La gossipitrin, un flavonoide presente in natura, attenua il danno neuronale e mitocondriale indotto dal ferro, parte 1

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Astratto:L'interruzione dell'omeostasi del ferro è un fattore importante nella perdita della funzione mitocondriale nelle cellule neurali, portando alla neurodegenerazione. Qui, abbiamo valutato l'azione protettiva della gossipitrin(Gos), un flavonoide presente in natura, sul danno cellulare neuronale indotto dal ferro utilizzando cellule HT-22 dell'ippocampo di topo e mitocondri isolati dal cervello di ratto. Gos è stato in grado di salvare le cellule HT22 dal danno indotto da 100 uM Fe()-citrato (EC50 8,6 uM). Questa protezione era collegata alla prevenzione della dissipazione del potenziale della membrana mitocondriale indotta dal ferro e dell'esaurimento dell'ATP. Nei mitocondri isolati, Gos (50uM) ha suscitato una protezione quasi completa contro il gonfiore mitocondriale indotto dal ferro, la perdita del potenziale transmembrana mitocondriale e l'esaurimento dell'ATP. Gos ha anche impedito la perossidazione lipidica mitocondriale indotta da Fe(Ⅱ)-citrato con un valore di ICs0 (12,45 μM) che era circa nove volte inferiore a quello del terz-butil idroperossido indottoossidazione. Inoltre, il flavonoide si è dimostrato efficace nell'inibire la degradazione di entrambi 15 e 1,5 mM 2-desossiribosio. Ha anche ridotto la concentrazione di Fe(II) nel tempo, aumentando al contempo il tasso di consumo di O2 e compromettendo la riduzione di Fe(II) da parte dell'ascorbato. I complessi Gos-Fe(I) sono stati rilevati mediante spettroscopie UV-VIS e IR, con un'apparente stechiometria Gos-ferro di 2:1. I risultati suggeriscono che il Gos non agisce generalmente come un antiossidante classico, ma agisce direttamente sul ferro, mantenendolo nella sua forma ferrica dopo aver stimolato l'ossidazione del Fe(II). Gli ioni metallici non sarebbero quindi in grado di partecipare a una reazione di tipo Fenton e alla fase di propagazione della perossidazione lipidica. Quindi, il Gos potrebbe essere usato per trattare le malattie neuronali associate allo stress ossidativo indotto dal ferro e al danno mitocondriale.

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Parole chiave: gossipitrin; ferro da stiro; celle HT-22; mitocondri;neurodegenerazione; neuroprotezione

1. Introduzione

Il ferro è un cofattore essenziale in molti processi biologici cruciali come la sintesi e il ripristino del DNA, il trasporto di ossigeno, la respirazione cellulare, il metabolismo xenobiotico e la sintesi ormonale [1. Tuttavia, ad alti livelli intracellulari, può aumentare le specie cellulari reattive dell'ossigeno con una modifica dei potenziali redox cellulari [2,3]. La disomeostasi del ferro è osservata in quasi tutte le condizioni neurologiche come il morbo di Parkinson (PD), il morbo di Alzheimer (AD), il morbo di Huntington (HD), la sclerosi multipla, l'atassia di Friedreich, l'epilessia, la sindrome delle gambe senza riposo e l'ictus [4,5]. In particolare, nell'emorragia intracerebrale, dove c'è una rottura delle microvascolari e il sangue rilasciato produce un'esposizione al ferro derivato dal sangue delle cellule neurali, i principali meccanismi di neurodegenerazione sono la produzione di ROS indotta da ferro ed eme, l'infiammazione e l'eccitotossicità [6 ,7]. Modelli sperimentali in vitro e in vivo di emorragia cerebrale hanno mostrato la presenza di ferroptosi, una forma ferro-dipendente di necrosi regolata [8]. Inoltre, prove crescenti suggeriscono che l'interruzione dell'omeostasi del ferro è essenziale nella perdita della funzione mitocondriale nelle cellule neurali [9,10], che potrebbe, a sua volta, portare alla neurodegenerazione [11-14. Recentemente è stata segnalata una relazione tra la forma ad esordio precoce del morbo di Parkinson con disregolazione del metabolismo del ferro e compromissione mitocondriale [15]. La coesistenza di quantità relativamente elevate di ferro e ROS nei compartimenti mitocondriali rende questo organello suscettibile al danno mediato dai radicali idrossilici. Gli agenti farmacologici che prendono di mira la regolazione del ferro cerebrale e la compromissione mitocondriale mediata dal ferro possono quindi essere terapeuticamente utili contro la neurodegenerazione. È stato scoperto che diversi agenti chelanti del ferro esibiscono azioni neuroprotettive in diversi modelli sperimentali [16-19]. D'altra parte, ci sono state molte segnalazioni sul potenziale neuroprotettivo dei polifenoli presenti in natura a causa delle loro azioni antiossidanti basate su una combinazione di chelazione del ferro e attività di scavenging dei radicali liberi [20,21]. Il nostro gruppo ha osservato che i polifenoli contenenti catecoli come mangiferina, guttiferone-A e rapanone interagiscono con il ferro, sia in vitro che in vivo, annullando così il suo ruolo catalitico nella promozione dei ROS [22-28]. Recentemente abbiamo anche riportato i potenti effetti antiossidanti della gossipitrin (Gos), un flavonoide presente in natura (Figura 1), indicando il suo potenziale utilizzo come agente neuroprotettivo [29]. Tuttavia, poco si sa dei meccanismi coinvolti in questi effetti antiossidanti. La presenza di un sistema ciclico planare a sei membri con delocalizzazione elettronica, una parte catecola e altri tre gruppi idrossilici aromatici (due dei quali adiacenti a un gruppo carbonile), suggerisce fortemente che questa molecola potrebbe agire come agente chelante del ferro poiché questi sono caratteristiche strutturali che favoriscono la chelazione del ferro da parte dei flavonoidi 30]. Pertanto, lo scopo di questo studio è valutare la capacità di Gos di proteggere HT-22cellule neuronalie mitocondri del cervello di ratto isolati da mediati dal ferrodanno ossidativo. Sono stati condotti altri studi su sistemi privi di cellule/mitocondri per caratterizzare ulteriormente la natura dell'interazione Gos-ferro.

2. Risultati

2.1. Gos salva le cellule HT-22 dalla morte cellulare indotta da Fe(I).

Fe（II）（100 μM） ha ridotto la sopravvivenza delle cellule HT-22 al 17,4% dopo 24 ore di esposizione, come stimato dal test MTT. Gos ha impedito la morte delle cellule dell'ippocampo in modo dose-dipendente. L'EC50 era 8,64 ± 1,58 μM (Figura 2A, riquadro). La protezione cellulare completa è stata osservata con 100 μM di Gos era più efficace di Trolox (500 μM), il noto antiossidante idrosolubile, che ha impedito la morte cellulare del 74 percento.

L'esposizione di HT-22 al ferro per 2 ore (prima dell'esecuzione della morte cellulare) ha indotto la dissipazione del potenziale della membrana mitocondriale, come stimato dalla ritenzione di rodamina 123 all'interno degli organelli (Figura 2B) e dall'esaurimento dell'ATP (Figura 2C ). Ciò suggerisce una possibile associazione tra gli effetti tossici mediati dal ferro sui mitocondri e la vitalità cellulare. Gos ha impedito la compromissione dose-dipendente dei mitocondri indotta dal ferro, seguendo i modelli di vitalità dei neuroni che hanno dimostrato che può prevenire la morte delle cellule HT-22 indotta dal ferro attraverso la protezione mitocondriale.

Figura 2. Protezione del Gos contro il danno cellulare neuronale indotto dal ferro. Effetti di Gos sulla sopravvivenza del neurone ippocampale del topo HT-22 (A), sul potenziale della membrana mitocondriale cellulare (B) e sui livelli di ATP cellulare (C). Gos（0-100 μM） o Trolox（500 μM） sono stati co-incubati per 24 h （vitalità） o 2 h （potenziale della membrana mitocondriale e livelli di ATP） con 100 μM di FeCl2/ 1 mM di citrato. Le condizioni del saggio sono descritte nella Sezione 4. Le cellule di controllo danneggiate (senza Gos) contenevano DMSO (0,001 percento) più la miscela di ferro-citrato. I risultati sono espressi come percentuale di morte cellulare in relazione al controllo non danneggiato (contenente DMSO0,001 percento come veicolo). I valori sono le medie ± SD di tre diversi esperimenti. Simboli diversi indicano differenze statistiche a p<0.05 when="" comparing="" all="" pairs="" of="" experimental="" groups="" according="" to="" the="" anova="" and="" post="" hoc="" newman-keuls="" tests.="" (if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

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2.2. Gos Rescues Rat-Brain Mitochondria from Iron-Induced Mitochondrial Lipoperoxidation Brain mitochondria incubated with Fe（）-citrate （50 μM） underwent a marked lipoperoxidation expressed by an increase in the formation of the thiobarbituric acid reactive substance(Figure 3A). Gos inhibited the iron-mediated mitochondrial lipid peroxidation in a concentration-dependent manner （IC50 value of 12.45±1.24 μM） （Figure 3A, inset）. The effects of Gos on tert-butyl hydroperoxide（300 μM）-induced mitochondrial lipid peroxidation（IC50 value>100 μM) mostra che è più efficace nel prevenire la perossidazione lipidica indotta dal ferro rispetto alla perossidazione lipidica indotta da perossile, suggerendo la sua capacità di agire direttamente sul ferro (Figura 3B).

Figura 3. Gos inibisce la formazione di malondialdeide nei mitocondri, indotta da 50 uM Fe()-citrato (A) o 300 μM di terz-butil idroperossido (B). I mitocondri del cervello di ratto (1 mg/mL) sono stati incubati in un mezzo di reazione contenente 125 mM di saccarosio, 65 mM di KCl, 10 mM di tampone HEPES (pH 7,4), 2 mM di succinato e 2,5 uM di rotenone, con o senza Gos(1-50 um). Gli esperimenti sono iniziati con l'aggiunta di 50 μM di Fe（II） o 300 μM di terz-butil idroperossido, ad eccezione del controllo non danneggiato (barre grigie). Il periodo di incubazione è stato di 20 minuti a 28 gradi C. I valori sono le medie ±SD (n=6). Simboli diversi indicano differenze statistiche a p<0.05 when="" comparing="" all="" experimental="" groups="" according="" to="" the="" anova="" and="" posthoc="" newman-keuls="" tests.="" (if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

2.3.Gos previene la dissipazione del rigonfiamento mitocondriale mediato dal ferro e l'esaurimento dell'ATP

La Figura 4A mostra che il complesso 50μM Fe（I）-citrato ha indotto un rigonfiamento mitocondriale espresso da una diminuzione dell'assorbanza a 540nm (linea f contro linea a). Era associato a una depolarizzazione △Y spontanea e completa (Figura 4B, lineaf rispetto alla linea a) e all'esaurimento dell'ATP (Figura 4C, colonna Fe()/citrato). Gos ha inibito il processo di rigonfiamento indotto dal ferro e la dissipazione di AY in modo dipendente dalla concentrazione (figura 4A, linee B). I valori di assorbanza (media ± DS a 7 min) dal pannello A erano: 0.482±0.013 (linea a), 0.459± { {23}}.011 (riga b),0.445± 0.007 (riga c),0.435± 0.015( riga d), 0,360 ± 0,011 (riga e) e 0,338 ± 0,012 (riga f). I valori di fluorescenza dal pannello B (media ± SD a 7 min) erano 15,03 ± 1,71 (linea a), 19,41 ± 2,07 (linea b), 22,29 ± 2,58 (linea c), 45,505 ± 4,47 (linea d), 118,468 ± 5,76 (riga e) e 146.201±5.83 (riga f). Sono state trovate differenze statisticamente significative tra la riga f e le altre righe, a p<0.05. the="" naturally="" occurring="" flavonoids="" also="" prevented="" iron-mediated="" atp="" depletion="" in="" a="" concentration-dependent="" manner(figure="" 4c).="" a="" strong="" interaction="" of="" gos="" with="" iron="" is="" suggested="" as="" the="" key="" mechanism="" for="" neuroprotection="" against="" iron-induced="" damage,="" both="" in="" ht-22="" neuronal="" cells="" and="" in="" brain="" mitochondria.="" to="" further="" characterize="" this="" gos-iron="" interaction,="" different="" experiments="" on="" a="" cell/mitochondria-free="" system="" were="">

Figura 4. (A) Induzione della transizione della permeabilità mitocondriale, (B) potenziale di membrana mitocondriale （AH）perdita e （C） riduzione dei livelli di ATP indotti da 50 μM di Fe（II）-citrato. A è stato stimato utilizzando la sonda a fluorescenza safranina （5 uM）. Gli effetti inibitori di Gos 50,25, 10 e 1μM sono mostrati rispettivamente nelle righe (b), (c), (d) ed (e). Le righe (a) e (f) rappresentano rispettivamente controlli non danneggiati (senza ferro) e controlli danneggiati (senza Gos). I mitocondri del cervello di ratto (RBM-0.5 mg/mL), Fe（II） e1 μM CCCP sono stati aggiunti dove indicato dalle frecce. Simboli diversi nel grafico（C）indicano differenze statistiche atp<0.05 when="" comparing="" all="" pairs="" of="" experimental="" groups="" according="" to="" the="" anova="" and="" post="" hoc="" newman-keuls="" tests.(if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

2.4. Gos induce autossidazione e consumo di citrato di Fe(II).

Gos ha ridotto la concentrazione di Fe() (1-min preincubazione) in un mezzo di reazione contenente 2 mM di citrato (senza mitocondri) in modo dose-dipendente (Figura 5A, cerchi neri).Un 5-min periodo di preincubazione (Figura 5A, riquadri rossi) ha ridotto ulteriormente la concentrazione di Fe(II). Gos ha anche aumentato il tasso di consumo di O2, probabilmente a causa dell'ossidazione di Fe(ll) a Fe(ⅡII)(Figura 5B,C). Questi risultati suggeriscono che Gos potrebbe rimuovere Fe(II) dal complesso citrato e ossidarlo alla forma ferrica in un processo che richiede O2 come accettore di elettroni. Di conseguenza, Gos potrebbe ostacolare la formazione di "radicali OH inattivando il Fe(Il) necessario per la reazione di tipo Fenton-Haber-Weiss, che può avviare la perossidazione lipidica della membrana mitocondriale.

Figura 5. (A)Gos stimola l'autoossidazione Fe(Ⅲl) in assenza di mitocondri cerebrali di ratto in un mezzo standard integrato con 1 mM citrato e 5 mM1,10-fenantrolina.1,{6}}fenantrolina era aggiunto 1 o 5 minuti dopo il periodo di incubazione Gos-Fe(II) e le assorbanze sono state lette a 510 nm. I valori sono la media di tre determinazioni. * differenza statistica a p<0.05 when="" comparing="" 1="" vs.="" 5min="" incubation.="" (b)effects="" of="" gos="" on="" o,="" consumption="" mediated="" fe(il)="" autoxidation="" in="" a="" standard="" medium="" supplemented="" with="" 1="" mm="" citrate="" under="" the="" following="" conditions:(a)="" no="" gos,(b)10="" um="" gos,="" （c）="" 30μm="" gos,="" （d）50="" μm="" gos,and="" （e）100μm="" gos.="" fe（ii）="" （50μm）="" was="" added="" where="" indicated="" by="" the="" arrow.="" results="" are="" representative="" of="" three="" experiments.="" (c)="" oxygen="" consumption="" rate="" (nmol="" o2/min/ml)1="" min="" after="" fe()="" addition.legends="" are="" the="" same="" as="" in(b).="" different="" symbols="" indicate="" statistical="" differences="" at=""><0.05 when="" comparing="" all="" pairs="" of="" experimental="" groups="" (in="" the="" same="" cell="" type)="" according="" to="" the="" anova="" and="" post="" hoc="" newman-keuls="" tests.="" (if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

Questo articolo è estratto da Molecules 2021, 26, 3364. https://doi.org/10.3390/molecules26113364 https://www.mdpi.com/journal/molecules