La gomisina N inibisce la melanogenesi regolando le vie di segnalazione PI3K/Akt e MAPK/ERK nei melanociti

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Astratto: Gomisin N, uno dei composti lignani presenti nella Schisandra Chinensis ha dimostrato di possedere attività antiossidanti, antitumorali e antinfiammatorie in vari studi. Qui riportiamo, per la prima volta, l'efficacia anti-melanogenica della Gomisin N nei mammiferi cellule così come negli embrioni di pesce zebra. La gomisina N ha ridotto significativamente il contenuto di melanina senza tossicità cellulare. Sebbene non fosse in grado di modulare l'attività catalitica del fungotirosinasiin vitro,Gomisin Ndownregolato i livelli di espressione delle proteine ​​chiave che funzionano inmelanogenesi. La gomisina N ha downregolato il recettore della melanocortina 1 (MC1R), l'adenilil ciclasi 2, il fattore di trascrizione associato alla microftalmia (MITF), la tirosinasi,tirosinasiproteina correlata-1(TRP-1) e proteina correlata alla tirosinasi-2 (TRP-2). Inoltre, le cellule Melan-A trattate con Gomisin N hanno mostrato livelli aumentati di p-Akt e p-ERK, il che implica che l'attivazione delle vie PI3K/Akt e MAPK/ERK può funzionare per inibiremelanogenesi. Abbiamo anche convalidato che Gomisin N ha ridotto la produzione di melanina reprimendo l'espressione di MITF,tirosinasi, TRP-1 e TRP-2in cellule di topo e umane, nonché nello sviluppo di embrioni di pesce zebra. Collettivamente, concludiamo cheGomisin Ninibisce la sintesi della melanina reprimendo l'espressione di MITF e degli enzimi melanogenici, probabilmente modulando le vie PI3K/Akt e MAPK/ERK.

Parole chiave:Schisandra Chinensis;Gomisin N; lignan;melanogenesi; sbiancamento della pelle

cistanche hanno la funzione di sbiancamento della pelle

1. Introduzione

La melanina è un pigmento presente nella maggior parte degli organi animali tra cui pelle, capelli, occhi, orecchio interno, ossa, cuore e cervello [1,2].Melanogenesiè un processo complesso in cui sono coinvolte più vie di segnalazione. Il recettore della melanocortina 1 (MC1R) è un regolatore chiave inmelanogenesi, segnalando attraverso i suoi ligandi come l'ormone stimolante i melanociti (MSH) e l'ormone adrenocorticotropo (ACTH) [3]. La melanina cutanea viene biosintetizzata dai melanociti nell'epidermide e quindi trasferita ai cheratinociti, dove svolgono un ruolo importante nella protezione della pelle assorbendo i raggi UV dalla luce solare e eliminando i radicali liberi reattivi [4,5]. La sintesi e il trasferimento della melanina nella pelle e nei follicoli piliferi è regolata dalla disponibilità dei suoi precursori [6]. La L-tirosina e la L-diidrossifenilalanina (L-DOPA), i principali substrati degli enzimi melanogeni, funzionano anche come regolatori simili agli ormoni nella melanogenesi [7]. D'altra parte, la sovrapproduzione di melanina provoca problemi cutanei indesiderati come lentiggini e melasma [8,9]. La melanogenesi può influenzare il comportamento dei melanociti normali e maligni modulando le proprietà elastiche delle cellule [10]. Sebbene i recettori per la serotonina e la melatonina espressi nelle cellule cutanee svolgano un ruolo chiave nel mantenimento dell'omeostasi cellulare, l'eccessiva produzione di melanina attraverso cambiamenti ormonali incontrollati può causare condizioni patologiche nella pelle [11].

Pertanto, ci sono stati ampi sforzi per chiarire i meccanismi molecolari che controllano la melanogenesi come passaggio principale per il trattamento dei disturbi della pelle iperpigmentaria. Inoltre, vari tipi disbiancamento della pelleagenti che inibiscono la sintesi della melanina sono stati identificati da estratti vegetali e non vegetali e utilizzati commercialmente nei cosmeceutici [12,13]. Gli agenti sbiancanti più utilizzati includono idrochinone, mechinolo, arbutina, acido kojico, acido ascorbico e acido retinoico [12,14]. Tuttavia, ci sono vari limiti del loro uso nel trattamento dei sintomi acuti o cronici dell'iperpigmentazione nell'uomo. Ad esempio, l'idrochinone, sebbene sia stato a lungo utilizzato per la depigmentazione sin dagli anni '60, può causare irritazioni cutanee e dermatiti da contatto [15,16]. Porta anche al danno del DNA aumentando la produzione di specie reattive dell'ossigeno e lo sviluppo dell'ocronosi esogena nelle cellule di mammifero [17,18]. Altro nototirosinasiinibitori come l'acido kojico e l'acido ascorbico non solo hanno scarsa penetrazione cutanea, stabilità ed efficacia sbiancante, ma possono anche causare citotossicità, dermatite ed eritema dall'uso a lungo termine [19,20]. A questo proposito, vi è una crescente necessità di sviluppare agenti sbiancanti più sicuri ed efficaci per il trattamento dell'iperpigmentazione della pelle umana. Le erbe naturali utilizzate nella medicina tradizionale possono fornire fonti alternative per l'identificazione di nuovi agenti sbiancanti che controllano i passaggi chiavemelanogenesicon meno o nessun effetto collaterale [21].

La Schisandra chinensis, nota anche come bacca settentrionale dal sapore fine, si trova naturalmente nella Cina nord-orientale, nell'estremo oriente della Russia, in Giappone e in Corea [22]. Questa pianta è stata a lungo utilizzata per il trattamento della cecità notturna, delle ustioni cutanee, dell'infiammazione asettica e delle malattie del fegato nella medicina orientale tradizionale [23,24]. È stato dimostrato che l'estratto di frutta di S. chinensis e i suoi composti lignani possiedono vari effetti farmacologici nelle linee cellulari murine. Ad esempio, Schisandra A e C hanno effetti antiossidanti, mentre Schisandra B ha attività antifibrotiche, antinfiammatorie, antiossidanti e anti-apoptotiche [25]. Un altro composto lignanicoGomisin N(Figura 1A) è stato segnalato per sopprimere l'apoptosi indotta dallo stress ossidativo inibendo il rilascio del citocromo C dai mitocondri al citoplasma, la scissione della caspasi 3 e PARP e la transizione della permeabilità mitocondriale indotta da Ca2 plus nei cardiomiociti di ratto H9c2 [7,8]. È interessante notare che diversi studi che utilizzano modelli murini e linee cellulari della pelle umana hanno rivelato il potenziale terapeutico di S. chinensis per il trattamento dei disturbi della pelle. Lee et al. riportato che l'estratto di metanolo del frutto di S. chinensis allevia i sintomi della dermatite da contatto riducendo la produzione di citochine pro-infiammatorie come TNF- e IFN- quando applicato localmente [8,24]. Kang et al. ha mostrato che l'estratto di acqua di Schisandra Fructus inibiva l'attivazione di IκB, sopprimendo così la produzione di TNF-, IL-6 e GM-CSF nella linea di mastociti umani HMC-1 [26]. Questi risultati ci hanno portato a postulare che S. chinensis lignans potrebbe influenzare le funzioni delle cellule della pelle in modo più ampio. In questo studio, abbiamo cercato di indagare i ruoli presunti diGomisin N, uno dei maggiori composti lignan in S. Chinensis, nella regolazionemelanogenesi, valutandone così il potenziale utilizzo come agente acosmeceutico. Ecco, lo segnaliamoGomisin Ninibisce la biosintesi della melanina senza tossicità cellulare nelle cellule umane e di topo, nonché negli embrioni di pesce zebra.

2. Risultati

2.1. Effetti della Gomisin N sulla formazione di melanina e sulla vitalità cellulare

Per verificare gli effetti di Gomisin N sumelanogenesi, abbiamo trattato melanociti di topo con diverse concentrazioni diGomisin Nper 72 h, e quindi valutate le variazioni del contenuto di melanina. Il trattamento con Gomisin N ha ridotto il contenuto di melanina sia nella normale linea cellulare di melanociti Melan-A che nelle cellule di melanoma B16F10 in modo dose-dipendente senza tossicità cellulare (Figura 1B, C). Abbiamo osservato che Gomisin N inibiva la produzione di melanina indotta da MSH nelle cellule B16F10, che era paragonabile ai risultati ottenuti dal trattamento con PTU [27] (Figura 1C). Per valutare se la riduzione della melanina sopraGomisin Nil trattamento è dovuto alla ridotta attività della tirosinasi, abbiamo eseguito un test di colorazione L-DOPA in normali cellule di melanociti epidermici umani (NHEM). Come mostrato nella Figura 1E, le cellule NHEM trattate con Gomisin N hanno mostrato livelli ridotti di L-DOPA rispetto alle cellule non trattate. Tuttavia, l'effetto inibitorio della Gomisina N sulla produzione di melanina non era significativo nelle cellule MNT {3}} del melanoma umano (Figura 1D) .

2.2. Effetti della Gomisin N sull'attività della tirosinasi

Per esaminare seGomisin Ninibiscetirosinasiattività in vitro, abbiamo utilizzato lisati di cellule di melanoma tirosinasi e B16 di funghi. Come controllo positivo è stato utilizzato l'acido kojico, un noto inibitore della tirosinasi. Quando trattata con tirosinasi dei funghi, mentre l'acido kojico ha ridotto significativamente l'attività enzimatica, la gomisina N non ha indotto alcun cambiamento nella conversione della L-DOPA in dopacromo (Figura 2A). Tuttavia, quando trattata con cellule di melanoma B16, la gomisina N ha comportato una diminuzione intirosinasiattività del lisato cellulare in modo dose-dipendente (Figura 2B). Inoltre, quando co-trattato con cellule -MSH inB16,Gomisin Nha invertito l'aumento della formazione di dopacromo stimolato da -MSH (Figura 3C). In particolare, la Gomisina N sembrava essere più efficace dell'acido Kojic per inibire la cellulaattività della tirosinasidi cellule B16 su stimolo -MSH. Questi risultati implicano che l'effetto inibitorio di GomisinN sulla produzione di melanina osservato nel topo e nelle cellule umane (Figura 1) non è dovuto alla sua funzione di inibire direttamente l'attività catalitica della tirosinasi. Tuttavia, è ancora possibile che la Gomisin Nregoli l'espressione della tirosinasi o di altre proteine ​​che svolgono ruoli chiave nellamelanogenesi.

2.3. Effetti di Gomisin N sull'inattivazione della via di segnalazione MC1R

Abbiamo cercato di chiarire il meccanismo sottostante responsabile dell'effetto inibitorio di GomisinN sulla produzione di melanina. Lo abbiamo ragionatoGomisin Npotrebbe regolare le proteine ​​di segnalazione coinvoltemelanogenesie quindi inibire la sintesi della melanina. Il recettore della melanocortina 1 (MC1R) è un recettore amelanocitico accoppiato a proteine ​​G che funge da regolatore chiave nella sintesi della melanina. L'attivazione di MC1R da parte del suo ligando -MSH o dell'ormone adrenocorticotropo (ACTH) porta ad un aumento dell'adeniilciclasi, che a sua volta sovraregola i livelli intracellulari di cAMP [2,3]. Di conseguenza, il livello trascrizionale di MITF è aumentato attraverso la via della proteina chinasi-C (PKA)/proteina legante l'elemento reattivo (CREB) [2,28]. Per valutare l'effetto regolatorio della Gomisina N sulla via di segnalazione MC1R, abbiamo controllato i livelli di espressione di MC1R e le sue molecole di segnalazione a valle dopo aver trattato le cellule Melan-A con Gomisina N. Abbiamo osservato che la Gomisina N ha significativamente sottoregolato i livelli proteici sia di MC1R che di adenilil ciclasi 2 in modo dose-dipendente (Figura 3A-C). Come previsto,Gomisin Nle cellule trattate hanno anche mostrato livelli proteici ridotti di MITF e dei suoi noti bersagli tirosinasi, TRP-1 e TRP-2 (Figura 3A, D-G). Questi risultati suggeriscono che la Gomisin N inibisce gli enzimi che producono melanina inattivando il MITF attraverso la via di segnalazione MC1R.

2.4. Effetti della Gomisin N sulla fosforilazione di Akt ed ERK1/2 nelle cellule Melan-A

È noto che le vie PI3K/Akt e MAPK/ERK sono coinvolte nella melanogenesi regolando trascrizionalmente o post-trascrizionalmente il MITF [29,30]. Per valutare se GomisinN influisce su queste vie di segnalazione, abbiamo valutato lo stato di fosforilazione di Akt e ERK1/2 mediante analisi Western blot. Come mostrato nella Figura 3H-J, trattamento ad alte dosi (30 µM) diGomisin Nmigliorato significativamente la fosforilazione di Akt ed ERK. Questi dati indicano che l'effetto inibitorio di Gomisin N sumelanogenesiè probabile che sia associato ai percorsi P13K/Akt e MAPK/ERK.

2.5. La gomisin N ha inibito la melanogenesi negli embrioni di pesce zebra

Successivamente abbiamo cercato di esaminare se la Gomisin N è efficace nell'inibiremelanogenesiin vivo. A tal fine, abbiamo trattato embrioni di pesce zebra con Gomisin N per 72 ore a concentrazioni di 1, 10, 20 e 30 µM e quindi misurato i livelli di espressione delle proteine ​​melanogeniche. Abbiamo osservato che il trattamento con Gomisin N ha inibito la formazione di melanina nello sviluppo di embrioni di pesce zebra.Gomisin Ngli embrioni trattati hanno mostrato una riduzione del contenuto di melanina in modo dipendente dalla concentrazione rispetto al controllo non trattato (Figura 4). Abbiamo anche scoperto che i livelli proteici ditirosinasi, MITF, TRP-1 e TRP-2 sono stati ridotti dal trattamento con Gomisin N (Figura 5). Questi risultati dimostrano che la Gomisin N inibisce la melanogenesi in vivo regolando il fattore di trascrizione MITF e i suoi bersaglitirosinasi, TRP-1 e TRP-2.

2.6. La gomisina N ha invertito la melanogenesi indotta dalla rapamicina nell'MNT umano-1

Sebbene la Gomisin N abbia inibito significativamentemelanogenesinelle cellule Melan-A e B16, nonché negli embrioni di inzebrafish, non abbiamo osservato il suo effetto sulle cellule di melanoma umano MNT-1. Ci aspettavamo che l'effetto di Gomisin N potesse essere rilevabile nelle cellule MNT-1 nella condizione in cui la melanogenesi fosse sovraregolata da uno stimolo appropriato. È stato dimostrato che la rapamicina induce la melanogenesi aumentando l'attività della tirosinasi e i livelli proteici di MITF, tirosinasi, TRP-1 e TRP-2 [31], in parte attraverso l'attivazione dell'autofagia [32]. Abbiamo monitorato i livelli ditirosinasi, MITF, TRP-1 e TRP-2 in cellule MNT-1 mediante analisi Western blot, dopo il co-trattamento con Gomisina N andrapamicina. Il trattamento con rapamicina ha indotto significativamente i livelli di MITF, TRP-1 e TRP{5}} ma non ha avuto alcun effettotirosinasilivelli (figura 6). Tuttavia, il trattamento con Gomisin N ha invertito significativamente gli effetti della rapamicina su MITF, TRP-1 e TRP-2 in modo dipendente dalla concentrazione. L'effetto inverso diGomisin Ncontro la rapamicina era più promettente alla concentrazione di 20 e 30 µM rispetto a 10 µM. Questi risultati suggeriscono che la Gomisina N inibiscemelanogenesinelle cellule di melanoma umano MNT-1 regolando il fattore di trascrizione MITF e i suoi target TRP-1 e TRP-2.

3. Discussione

La funzione principale della melanina è quella di proteggere le cellule della pelle dai raggi UV [33–35]. L'iperpigmentazione, il risultato di una sovrapproduzione di melanina nella pelle, provoca problemi cosmetici indesiderati ed è associata a dermatiti e cancro della pelle. Diversi rapporti hanno suggeritomelanogenesicome obiettivo importante per il trattamento del melanoma metastatico [36,37]. Pertanto, vi è una crescente necessità di sviluppare agenti anti-melanogenici che regolino la melanogenesi senza tossicità cellulare [38]. Esistono diversi percorsi coinvolti nella melanogenesi cutanea [39,40]. Dopo il legame con il ligando, l'MC1R migliora l'attività dell'adeniil ciclasi, che successivamente aumenta i livelli intracellulari di cAMP [41,42]. L'attivazione cAMP-dipendente della via PKA/CREB è stata ampiamente segnalata per sovraregolare i livelli trascrizionali di MITF, migliorando così la sintesi di melanina [43]. MITF funge da regolatore principale dei tre principali enzimi melanogenici tirosinasi, TRP-1 e TRP-2nei vertebrati [3,21,44]. Questi enzimi sono proteine ​​transmembrana situate nella membrana melanosomiale dei melanociti. La tirosinasi regola la fase di limitazione della velocitàmelanogenesiconvertendo la L-tirosinasi in L-DOPA [23]. Anche TRP-1 e TRP-2 svolgono un ruolo importante nella sintesi della melanina, sebbene le loro funzioni non siano completamente comprese.

In questo studio, Gomisin N, un composto lignan di S. chinensis ha mostrato attività depigmentante senza tossicità cellulare. La gomisin N ha inibito la sintesi della melanina nelle linee cellulari di mammiferi coltivate e negli embrioni di pesce zebra. La gomisin N sembrava essere più efficace del controllo positivo PTU nell'inibire la produzione di melanina nelle cellule di Melan-A (Figura 1B). Gomisin N ha ridotto il contenuto di melanina in modo dipendente dalla concentrazione. Rispetto al gruppo di controllo non trattato, 10 µM diGomisin Nha ridotto il contenuto di melanina di circa il 40 percento, senza tossicità cellulare. L'attività anti-melanogenica di10-µM Gomisin N era paragonabile a quella di 100-µM PTU nelle cellule Melan-A. Allo stesso modo, Gomisin N sembrava essere più potente del PTU nelle cellule B16F10 attivate con MSH, dove gli effetti di 5- e{10}}µM Gomisin N erano paragonabili a quelli di 10- e {{12 }}µM PTU, rispettivamente (Figura 1C). Le cellule NHEM trattate con Gomisin N hanno mostrato livelli ridotti di L-DOPA, il che suggerisce che GomisinN inibiscetirosinasiattività nelle cellule in coltura (Figura 1E). Questi risultati ci hanno portato a studiare ulteriormente il meccanismo alla base con cui la Gomisina N inibisce la melanogenesi.

Abbiamo esaminato seGomisin Nmodula direttamente l'attività catalitica ditirosinasiin vitro. A differenza dell'acido Kojic, Gomisin N non ha mostrato effetti inibitori sull'attività della tirosinasi dei funghi (Figura 2A). Tuttavia, l'attività della tirosinasi cellulare nei lisati di cellule di melanoma B16 è stata significativamente sottoregolata da Gomisin N sia con che senza trattamento con MSH (Figura 2B, C). L'inibizione dell'attività della tirosinasi cellulare di Gomisin N su stimolo -MSH è risultata più significativa di quella dell'acido kojico di controllo positivo (Figura 2C).

Abbiamo postulato che la funzione anti-melanogenica della Gomisina N potrebbe verificarsi attraverso la regolazione trascrizionale o post-trascrizionale della tirosinasi e delle proteine ​​correlate alla tirosinasi (TRP). Per convalidare ciò, abbiamo misurato i livelli di espressione delle molecole di segnalazione nella via MC1R, un importante determinante per il quantità e qualità della produzione di melanina nei melanociti. Prevedibilmente, abbiamo osservato che Gomisin N ha ridotto i livelli di MC1R e adenilil ciclasi 2 nelle cellule Melan-A (Figura 3A-C). Inoltre,Gomisin Nha sottoregolato l'espressione di MITF e delle sue proteine ​​​​bersaglio, tra cui tirosinasi, TRP-1 e TRP-2 (Figura 3A,D-G). Questi risultati suggeriscono che i livelli ridotti di contenuto di melanina durante il trattamento con Gomisin N derivano dalla disattivazione della via MC1R.

D'altra parte, le vie PI3K/Akt e MAPK/ERK possono fosforilare MITF e quindi possono modulare la sua attività post-trascrizionale [45]. Tuttavia, l'effetto complessivo dell'attivazione delle vie PI3K/Akt e MAPK/ERK inmelanogenesiè controverso. Entrambe le vie PI3K/Akt e MAPK/ERK sono attivate costitutivamente nei melanomi umani a causa di mutazioni accumulate [46]. È noto che la depigmentazione mediata da C2-ceramide nelle cellule Mel-Ab si verifica attraverso una riduzione dei livelli di p-Akt [47]. Esistono diversi composti naturali che attivano la melanogenesi sovraregolando i livelli di p-ERK nelle cellule di melanoma B16 [28]. Al contrario, vi sono anche prove che elevati livelli di p-ERK e p-Akt inibiscono la sintesi di melanina [28,48]. L'inregolazione della complessità della melanogenesi può essere parzialmente spiegata dal fatto che la fosforilazione migliora l'attività trascrizionale di MITF, ma contemporaneamente induce la degradazione di MITF dipendente dall'ubiquizione-proteosoma [26,49-51]. I nostri dati hanno mostrato che entrambi i livelli di p-Akt e p-ERK erano sovraregolati nelle cellule Melan-A trattate con Gomisin N (Figura 3H-J). Ciò implica che i percorsi PI3K/Akt e MAPK/ERK possono contribuire all'inibizione della produzione di melanina.

Abbiamo ulteriormente convalidato l'attività anti-melanogenica di Gomisin N nel modello in vivo di zebrafish. Gli embrioni di zebrafish trattati con Gomisin N hanno mostrato una significativa riduzione della pigmentazione della melanina (Figura 4). Inoltre, Gomisin N ha ridotto notevolmente i livelli ditirosinasi, MITF, TRP-1 e TRP-2 nello sviluppo di embrioni di pesce zebra. Questi risultati lo suggeriscono collettivamenteGomisin Ninduce la depigmentazione sottoregolando l'espressione di MITF e degli enzimi melanogenici in vivo. L'attività anti-melanogenica della Gomisina N è stata ulteriormente confermata nelle cellule MNT-1 di melanoma umano stimolate dalla rapamicina. Sebbene la gomisina N abbia determinato solo piccoli cambiamenti nel contenuto di melanina nelle cellule MNT-1 (Figura 1D), è stata efficace per invertire la sovraregolazione indotta dalla rapamicina di MITF, TRP-1 e TRP-2 in un modo dipendente dalla concentrazione (Figura 6A,C-E). Nel complesso, l'effetto normativoGomisin Nsu MITF ed enzimi melanogenici è stato trovato in modo riproducibile in cellule di topo e umane, nonché in embrioni di pesce zebra.

Per riassumere, questo lavoro suggerisce che Gomisin N potrebbe avere un alto potenziale come romanzosbiancamento della pelleagente. La gomisina N sembra inibiremelanogenesireprimendo l'espressione di MITF attraverso la via MC1R, invece di modulare direttamente l'attività catalitica ditirosinasie TRP. Sebbene i meccanismi dettagliati rimangano da chiarire, è probabile che la depigmentazione indotta da Gomisin N sia associata all'attivazione dei percorsi PI3K/Akt e MAPK/ERK (Figura 7).

4. Materiali e metodi

4.1. Materiali

RPMI1640 è stato acquistato da Gibco-BRL (Gaithersburg, MD, USA). Il mezzo di Dulbecco modificatoEagle (DMEM), il siero bovino fetale (FBS) e la penicillina-streptomicina (PS) sono stati acquistati da Hyclone (Carlsbad, CA, USA). Il mezzo di crescita dei melanociti è stato acquistato da PromoCell (Heidelberg, Germania). Fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), 12-O-tetradecanoilforbolo{5}}acetato(TPA), acido kojico, 1-fenil{7}}tiourea (PTU), tirosinasi di funghi, 3,{{ 9}}diidrossi-l-fenilalanina (L-DOPA), -MSH, dimetilsolfossido (DMSO) e paraformaldeide sono stati acquistati da SigmaChemical Co. (St. Louis, MO, USA).Gomisin Ncomposto è stato fornito da Chul Young Kim (Università di Hanyang, Ansan, Corea). La rapamicina è stata acquistata da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

4.2. Coltura cellulare

La linea cellulare di melanoma murino B16F10 è stata fornita dalla Korean Cell Line Bank (Seoul, Corea). Le cellule Melan-A dei melanociti murini [52] sono state un generoso dono del Dr. Byeong Gon Lee (The SkinResearch Institute, Amore Pacific Co., Yongin -si, Corea). Le cellule di melanoma umano MNT-1 sono state generosamente fornite da Aeyeong Lee (Collage of Medicine dell'Università di Dongguk, Goyang-si, Corea). I melanociti epidermici umani normali primari (NHEM) sono stati acquistati da PromoCell (Heidelberg, Germania). Le cellule Melan-A sono state coltivate in terreno RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad, CA, USA) integrato con FBS 10%, PS 1% e TPA 200 nM. DMEM integrato con il 10 percento di FBS e l'1 percento di PS è stato utilizzato per mantenere le cellule Melan-A e le cellule NHEM. Tutte le cellule sono state incubate a 37 ◦C in un incubatore di CO2 al 5%.

4.3. Misurazione del contenuto di melanina

Le cellule di melano-A sono state seminate in una 24-piastra a pozzetti (1 × 105 cellule/pozzetto), trattate conGomisin N, e quindi incubato per 72 h. Dopo 72 ore, il contenuto di melanina è stato misurato come descritto in precedenza [53]. In breve, dopo aver rimosso il mezzo di coltura, le cellule sono state lavate tre volte con PBS. Successivamente, a ciascun pozzetto è stata aggiunta una soluzione di idrossido di sodio (1 mL, 1 N) per sciogliere la melanina. L'assorbanza a 405 nm è stata misurata utilizzando un lettore di micropiastre. Questo test è stato ripetuto con cellule B16F10 (2 × 104 cellule/pozzetto) e cellule MNT-1 seguendo lo stesso metodo.

4.4. Analisi Western Blot

Le cellule di Melan-A sono state seminate in piatti da 100 mm (1 × 106 cellule/piatto) e trattate con 1, 5 o 10 µMGomisin Nper tre giorni a 37 ◦C. Le cellule sono state lavate con PBS e quindi raccolte utilizzando un raschietto. Le cellule staccate sono state messe in 1 ml di PBS e centrifugate a 7500 rpm per 5 minuti. Dopo aver rimosso la soluzione superiore, i pellet cellulari sono stati lisati con tampone di lisi (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0,1% SDS, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,02 percento di sodio azide, 0,5 percento di desossicolato di sodio, 100 µg/mL di PMSF, 1 g/mL di aprotinina) per 24 ore a 4 ◦C. Le proteine ​​totali sono state estratte utilizzando un'ultracentrifuga a 12,{22}} rpm per 30 minuti a 4◦C. Il contenuto proteico è stato misurato utilizzando il saggio Bradford. Le proteine ​​(30 µg) sono state separate usando un gel per elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) e trasferite su membrana di anitrocellulosa. La membrana è stata bloccata per 1 ora con latte scremato al 5% in soluzione fisiologica tamponata con Tris con Tween-20 (TBST) e quindi incubata per 12 ore a 4 ◦C con anticorpi primari mirati alla tubulina (Santa Cruz, CA, USA ), MITF (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), tirosinasi (Cell Signaling), ERK (Cell Signaling), fosfo-ERK (Cell Signaling), AKT (Cell Signaling), fosfo-AKT (Cell Signaling), MC1R ( Santa Cruz), adenil ciclasi 2 (Santa Cruz), TRP-1 (Santa Cruz) e TRP-2 (Santa Cruz). Dopo aver rimosso gli anticorpi primari, le membrane sono state lavate tre volte con TBST e incubate con il secondario anticorpi (IgG-HRP anti-capra di coniglio; HRP anti-coniglio di topo, Santa Cruz) per 1 ora. Le membrane sono state trattate con un reagente di chemiluminescenza potenziato utilizzando il sistema di imaging ChemiDoc XRS plus (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). L'analisi densitometrica delle bande è stata eseguita utilizzando il software Image MasterTM 2D Elite (versione 3.1, GE Healthcare, Chicago, IL, USA).

4.5. Saggio di attività della tirosinasi

Per stimare l'effetto inibitorio della Gomisin N sui funghitirosinasiattività, la tirosinasi è stata incubata con 1, 5 o 10 µMGomisin No il controllo positivo acido kojico. Ciascun campione è stato sciolto in metanolo. La L-DOPA (8,3 mM) e la tirosinasi dei funghi (125 U) sono state diluite in tampone fosfato 80 mM (pH 6,8). 40 µl di ciascun campione e 120 µl di L-DOPA sono stati miscelati in una 96-piastra a pozzetti, seguiti dall'aggiunta di 40 µl di tirosinasi diluita di funghi. Le piastre sono state quindi incubate per 15 minuti e l'assorbanza è stata misurata a 490 nm utilizzando un lettore di micropiastre.

tirosinasil'attività nei lisati di cellule di melanoma B16 è stata misurata con o senza trattamento -MSH, come precedentemente descritto da Ohguchi et al. [54], con lievi modifiche. Il lisato cellulare è stato preparato come descritto sopra nella parte dell'analisi Western Blot. Le proteine ​​totali nel supernatante sono state misurate mediante saggio Bradford utilizzando come standard l'albumina sierica bovina [55]. Una quantità uguale di proteine ​​è stata diluita e utilizzata per il test di attività della tirosinasi.

inibire l'attività della tirosinasi

4.6. Colorazione L-DOPA in cellule NHEM

Le cellule NHEM sono state seminate in una piastra a {{0}} e incubate per 72 ore con Gomisin N. Le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 40 min, seguite da trattamento con Triton X allo 0,1%{ {6}} per 2 min. L-DOPA (0,1 percento) è stata aggiunta a ciascun pozzetto, seguita da incubazione per 2 h. Dopo aver rimosso la soluzione, le cellule sono state lavate due volte con PBS. Le immagini sono state fotografate al microscopio.

4.7. Esperimenti di pesce zebra

Gli embrioni di Zebrafish sono stati ottenuti dalla Zebrafish Resource Bank (Daegu, Corea). Gli embrioni sono stati trattati con Gomisin N per 72 h. L'effetto depigmentante diGomisin Nsu embrioni di pesce zebra è stato osservato allo stereomicroscopio. Per l'analisi Western blot, gli embrioni trattati con Gomisin N sono stati lisati utilizzando un tampone di lisi, da cui sono state preparate le proteine ​​totali come menzionato sopra.

5. Conclusioni

Il nostro risultato supporta l'idea che Gomisin N ha un alto potenziale di utilizzo come alimento funzionale esbiancamento della pelleagente.Gomisin Nè uno dei principali composti lignani in S. Chinensis. Nei fatti. Chinensis è una medicina erboristica usata per la cura di molte malattie umane. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi epidemiologici per dimostrare la sicurezza di Gomisin N sulla pelle. Di conseguenza, gli studi in vivo e le sperimentazioni cliniche potranno dimostrare più chiaramente l'efficacia di GomisinN. In conclusione, questo studio suggerisce cheGomisin Npuò essere un potenziale agente ipo-pigmentario e naturalesbiancamento della pellecandidato per l'industria cosmetica.

cistanche migliorano lo sbiancamento

Riferimenti

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