestramento BCG in vivo (n {{1{0}} volontari sani). (C) Boxplot dell'SNP con valore p più basso per analisi (rs7768134, rs35568915). (D) Boxplot che mostrano i livelli plasmatici di glutatione (corretti per età e sesso) stratificati per genotipo per rs2233294 (GPX3) e rs10136944 (GLRX5, n=302). Il valore p per ogni SNP è derivato da un modello di regressione lineare con l'SNP di interesse come variabile indipendente e il glutatione (corretto per età e sesso) come variabile dipendente. (E) Correlazioni di Spearman tra i metaboliti circolanti al basale coinvolti nel metabolismo del glutatione rispetto ai cambiamenti di piega delle risposte di IL-6, IL-1 e TNF indotte da S. aureus derivate da PBMC misurate a 14 o 90 giorni dopo Vaccinazione BCG rispetto al basale (n=297 volontari sani). La tabella presenta il rho di Spearman per ciascuna correlazione e le correlazioni in rosso evidenziano correlazioni positive significative (* p <0,05, ** p <0,01). La correlazione tra la concentrazione di glutatione e la variazione di piega della produzione di IL-1 a 90 giorni rispetto al giorno 0 viene fornita come esempio in un grafico a dispersione.

4. Discussione

I macrofagi sono cellule plastiche che adattano il loro fenotipo a diversi stimoli ambientali. I macrofagi addestrati si basano su un metabolismo energetico elevato, con aumento della glicolisi, del ciclo TCA e della fosforilazione ossidativa, per attivare una risposta con una maggiore produzione di citochine pro-infiammatorie [6,22].

Oltre alla produzione di citochine, il burst ossidativo con una rapida produzione di ROS è aumentato nei macrofagi restimolati addestrati con BCG [8]. Anche i neutrofili splenici isolati da topi trattati con BCG mostrano un aumento della produzione di ROS [23]. In linea con l'aumento del tasso metabolico e la maggiore capacità di montare un burst ossidativo, abbiamo osservato che monociti e macrofagi esposti a -glucano o BCG mostrano un aumento della produzione basale di ROS. Un aumento simile nel rilascio di ROS era stato precedentemente riportato nei monociti addestrati con oxLDL [9]. I ROS hanno funzioni effettrici nella clearance dei patogeni ma possono anche mediare la trasduzione del segnale [24]. L'inibizione farmacologica dell'enzima NOX che produce ROS o il trattamento con molecole antiossidanti -tocoferolo e acido ascorbico non hanno ablato il -glucano aumentando la produzione di citochine. Tuttavia, il NAC scavenger di ROS ha inibito la produzione di TNF potenziato da -glucano, indicando un possibile ruolo dei ROS nell'immunità allenata.

È interessante notare che la NAC non è solo una molecola antiossidante, ma agisce anche come precursore del glutatione, la principale molecola antiossidante endogena. Esistono due principali sistemi redox cellulari, i nucleotidi piridinici, come NAD plus/NADH, e i sistemi tiolici, che includono glutatione e tioredossine. Il rapporto NAD plus /NADH è aumentato nei monociti esposti al glucano in modo sostenuto dopo il periodo di differenziazione nei macrofagi addestrati [22], in modo simile a quanto riportiamo per i livelli di ROS. Qui mostriamo che le concentrazioni di GSH sono modulate anche nell'immunità allenata.

La cosa più sorprendente è che la concentrazione della forma ridotta di GSH è migliorata solo nei macrofagi addestrati differenziati, mentre i livelli del GSSG ossidato sono stabili. Ciò suggerisce che i macrofagi addestrati hanno aumentato i depositi di GSH, che contrariamente a NAD plus /NADH non collaborano con la produzione sostenuta di ROS. Il contributo del metabolismo del glutatione all'immunità allenata è ulteriormente rafforzato dall'analisi genetica e metabolica di una coorte di individui sani (300BCG). È stato scoperto che polimorfismi genetici comuni all'interno dei geni correlati al GSH influenzano l'entità della produzione di citochine sull'immunità addestrata in vitro e in vivo (p <9, 99 × 10-3). Inoltre, due di questi loci QTL, GPX3 a chr5 e GLRX5 a chr14, sono risultati associati alle concentrazioni plasmatiche di GSH (p <0,05).

Il GSH è una molecola antiossidante, ma è noto anche per regolare l'espressione genica attraverso diversi meccanismi epigenetici. Il GSH partecipa alle modifiche post-traduzionali, come osservato nella S-glutationilazione dell'istone H3 della proteina nucleosoma, ed è alimentato dalla via della metionina che alla fine porta alla produzione di s-adenosil metionina (SAM). A sua volta, SAM è il principale donatore di metile utilizzato per la metilazione del DNA e dell'istone [7]. Il fumarato del metabolita del ciclo TCA si accumula nei macrofagi addestrati e il suo derivato monometilfumarato induce un fenotipo di immunità addestrata [5]. Negli astrociti, l'esposizione acuta al derivato dimetilfumarato esaurisce il GSH intracellulare ma aumenta il GSH totale in momenti successivi [25]. L'immunità addestrata è ancorata da modificazioni epigenetiche che conferiscono memoria a lungo termine [26]. L'aumento del contenuto di GSH qui osservato dei macrofagi addestrati potrebbe facilitare il ricablaggio epigenetico necessario per l'istituzione della memoria immunitaria innata.

Qui, mostriamo che la modulazione farmacologica del glutatione e lo stato redox della cellula diminuisce la risposta eterologa del macrofago, come visto dall'effetto di BSO o NAC sulla produzione di citochine potenziata dal glucano. Inoltre, in una coorte di individui sani, il metabolismo del GSH è associato a tratti immunitari addestrati. I meccanismi immunitari addestrati che sono modellati dal metabolismo del GSH devono essere ulteriormente esplorati, ma il potenziale coinvolgimento di entrambi i paesaggi metabolici ed epigenetici rende questo hub metabolico una strada entusiasmante da indagare in studi futuri. Queste intuizioni contribuiscono a svelare il cablaggio metabolico ed epigenetico dell'immunità addestrata, consentendo una migliore comprensione dell'impatto immunitario innato sulla salute e sulla malattia. In definitiva, una migliore comprensione aiuterà a identificare nuovi bersagli terapeutici nelle malattie caratterizzate da disregolazione dei processi immunitari innati.

Contributi dell'autore:

Concettualizzazione: AVF e JD-A.; metodologia: AVF, VACMK, VM e JCA-B., MAG; analisi formale: AVF, VACMK, VM e JCA-B.; indagine AVF, JCA-B., SK, LCJdB, SJCFMM, VPM e BN; cura dei dati: AVF, VACMK, VM e BN; scrittura—preparazione della bozza originale, AVF; scrittura—revisione e revisione: tutti i coautori; supervisione: MAG, MGN e JD-A.; acquisizione di finanziamenti: MAG e MGN Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto.

Finanziamento:

JD-A. è supportato dall'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (VENI grant 09150161910024). MGN. è supportato da un ERC Advanced Grant (833247) e da uno Spinoza Grant dell'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica. AVF è supportato dalla Fundação para a Ciência ea Tecnologia (FCT, Ph.D. grant PD/BD/135449/2017). JCAB è supportato da una sovvenzione del Dipartimento Amministrativo di Scienza, Tecnologia e Innovazione, COLCIENCIAS, in Colombia (Bando 756/2016). BN è supportato da un Investigator Grant NHMRC (Australia) (APP1173314).

Dichiarazione del comitato di revisione istituzionale:

Lo studio 300BCG è stato approvato dal comitato etico locale CMO regione Arnhem-Nijmegen, NL58553.091.16.

Dichiarazione di consenso informato:

Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i soggetti coinvolti nello studio, secondo l'approvazione del comitato etico Arnhem-Nijmegen (nr. 2010-104).

Dichiarazione sulla disponibilità dei dati:

I dati di sequenziamento dell'RNA presentati in questo studio sono disponibili in NCBI Gene Expression Omnibus con il numero di accesso GSE85243.

Ringraziamenti:

Gli autori desiderano ringraziare tutti i volontari per aver partecipato allo studio 300BCG.

Conflitto di interessi:

MGN è un fondatore scientifico di TTxD. I restanti autori non dichiarano alcun conflitto di interessi. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio; nella raccolta, analisi o interpretazione dei dati; nella stesura del manoscritto o nella decisione di pubblicare i risultati.

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Anaisa V. Ferreira 1,2,* , Valerie ACM Koeken 1,3,4 , Vasiliki Matzaraki 1 , Sarantos Kostidis 5 , Juan Carlos Alarcon-Barrera 5 , L. Charlotte J. de Bree 1 , Simone JCFM Moorlag 1 , Vera P Mourits 1 , Boris Novakovic 6,7, Martin A. Giera 5 , Mihai G. Netea 1,8 e Jorge Domínguez-Andrés.

1 Dipartimento di Medicina Interna e Radboud Center for Infectious Diseases (RCI), Radboud University Nijmegen Medical Center, 6500 HB Nijmegen, Paesi Bassi;

Valerie.Koeken@radboudumc.nl (VACMK); Vasiliki.Matzaraki@radboudumc.nl (VM);

Charlotte.deBree@radboudumc.nl (LCJdB); Simone.Moorlag@radboudumc.nl (SJCFMM);

Vera.Mourits@radboudumc.nl (VPM); Mihai.Netea@radboudumc.nl (MGN).

2 Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar (ICBAS), Universidade do Porto, 4050-313 Porto, Portogallo.

3 TWINCORE, una joint venture tra l'Helmholtz-Centre for Infection Research (HZI) e la Hannover Medical School (MHH), 30625 Hannover, Germania.

4 Center for Individualized Infection Medicine (CiiM), Department of Computational Biology for Individualized Infection Medicine, una joint venture tra l'Helmholtz-Centre for Infection Research (HZI) e la Hannover Medical School (MHH), 30625 Hannover, Germania.

5 Centro di proteomica e metabolomica, Leiden University Medical Center (LUMC), 2333 ZA Leiden, Paesi Bassi; s.kostidis@lumc.nl (SK); jcalarcon_barrera@lumc.nl (JCA-B.);m.a.giera@lumc.nl (MAG)

6 Epigenetics Research, Murdoch Children's Research Institute, Parkville, VIC 3052, Australia;boris.novakovic@mcri.edu.au.

7 Dipartimento di Pediatria, Università di Melbourne, Melbourne, VIC 3052, Australia.

8 Department for Genomics & Immunoregulation, Life and Medical Sciences Institute (LIMES), Università di Bonn, 53115 Bonn, Germania.

* Corrispondenza: anaisa.validoferreira@radboudumc.nl (AVF); Jorge.dominguezandres@radboudumc.nl (JD-A.); Tel.: più 31-2436-16636 (JD-A.).

For more information:1950477648nn@gmail.com