La sovraespressione di GRP78 attiva il ROSA1-Mitofagia neuroprotettiva mediata da IP3R, parte 2

2.5. Occidentale Macchia

Abbiamo anestetizzato profondamente i ratti con Dolethal (n=4) a 7 dpi per ottenere segmenti di midollo spinale L4-L5 (lunghezza 5- mm) per l'analisi western blot. Abbiamo congelato i campioni in azoto liquido.

Negli ultimi anni, sempre più risultati di ricerca hanno dimostrato che esiste una stretta relazione tra il blotting delle proteine ​​e la memoria. Il blotting delle proteine ​​è una tecnica analitica per rilevare l'espressione proteica, ampiamente utilizzata nella ricerca neuroscientifica.

La connessione tra i neuroni è strettamente correlata all’immagazzinamento della memoria. Il blotting delle proteine ​​può rilevare lo stato della connessione tra i neuroni e l'espressione delle proteine ​​pre e post-sinaptiche, rivelando ulteriormente l'importante ruolo delle proteine ​​nella formazione e nell'immagazzinamento della memoria.

Gli studi hanno scoperto che l'espressione delle proteine ​​neuronali presinaptiche è strettamente correlata alla formazione e all'immagazzinamento della memoria. Ad esempio, durante il processo di apprendimento e memoria, i neuroni modificano l'espressione delle proteine ​​presinaptiche e questo cambiamento è legato alla formazione e all'immagazzinamento di nuovi ricordi. Inoltre, alcuni studi hanno anche scoperto che i cambiamenti nell'espressione di alcune proteine ​​sono legati a malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer.

Pertanto, il blotting delle proteine ​​può fornire una comprensione approfondita dello stato di connessione tra i neuroni e dei cambiamenti nell'espressione delle proteine ​​correlate, rivelando il meccanismo molecolare dei neuroni. Ciò è di grande importanza per lo studio del meccanismo di formazione della memoria e delle malattie neurodegenerative.

In breve, la relazione tra il blotting delle proteine ​​e la memoria mostra il ruolo delle proteine ​​nella connessione tra i neuroni e l’immagazzinamento della memoria. Ciò fornisce nuove idee e indicazioni per lo studio del meccanismo di formazione della memoria e delle malattie neurodegenerative. Promuoviamo attivamente la ricerca sulle neuroscienze e contribuiamo alla salute e alla longevità! Si può vedere che dobbiamo migliorare la memoria, e Cistanche può migliorare significativamente la memoria perché ha effetti antiossidanti, antinfiammatori e antinvecchiamento, che possono aiutare a ridurre le risposte ossidative e infiammatorie nel cervello, proteggendo così la salute del sistema nervoso. sistema. Inoltre, Cistanche può anche promuovere la crescita e la riparazione delle cellule nervose, migliorando così la connettività e la funzione delle reti neurali. Questi effetti possono aiutare a migliorare la memoria, la capacità di apprendimento e la velocità di pensiero e possono anche prevenire il verificarsi di disfunzioni cognitive e malattie neurodegenerative.

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I campioni sono stati conservati o ulteriormente trattati mediante omogeneizzazione in tampone di lisi (HEPES 20 mM, pH 7,7, saccarosio 251 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM e un cocktail di inibitori della proteasi (Sigma-Aldrich) e della fosfatasi (Roche, Basilea, Svizzera) ) con un omogeneizzatore Potter su ghiaccio.

Dopo la centrifugazione dei lisati a 800× g per 20 minuti a 4◦C, abbiamo raccolto il surnatante come frazione post-nucleare e quantificato le proteine ​​mediante saggio BCA (Pierce Chemical Co.).

Per il western blotting, abbiamo caricato 30 µg di frazioni post-nucleari di segmenti L4-L5 di ciascun animale su gel di poliacrilammide SDS al 12% per eseguire la separazione elettroforetica delle proteine ​​seguita dal trasferimento su una membrana PVDF in un sistema BioRadcuvette a 25 mM Tris, pH 8,4, glicina 192 mM, 20% (v/v) metanolo.

Abbiamo bloccato le membrane con il 5% di BSA in PBS più 0,1% Tween-20 per 1 ora a temperatura ambiente e poi incubate a 4 ◦C durante la notte con l'anticorpo primario: anti- -actina di topo ( 1:10000; SigmaAldrich), anti-GRP78 di topo (1:500, Sigma-Aldrich), anti-CV di topo (1:1000, Invitrogen), anti-HSP60 di coniglio (1:500, Anticorpi-online), anti-HSP60 di topo NDUFA9 (1:1000, Invitrogen), anti-OPA1 di topo (1:1000, BD Biosciences), anti-Parkin di coniglio (1:500, Abcam, Cambridge, Regno Unito), anti-PINK1 di topo (1:500, Abcam), anti-NRF2 di coniglio (1:500, Abcam), anti-MNF2 (1:500, Abcam), anti-GRP75 di coniglio (1:500, Abcam).

Dopo diversi lavaggi, le membrane sono state incubate per 2 ore con un anticorpo secondario appropriato coniugato con perossidasi di rafano (1:5000, Vector). La membrana è stata visualizzata utilizzando una miscela chemiluminescente di 1:1 (luminolo 0,5 M, acido p-cumarico 79,2 mM, Tris-HCl 1 M, pH 8,5) e (perossido di idrogeno 8,8 M, Tris-HCl 1 M; pH 8,5) e la le immagini sono state scattate con un apparato Gene Genome e analizzate con il software Gene Snap e Gene Tools (Syngene).

2.6. Modello in vitro

Le cellule NSC34 sono state coltivate in soluzione Eagle modificata ad alto contenuto di glucosio (DMEM, Biochrom, Cambridge, UK) integrata con siero bovino fetale all'10% (Sigma-Aldrich), 100 unità/ml di penicillina e 0,5 X di soluzione di penicillina/streptomicina. (Sigma-Aldrich) e mantenuto in un incubatore umidificato a 37 ◦C sotto il 5% di CO2, essenzialmente come descritto in precedenza [26].

Dopo 4 giorni di coltura cellulare senza modificare il terreno, le cellule NSC34 presentavano un fenotipo simile differenziato caratterizzato dalla presenza di neuriti lunghi. Il giorno 4, sono stati aggiunti i farmaci alle cellule. Le soluzioni Tun (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) ed EFV (Bristol-Myers Squibb, New York, USA) sono state preparate ad una concentrazione di 10X e sciolte in DMEM.

Dopo 24 ore, abbiamo valutato la vitalità cellulare incubando le cellule con una soluzione MTT da 4 mg/mL per 3 ore. I cristalli blu di formazan formati sono stati sciolti in DMSO e l'assorbanza a 570 nm è stata misurata con un lettore di micropiastre (Elx800, Bio-tek, Winooski, VT, USA).

2.7. Nucleofezione

Abbiamo trasfettato un milione di cellule con plasmide da 2 µg per l'espressione di GFP, GRP78, HAPARK, mouse sh-eGFP, mouse sh-PINK1 (ID 68943, Tebu-bio), mouse sh-Hspa5 (ID 14828, Tebu-bio) e /o mouse sh-IP3R (ID 16440, Tebu-bio) utilizzando Amaxa Nucleofector II TM (Lonza, Basilea, Svizzera) e il kit Nucleofactor V (Lonza) seguendo le raccomandazioni del produttore.

Per l'analisi citometrica statica, abbiamo seminato le cellule in {{0}}pozzetti rivestiti con collagene al 10%. Dopo la coltura, abbiamo fissato le cellule con PFA al 4%, sciacquate due volte con PBS e conservato o successivamente aggiunto tampone bloccante contenente PBS 0,3% (v/v)Triton X-100 e 10% di siero bovino fetale. Dopo 3 giorni di coltura cellulare, sono stati aggiunti i farmaci disciolti in DMEM.

Per questi esperimenti, abbiamo utilizzato 1 µM Tun (Sigma-Aldrich), 10 µMCCCP (Sigma-Aldrich), 5 µM CsA (Sigma-Aldrich) o 10 µM BAPTA-AM (Sigma -Aldrich). Dopo 5 ore dal trattamento, abbiamo fissato le cellule per l'immunocitochimica con PFA al 4% o le abbiamo omogeneizzate in tampone RIPA modificato (50 mM Tris-HCl, pH 7,5,150 mM NaCl, 1 mM EGTA , 1% NP-40, 0,5% sodio desossicolato, 0,1% SDS, cocktail di proteasi e fosfatasi) per immunoblotting. L'immunoistochimica è stata eseguita risciacquando i campioni due volte con PBS e incubandoli con tampone bloccante contenente PBSplus 0,3% (v/v) di Triton X-100 e 10% di siero bovino fetale.

Abbiamo incubato con i seguenti anticorpi primari: anti-IP3R di coniglio (1:200, Abcam), anti-HA di topo (1:2000, Abcam), anti-GRP78 di topo (1:200, Sigma-Aldrich) e anti-HSP60 di coniglio. (1:500, Anticorpi-online). Per valutare la vitalità mediante MTT come descritto sopra, abbiamo lasciato il trattamento per 24 ore.

2.8. Misurazione della produzione di superossido mitocondriale e ∆ψM

Le cellule sono state incubate con 2,5 µM di MitoSOX per l'analisi del superossido o con 2,5 µMTMRM per l'analisi ∆ψM, sia da sonde molecolari che da Invitrogen durante gli ultimi 30 minuti di trattamento. La fluorescenza è stata rilevata con un microscopio Olympus IX81 e quantificata utilizzando il software di citometria statica.

2.9. Misura elettrochimica del consumo di ossigeno

Le cellule (1 × 106 per 1 mL in HBSS) sono state agitate in una camera a tenuta di gas a 37 ◦C. Le misurazioni sono state effettuate con un elettrodo O2 di tipo Clark (Rank Brothers, Cambridge, Regno Unito) e registrate con i dati Dup.18 dispositivo di acquisizione (WPI) immediatamente dopo il 5-htrattamento con veicolo o Tun.

2.10. Frazionamento mitocondriale e citosolico

Le cellule sono state omogeneizzate in tampone di lisi (HEPES 10 mM, pH 7,4, EGTA 1 mM, saccarosio 250 mM e un cocktail di proteasi (Sigma-Aldrich) e inibitori della fosfatasi (Roche)) con un omogeneizzatore Potter su ghiaccio.

Dopo la centrifugazione dei lisati a 2000× g per 5 minuti, il surnatante è stato centrifugato a 10.000× g per 12 minuti. Il surnatante è stato considerato la frazione solubile (S2) e contiene proteine ​​citosoliche e microsomi.

Il pellet (P2) era la frazione mitocondriale arricchita, che è stata risospesa in tampone RIPA modificato (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP{{8 }}, 0,5% sodiodesossicolato, 0,1% SDS, cocktail di proteasi e fosfatasi) e la concentrazione proteica è stata determinata mediante dosaggio BCA. I campioni sono stati poi elaborati per il western blot.

2.11. Microscopia elettronica a trasmissione

Abbiamo immerso i segmenti L{{0}}L5 del midollo spinale (fette da 1-mm) in una soluzione fissativa di PFA al 2% (p/v) e glutaraldeide al 2,5% (v/v) (grado EM) in 0.1 M PBS, pH 7,4 e posizionati su una piattaforma oscillante per 2 ore, quindi fissati in PFA all'1% (p/v) e successivamente postfissati con tetrossido di osmio all'1% (p/v) (TAAB Lab ) contenente lo 0,08% (p/v) di esacianoferrato di potassio (Sigma-Aldrich) in PBS per 2 ore.

Abbiamo eseguito quattro lavaggi con acqua deionizzata e successiva disidratazione in acetone. Tutte le procedure sono state eseguite a 4 ◦C, come precedentemente descritto [33]. Abbiamo incorporato i campioni in resina EPON e polimerizzati a 60 ◦C per 48 ore.

I campioni sono stati elaborati per ottenere sezioni semisottili (1 µm) con un microtomo Leicaultracut UCT, colorati con una soluzione acquosa di blu di toluidina all'1% (p/v) ed esaminati con un microscopio ottico per identificare le aree del corno ventrale arricchite con MN.

Sezioni ultrasottili (70 nm) sono state tagliate con un coltello diamantato, posizionate su griglie rivestite e confrontate con soluzioni convenzionali di acetato di uranile e citrato di piombo di Reynolds.

Infine, abbiamo osservato le sezioni con un microscopio elettronico a trasmissione (Jeol 1400) dotato di una fotocamera Gatan Ultrascan ES1000CCD. Abbiamo selezionato tre fette per condizione, analizzato tre MN per sezione e misurato le aree dei nuclei rispetto all'area totale del MN utilizzando gli strumenti ImageJ.

2.12. Bioinformatica e statistica

Abbiamo utilizzato l'analisi della varianza (ANOVA) per confrontare i valori tra diversi gruppi sperimentali per i dati che soddisfacevano il presupposto di normalità. Le differenze tra i gruppi sono state analizzate utilizzando un'ANOVA unidirezionale, seguita dal test a range multiplo post hoc di Tukey o utilizzando il test t di Student. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software GraphPad Prism5 (n=3–5; p < 0.05 per la significatività).

3. Risultati

3.1. Testo

3.1.1. L'analisi proteomica della sovraespressione di GRP78 ha rivelato che i mitocondri sono il bersaglio principale

Al fine di identificare i meccanismi molecolari che portano alla neuroprotezione mediata dalla sovraespressione di GRP78, abbiamo eseguito un'analisi proteomica comparativa senza etichetta per identificare differenze sia quantitative che qualitative tra animali affetti da RA e infettati con adenovirus per sovraespressione di GRP78 (Ad-GRP78), precedentemente ritenuto neuroprotettivo di MN o beta-galattosidasi (Ad-ß-Gal) come controllo [20].

I sette giorni successivi all'infortunio (dpi) sono stati il ​​punto temporale scelto per l'analisi secondo studi precedenti condotti nel nostro laboratorio [20,25]. In un precedente confronto tra un modello di rigenerazione dopo assotomia distale e sutura del nervo sciatico rispetto al nostro modello di RA degenerativa, abbiamo osservato che gli eventi di segnalazione erano simili fino a 7 dpi, quando emersero eventi divergenti pro-degenerativi dopo RA [20,25].

L'analisi LC-MS/MS senza etichetta delle frazioni post-nucleari dei segmenti del midollo spinale L4-L5 ha portato all'identificazione di 1420 proteine, con almeno due peptidi per proteina, come precedentemente riportato per altri campioni e studi [25] .

Un totale di 566 e 732 proteine ​​o peptidi erano significativamente alterati a causa della sovraespressione di Ad-GRP78 o Ad-ß-Gal, rispettivamente, negli animali feriti da RA rispetto agli animali feriti da RA non infettati da un virus (p < 0 .05) (Tabelle S1 e S2).

Abbiamo confrontato entrambi gli elenchi e scoperto che 220 erano alterati in modo univoco a causa della sovraespressione di Ad-GRP78 (Tabella S3). L'annotazione funzionale di queste proteine ​​utilizzando lo strumento Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID) ci ha permesso di identificare le funzioni biologiche più significative nel set di dati (FDR <0,05) [34,35].

La sovraespressione di GRP78 ha comportato differenze nei livelli di proteine ​​coinvolte nei processi, nelle funzioni e nei componenti mitocondriali (Tabella S4A–C, Figura S1A–C). I termini di Gene Ontology (GO) e l'analisi di arricchimento del percorso KEGG di questi dati hanno rivelato che negli animali infettati con Ad-GRP78 si sono verificate diminuzioni significative nei livelli di molte proteine ​​con funzioni mitocondriali, comprese le proteine ​​della faccia mitocondriale esterna ed interna, le proteine ​​del complesso respiratorio, e proteine ​​della matrice.

Abbiamo confermato le differenze nei livelli di proteine ​​rivelate nell'elenco proteomico, come GRP75, che era sovraregolato (p < 0.05), e la subunità del complesso V (CV), sottoregolata (p=0.03) nei gruppi GRP78 come previsto (Figura 1A).

Nell'intero elenco, le più sottoregolate sono state la 2-proteina di trasporto ossoglutarato/malate OGC (SCL25A11), MT-ND3 (un soppressore del tumore che partecipa alla navetta malato-aspartato e rigenera il pool NADH nella matrice mitocondriale per consentire il complesso I), la subunità 3 della NADH deidrogenasi del complesso I, l'aminotransferasi dell'acido gammaaminobutirrico ABAT e la subunità dell'ubichinolo-citocromo C reduttasi del complesso III. Al contrario, pochissime proteine ​​erano sovraregolate (Figura 1B).

Una proteina sovraregolata era GRP78 come previsto, e le altre proteine ​​sovraregolate erano il trasportatore di aminoacidi EAAT2, che si trova principalmente nella membrana plasmatica e talvolta nei mitocondri nelle sinapsi eccitatorie, e l'idrossiacil-CoA deidrogenasi HADHA, che catalizza le ultime tre fasi della beta mitocondriale. -ossidazione degli acidi grassi a catena lunga.

Abbiamo esteso l'analisi per indagare se altre proteine ​​nei mitocondri o proteine ​​correlate alla funzione dei mitocondri sono state modificate dall'elenco proteomico per confermare l'influenza funzionale dei mitocondri (Figura 1C).

Abbiamo osservato che l'atrofia ottica mitocondriale conservata della GTPasi correlata alla dinamina 1 (OPA1), che è coinvolta nella fusione [36], era sottoregolata (p < 0.1); LONP1, una proteasi ATP-dipendente che media la degradazione selettiva dei polipeptidi mal ripiegati, presentava una tendenza ad aumentare, ma non sono state osservate differenze nei livelli di ubichinone NDUFA9, il fattore di trascrizione NRF2, che regola i geni che contengono elementi di risposta antiossidanti, o altri dinamin -GTPasi correlate coinvolte nell'infusione, come la mitofusina 2 (MFN2) [36].

Un riepilogo completo delle alterazioni riscontrate nei mitocondri è mostrato nello schema della Figura 1D. Le dinamiche mitocondriali sono importanti per le risposte allo stress poiché i mitocondri danneggiati possono fondersi per lo scambio di materiale e la fissione mitocondriale consente la segregazione dei mitocondri danneggiati e la successiva mitofagia [37].

Considerando che il maggior numero di proteine ​​sottoregolate si localizzano nei mitocondri e che non sono stati osservati cambiamenti evidenti riguardo all'attività di fusione dei mitocondri analizzando MFN2 e il rapporto tra le forme L/S OPA1 (Figura 1C), abbiamo studiato i marcatori correlati alla mitofagia.

Classicamente, la degradazione dei mitocondri dipendente dall'autofagia si verifica in seguito alla depolarizzazione e di solito è innescata dall'aumento dell'accumulo della putativa chinasi 1 (PINK1) indotta da fosfatasi e tensinomologo (PTEN) su tutta la lunghezza della membrana mitocondriale esterna.

Successivamente, la proteina ubiquitina-ligasi Parkin E3 tra gli anelli viene reclutata per marcare la proteina della membrana esterna mitocondriale dei mitocondri depolarizzati mediante ubiquitilazione [38-41]. La parte superiore della Figura 2A non mostra cambiamenti nei livelli di Parkin ma una riduzione significativa del PINK1 a tutta lunghezza prodotto dalla lesione RA nel segmento del midollo spinale ipsilaterale L4-L5 rispetto al controllo a 7 dpi. Al contrario, la sovraespressione di GRP78 ha ridotto Parkin ma ha raddoppiato i livelli di PINK1 dopo RA rispetto all'espressione di controllo della proteina non correlata -Gal (Figura 2A, in basso).

La sovraregolazione di PINK1 a lunghezza intera è coerente con l'induzione della mitofagia [42], e la riduzione di Parkina potrebbe essere correlata a uno stato avanzato di smantellamento degli organelli, come osservato dal resto delle proteine ​​mitocondriali.

Investighiamo ulteriormente sulla co-localizzazione dei mitocondri e dei puncta positivi della catena leggera 3 (LC3) delle proteine ​​associate ai microtubuli 1A/1B, un componente chiave del meccanismo principale della macroautofagia e necessario per il processo mitofagico [43].

Utilizzando la microscopia confocale, abbiamo osservato un aumento significativo nella co-localizzazione dei mitocondri, etichettati utilizzando anti-COX IV, con punti LC3-positivi dopo RA solo nei MN danneggiati che sovraesprimono GRP78 a 7 dpi (Figura 2B).

Abbiamo confermato l'esistenza della mitofagia nei MN avulsi solo quando sovraesprimono GRP78 mediante l'analisi dei campioni utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione.

Abbiamo osservato abbondanti vacuoli con mitocondri inghiottiti, un segno distintivo della mitofagia [37], somiglianti ai mitofagosomi, e diversi ERcisternae in stretta connessione con i mitocondri all'interno dei MN di animali Ad-GRP78, ma non li abbiamo rilevati in Ad- -Gal RA-feriti campioni di ratto a 5 dpi (Figura 2C).

Figura 1. La sovraespressione di GRP78 negli animali danneggiati dall'artrite reumatoide prende di mira le proteine ​​mitocondriali. (A) Immunoblot e grafici a barre che mostrano le variazioni medie delle pieghe (± SEM) dei livelli di proteina GRP78, GRP75 e CV nei segmenti del midollo spinale L4-L5 in GRP78 vs.

-Gal che sovraesprime i ratti affetti da AR di 7 dpi. I livelli sono stati normalizzati ai valori di actina (n=4; * p < 0.05 vs.Ad- -Gal, test t di Student). (B) Istogramma delle modifiche del ripiegamento delle proteine ​​mitocondriali ottenuto mediante analisi proteomica dei segmenti del midollo spinale L4-L5 di animali affetti da RA che sovraesprimono GRP78 rispetto al gruppo Ad- -Gal di 7 dpi. (C) Immunoblot e grafici a barre che mostrano i cambiamenti medi di piega (± SEM) di NDUFA9, LONP1, NRF2, MFN2, OPA-1 normalizzati in actina. (Nessuna differenza significativa tra i gruppi. Test t di Student). (D) Mitocondri schematici con proteine ​​alterate dalla sovraespressione di GRP78 nei segmenti del midollo spinale L4-L5 di animali affetti da AR evidenziati in giallo (diminuito) o in blu (aumentato) a 7 dpi.

Figura 2. La mitofagia è modulata in vivo dopo RA nei ratti che sovraesprimono GRP78. (A) Immunoblot e grafici a barre corrispondenti per l'analisi del cambiamento di piega PINK1 e PARK dei livelli di proteine ​​(medie ± SEM) normalizzati ai livelli di actina, nei segmenti del midollo spinale L4-L5 di ratti feriti da AR vs.

controllo (in alto) o dai gruppi Ad{{0}}Gal e Ad-GRP78 (in basso) di 7 dpi. (n=4; * p < 0,05, test t di Student). (B) A sinistra, microfotografie di MN rappresentativi nel sito ipsilaterale di animali feriti che hanno ricevuto un'iniezione intratecale di gruppi AAVrh10-GFP o AAVrh10-GRP78 a 7 dpi. I campioni sono stati colorati per COX IV (rosso) e LC3 (verde) e controcolorati con Nissl fluorescente (blu).

Barra della scala=10 µm e zoom digitale negli inserti 10X.

Tieni presente che la co-localizzazione è osservata solo nel gruppo AAVrh10-GRP78. A destra, grafico a barre che mostra l'analisi della% dei punti di co-localizzazione di COX IV e LC3. Media ± SEM della co-localizzazione di COX IV e LC3 (n=4; ** p < 0.01, test t di Student). (C) Immagini rappresentative di microscopia elettronica a trasmissione in cui i mitocondri si distinguono all'interno dei MN del midollo spinale: a, immagine del citoplasma MN che mostra i mitocondri nell'animale incontrollo; b, immagine del citoplasma MN di ratto ferito da RA del gruppo Ad- -gal; c, immagine del citoplasma MN di ratto ferito da RA del gruppo Ad-GRP78 con alcuni mitocondri inghiottiti indicati con asterischi rossi; d, l'immagine con un ingrandimento maggiore è mostrata in (C) evidenziando un grande mitocondrio e un contatto ER. Le barre della scala sono indicate nelle figure.

Complessivamente, questi risultati suggeriscono che la sovraespressione di GRP78 può indurre MN disconnessi dalla mitofagia dopo l'artrite reumatoide e potrebbe promuovere la neuroprotezione.

3.1.2. La sovraespressione di GRP78 ripristina la funzione mitocondriale danneggiata

Abbiamo quindi studiato ulteriormente l'effetto della sovraespressione di GRP78 sui mitocondri utilizzando un modello in vitro di stress ER poiché questo insulto appare subito dopo la lesione dell'artrite reumatoide in vivo come riportato in precedenza [20,26], ed è un metodo affidabile per selezionare nuovi agenti neuroprotettivi [2,44 ].

Questo modello utilizza la tunicamicina (Tun), che è un induttore dello stress ER che provoca la formazione di intermedi N-acetilglucosamina-lipidi, prevenendo così la glicosilazione delle proteine ​​appena sintetizzate e portando al ripiegamento errato delle proteine. L'abbiamo utilizzato perché è stato segnalato che un percorso secretorio interrotto è fondamentale nel processo neurodegenerativo dopo l'artrite reumatoide [26].

Abbiamo innanzitutto verificato che la nucleofezione delle cellule simili al motoneurone NSC34 con un vettore appropriato ha portato alla produzione di GRP78 (Figura 3A). In queste cellule, l'espressione di GRP78 ha migliorato significativamente la sopravvivenza nel terreno contenente Tun (Figura 3B).

Sebbene il trattamento con Tun normalmente induca lo stesso GRP78, questa sovraespressione endogena è piuttosto tardiva (entro 24 ore) (Figura S2). Ci siamo anche chiesti se potessimo determinare se la sovraespressione di GRP78 ha effetti neuroprotettivi in ​​un altro modello in vitro che avevamo precedentemente segnalato per riprodurre diverse caratteristiche della morte di MN dopo la lesione dell'artrite reumatoide [26].

Questo modello si basa sul danno citoscheletrico indotto dal nocodazolo, che interferisce con la polimerizzazione dei microtubuli. L'espressione di GRP78 ha aumentato la vitalità delle cellule coltivate anche in presenza di nocodazolo (Figura 3B).

Quindi, abbiamo valutato la funzione mitocondriale misurando la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) nei mitocondri utilizzando MitoSOX, il potenziale di membrana mitocondriale (∆ψm) utilizzando tetrametilrodamina metil estere (TMRM) e il tasso di consumo di O2, nelle nostre cellule NSC34 sottoposte a stress ER. con o senza sovraespressione di GRP78.

Come controllo positivo, abbiamo utilizzato efavirenz (EFV), un agente mitotossico che altera tutti e tre i parametri [45]. Abbiamo osservato che i livelli di MitoSOX aumentavano progressivamente dopo l'aggiunta di Tun, raggiungendo la significatività statistica entro 24 ore e che la generazione di ROS era aumentata significativamente nelle cellule trattate con EFV dalla prima ora post-trattamento rispetto ai controlli trattati con veicolo (Figura S3A).

La sovraespressione di GRP78 ha portato a livelli significativamente più bassi di ROS nei mitocondri rispetto alle cellule che esprimono GFP a 24 ore dopo il trattamento con Tun o EFV (Figura 3C). Il ∆ψm è crollato dopo 5 e 24 ore di trattamento con Tun e dopo 24 ore di trattamento con EFV (Figura S3B). Il recupero di questo parametro è stato ottenuto dalla sovraespressione di GRP78 nelle cellule trattate con Tun o EFV (Figura 3D).

Il tasso di consumo di O2 è diminuito durante 80 minuti di analisi dopo l'aggiunta di Tun nelle cellule che esprimono GFP (pendenza −0.063,R2=0.98), ma il consumo di O2 è diminuito stabile nelle cellule che sovraesprimono GRP78- nonostante la presenza di Tun (pendenza −0,221, R2=0.99) (Figura 3E, a sinistra).

Dopo 5 ore, la respirazione era normale nelle cellule che sovraesprimevano GRP78- mentre era gravemente compromessa nelle cellule che esprimevano GFP (Figura 3E, a destra). Complessivamente, questi risultati suggeriscono che GRP78 attenua la disfunzione mitocondriale causata dallo stress ER o dalla mitotossicità.

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