L'estratto di Herba Cistanche migliora lo stato del glutatione mitocondriale e la respirazione nei cuori di ratto, con possibile induzione di proteine ​​disaccoppianti

Ada Hoi-Ling Siu e Kam Ming Ko

Per citare questo articolo: Ada Hoi-Ling Siu & Kam Ming Ko (2010) L'estratto di Herba Cistanche migliora lo stato del glutatione mitocondriale e la respirazione nei cuori di ratto, con possibile induzione di proteine ​​disaccoppianti, Biologia farmaceutica, 48:5, 512-517, DOI: 10.3109/13880200903190985

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Astratto

ErbaCistanche, un'erba cinese derivata dall'intera pianta diCistanchedeserticoYC Ma (Orobanchaceae), ha dimostrato di aumentare la generazione di ATP mitocondriale e di proteggere dal danno da ischemia/riperfusione miocardica (I/R) ex vivo nei ratti. Per definire il ruolo dei mitocondri nell'azione cardioprotettiva di Herba Cistanche, abbiamo studiato l'effetto di HerbaCistanchetrattamento sullo stato del glutatione mitocondriale e sui parametri funzionali nei cuori di ratto. Trattamento con un estratto metanolo di HerbaCistanchestato migliorato del glutatione mitocondriale, diminuzione del contenuto mitocondriale di Ca2 plus e aumento del potenziale della membrana mitocondriale. Inoltre, nei mitocondri isolati da Herba è stato osservato un aumento della respirazione di stato 4, indicativo di respirazione disaccoppiata.Cistanche-cuori di topo trattati. Il miglioramento dello stato del glutatione mitocondriale e della capacità funzionale, così come la presunta induzione di proteine ​​disaccoppianti, possono essere correlati alla cardioprotezione offerta da HerbaCistanchetrattamento protettivo contro le lesioni I/R.

Cistancheha molti benefici per la salute

Parole chiave:ErbaCistanche; mitocondri; glutatione; calcio; potenziale di membrana; respirazione mitocondriale; disaccoppiamento

introduzione

La riperfusione di un miocardio precedentemente ischemico provoca una serie di alterazioni mitocondriali, tra cui aumento della produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), sovraccarico di Ca2 più e un calo della produzione di adenosina trifosfato (ATP), che possono portare a necrosi e/o apoptosi. morte cellulare mediata (Redegeld et al., 1992; Lemasters et al., 1998). Poiché i mitocondri svolgono un ruolo cruciale nel determinare il destino dei cardiomiociti a seguito della sfida di ischemia/riperfusione (I/R), la protezione contro il danno miocardico I/R dovrebbe quindi essere mirata alla conservazione dell'integrità strutturale e funzionale mitocondriale. Il mantenimento del metabolismo energetico mitocondriale dopo la sfida I/R è particolarmente importante perché la funzione contrattile del cuore dipende quasi interamente dall'ATP generato dai mitocondri. I cardiomiociti che sono vivi ma non si contraggono sono di scarsa utilità.

Herba Cistanche, l'intera pianta essiccata di Cistanche deserticola YC Ma (Orobanchaceae), è una pianta parassitaria che cresce principalmente nelle aree desertiche del nord e nord-est della Cina. Herba Cistanche, classificata come erba "rinvigorente Yang" nella medicina cinese, è prescritta per la deficienza renale, la sterilità femminile e la stitichezza derivante dalla secchezza intestinale nei pazienti senili (Chen, 1998). Precedenti studi nel nostro laboratorio hanno dimostrato che un estratto di metanolo di Herba Cistanche aumenta la capacità di generazione di ATP miocardico (Leung & Ko, 2008) e protegge dal danno miocardico I/R nei ratti (Leung, 2006). Mentre la stimolazione della capacità di generazione di ATP era parallela al miglioramento del trasporto di elettroni mitocondriali (Leung & Ko, 2008), la cardioprotezione contro le lesioni I/R offerte dal trattamento con Herba Cistanche era associata a una diminuzione della deplezione miocardica di ATP (Leung, 2006). Nel presente studio, per definire il ruolo dei mitocondri nell'azione cardioprotettiva di Herba Cistanche, abbiamo studiato l'effetto del trattamento Herba Cistanche sullo stato del glutatione mitocondriale, sul contenuto di Ca2 plus, sul potenziale di membrana e sulla frequenza respiratoria, nei cuori di ratto.

cistancebenefici della deserticola

Materiali e metodi

Materiale a base di erbe

Herba Cistanche è stata acquistata da un commerciante di erbe locale (con sede a Hong Kong) (Lee Hoong Kee). L'erba è stata autenticata dal fornitore e un campione di voucher (HKUST00301) è stato depositato presso il Dipartimento di Biochimica dell'Università di Scienza e Tecnologia di Hong Kong (HKUST). È stata condotta l'estrazione con metanolo dell'erba, sulla base di studi precedenti che indicavano che un tale estratto migliorava la generazione di ATP mitocondriale e proteggeva contro le lesioni I/R nei cuori di ratto (Leung, 2006; Leung & Ko, 2008). In breve, Herba Cistanche (400 g) è stata tagliata in piccoli pezzi ed estratta riscaldando a riflusso in 300 ml di metanolo a 60 gradi per 2 ore, come precedentemente descritto (Leung & Ko, 2008). La procedura è stata ripetuta due volte. L'estratto riunito è stato essiccato evaporando il solvente a pressione ridotta; la resa era del 42% (p/p) rispetto alla quantità di erba grezza. L'estratto è stato conservato a 4 gradi fino al momento dell'uso. Sebbene le erbe cinesi siano tradizionalmente estratte con acqua per il consumo orale, nel nostro studio precedente è stato utilizzato il metanolo per comodità nell'elaborazione e nella conservazione dei campioni (Yim & Ko, 2002) e abbiamo riscontrato che l'estrazione del metanolo è soddisfacente sotto tutti gli aspetti.

Cura degli animali e trattamento farmacologico

Ratti Sprague-Dawley femmine adulti (8–10 settimane di età; 2{{10}}0–230 g) sono stati alloggiati in una stanza a umidità controllata, con 12 ore di buio/luce ciclo, a circa 22 gradi, e permesso cibo e acqua ad libitum. Gli animali sono stati assegnati in modo casuale a diversi gruppi, con cinque animali in ciascun gruppo. I ratti hanno ricevuto l'estratto di Herba Cistanche per via intragastrica (0,2 g/mL in acqua) a 0,5 g/kg o 1,0 g/kg per 3 giorni consecutivi. Gli animali di controllo (non trattati) hanno ricevuto solo acqua. Ventiquattro ore dopo l'ultima somministrazione, il tessuto ventricolare cardiaco è stato ottenuto da animali anestetizzati per l'analisi biochimica. Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Research Practice Committee, HKUST.

Preparazione di frazioni mitocondriali

I tessuti ventricolari del cuore tritato (~{0}}.6g) sono stati omogeneizzati in un eccesso di 10-piega (w/v) di tampone di saccarosio ghiacciato [saccarosio 0,32M, acido etilendiamminotetraacetico 1mM (EDTA), 50 mM Tris/HCl; pH 7,4] utilizzando un omogeneizzatore di vetro Teflon, a 4000 rpm, con 25-30 colpi. I pellet mitocondriali sono stati preparati da omogenati di tessuto mediante centrifugazione a 800 × g a 4 gradi per 30 minuti e la purezza è stata determinata misurando le attività specifiche relative della succinato deidrogenasi e della lattato deidrogenasi rispettivamente nel surnatante e nel pellet, come descritto in precedenza (Evans, 1992). I pellet mitocondriali sono stati sospesi in 1 ml di tampone omogeneizzante.

Misurazione dei livelli mitocondriali di glutatione ridotto e glutatione ossidato

I livelli mitocondriali di glutatione ridotto (GSH) sono stati determinati enzimaticamente utilizzando 5,59-ditiobis(2- acido nitrobenzoico) (DTNB) e glutatione reduttasi (GR), in un protocollo modificato da Griffith (198{{17} }). Un'aliquota (210 µL) della frazione mitocondriale è stata miscelata con 90 µL di 10 percento (v/v) {7}}acido solfosalicilico (SSA) e la miscela è stata centrifugata a 600 × g per 10 minuti. Per misurare i livelli di glutatione ossidato (GSSG), quantità di 100 µl di supernatanti SSA sono state mescolate con 10 µl di piridina vinilica al 20 percento (p/v) 2- e 10 µ l di trietanolammina al 60 percento (v/v) in provette per microcentrifuga. Ciascuna provetta è stata lasciata a temperatura ambiente per almeno 1 ora. Una miscela di reazione contenente 0,63 mM DTNB e 0,053 mM NADPH (nicotinamide adenina dinucleotide ridotto del fosfato) in tampone fosfato (0,1 M, con Na2 EDTA 5 mM; pH7,5) è stata pre-incubata a 30 gradi per 2 minuti. Un'aliquota (30 µL) di un surnatante del campione SSA (glutatione totale) o un campione GSSG è stata aggiunta a un pozzetto di una piastra per microtitolazione 96- e 180 µL della miscela di reazione preriscaldata, contenente 0,525U /mL GR, è stato poi aggiunto. Le variazioni di assorbanza a 412 nm sono state monitorate spettrofotometricamente per 5 minuti. Le concentrazioni di GSH e GSSG sono state stimate dalle curve di calibrazione utilizzando GSH e GSSG [disciolto in 3 percento (p/v) SSA] come standard ed espresse come proteine ​​nmol/mg. I livelli di GSH sono stati stimati sottraendo il doppio della quantità di GSSG da quella del GSH totale.

Misurazione del contenuto mitocondriale di Ca2 plus

Il contenuto mitocondriale di Ca2 plus è stato misurato utilizzando una sonda a fluorescenza sensibile al Ca2 plus, estere Fluo-5N AM (Molecular Probes, Eugene, OR) impiegando il contatore multietichetta Victor2 (Modello 1420; PerkinElmer, Turku, Finlandia), come descritto in Menze et al. (2005). Le costanti di dissociazione Ca2 plus (valori Kd) sono state determinate utilizzando un kit di calibrazione Ca2 plus valido nell'intervallo di concentrazione 1–1000 µM; i valori di Kd stimati erano 90–100 µM, con elevata affidabilità, secondo i dati del produttore del kit. Un'aliquota (25μL) della frazione mitocondriale (0,5 mg di proteina/mL di concentrazione finale) è stata miscelata con 25 μL di tampone di incubazione {100 mM KCl e 30 mM MOPS [3-(N-morfolino)acido propano solfonico]; pH7,2} in una 96-piastra da microtitolazione nera. La miscela è stata incubata a 25 gradi per 15 minuti; Sono stati quindi aggiunti 25 µL di digitonina (50 µg/mL) e 25 µL di estere Fluo-5N AM (1 µM in 0,005 percento (p/v) Pluronico F-127). Facilitando la permeazione della membrana, la digitonina ha mediato l'ingresso mitocondriale del colorante fluorescente. Abbiamo scoperto che i livelli di Fluo-5N nelle preparazioni mitocondriali del cuore di ratto erano aumentati 20-di volte in presenza di digitonina. Le miscele di reazione sono state incubate a 25 gradi per 30 minuti e le letture di fluorescenza sono state misurate a una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 532 nm. I contenuti mitocondriali di Ca2 plus sono stati stimati utilizzando una curva di calibrazione ed espressi come proteina µmol/mg.

Misurazione del potenziale di membrana mitocondriale

Il potenziale di membrana (ΔΨm) è stato valutato con un metodo modificato da quello di Bonavita et al. (2003), utilizzando un colorante fluorescente, la sonda cationica lipofila 5.596,69- tetracloro-1,193,39-tetraetilbenzimidazolilcarbocianina ioduro comunemente chiamato JC-1. Aliquote (50 μL) di frazioni mitocondriali (aggiustate a 1 mg di proteina/mL) sono state incubate a 37 gradi con 50 μL di soluzione di substrato (contenente 6 mM di piruvato e 6 mM di malato), 25 μL di soluzione di adenosina difosfato (ADP) (30 mM) pretrattata, e 25 µL di 3 µM JC-1, al buio. I valori ΔΨm sono stati ottenuti misurando la fluorescenza a 535 nm (FL1) rispetto a 580 nm (FL2), utilizzando il contatore multi-etichetta Victor2. Le forme JC-1 si aggregano nei mitocondri, determinando valori di fluorescenza FL2 elevati e indicando un potenziale mitocondriale normale. La perdita di ΔΨm porta a una riduzione della fluorescenza FL2 (aggregati JC-1 in misura minore) e un concomitante aumento della fluorescenza FL1 (dai monomeri JC-1). I dati sono stati espressi come rapporti dei valori di fluorescenza FL1/FL2. Per convalidare il test è stato utilizzato il carbonil cianuro m-clorofenilidrazone (CCCP), un agente di collasso ΔΨm.

Misurazione della respirazione mitocondriale

La frequenza respiratoria mitocondriale è stata misurata a 37 gradi utilizzando uno strumento Hansatech Oxygraph-Plus dotato di un elettrodo di ossigeno di tipo Clark (Sarasota, FL, USA). Le frazioni mitocondriali (0.6 mg di proteina/mL) sono state sospese in un tampone di respirazione contenente 125 mM di KCl, 20 mM MOPS, 10 mM di Tris, 0,5 mM di acido tetraacetico di glicole etilenico (EGTA) e 2 mM di KH2 PO4; pH 7,2. Dopo l'incubazione a 37 gradi per 2 minuti, ogni campione ha ricevuto 50 µl di soluzione di substrato (5 mM di piruvato e 5 mM di malato). Le frequenze respiratorie sono state misurate in presenza (stato 3) di 1 mM di ADP e dopo la fosforilazione di tutto l'ADP in ATP (stato 4). Il rapporto tra le frequenze respiratorie di Stato 3: Stato 4 è l'indice di controllo respiratorio, che indica la rigidità dell'accoppiamento tra respirazione e fosforilazione (Javadov et al., 2005; Kuwabara et al., 1997). Prima dell'aggiunta della soluzione di substrato, la frequenza respiratoria dello stato 1 è stata misurata fino all'inizio della respirazione dello stato 2 e la frequenza respiratoria dello stato 2 è stata stimata prima dell'aggiunta di ADP.

analisi statistica

I dati sono stati analizzati mediante analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) per confronti di più gruppi. I valori di differenza meno significativa (LSD) sono stati utilizzati per identificare differenze significative tra i due gruppi quando i valori di p erano <>

Cistanchehamedicinalevalore

Risultati

Come mostrato nelle Figure 1 e 2, il trattamento con un estratto metanolo di Herba Cistanche (0.5 o 1.0g/kg/giorno×3) ha migliorato significativamente lo stato di glutatione mitocondriale nei cuori di ratto, poiché evidenziato da aumenti dose-dipendenti dei livelli di GSH (11-30 percento) e diminuzioni dei livelli di GSSG (31 percento).

Il trattamento con Herba Cistanche ha ridotto in modo dose-dipendente i livelli mitocondriali di Ca2 plus nei cuori di ratto rispetto ai controlli; la soppressione era del 41% a una dose di 1.0 g/kg (Figura 3).

Il trattamento con Herba Cistanche ha aumentato il ΔΨm mitocondriale, come evidenziato da una diminuzione (14-16%) del rapporto FL1/FL2. CCCP (100 µM) ha causato il collasso di ΔΨm, come indicato da un aumento del rapporto FL1/FL2 (Figura 4).

Il trattamento con Herba Cistanche ha migliorato la respirazione mitocondriale, come evidenziato da un tasso significativamente più alto di respirazione di Stato 3 (84%) negli animali di prova rispetto ai controlli (Tabella 1). I livelli di respirazione dello stato 2 e dello stato 4 sono stati aumentati rispettivamente del 47 e dell'80 percento, ma la stimolazione della respirazione dello stato 4 è stata completamente soppressa dalla guanosina{9}}'-difosfato 1 mM, un inibitore della proteina disaccoppiante 2/3. Il trattamento con Herba Cistanche non ha influenzato l'indice di controllo respiratorio, come stimato dal rapporto tra le frequenze respiratorie di Stato 3/Stato 4.

Cistanchehaneuroprotettivoproprietà

Discussione

I mitocondri isolati dai cuori di ratto trattati con Herba Cistanche hanno mostrato uno stato di glutatione migliorato, come indicato dall'aumento dei livelli di GSH e dalla diminuzione dei livelli di GSSG. Il mantenimento dello stato redox del glutatione mitocondriale è fondamentale per la cardioprotezione contro le lesioni I/R (Chiu & Ko, 2003). Il contenuto di Ca2 plus citosolico aumenta durante l'ischemia miocardica, attraverso l'assorbimento da parte della membrana interna di Ca2 plus uniporter (Ataka et al., 1992; Grover et al., 1990), portando all'accumulo di Ca2 plus mitocondriale. I nostri risultati indicano che il trattamento con estratti di Herba Cistanche ha migliorato lo stato redox del glutatione mitocondriale e ha ridotto il livello mitocondriale di Ca2 plus, che può offrire protezione contro il danno miocardico I/R (Leung, 2006). L'incapacità del trattamento con Herba Cistanche, a una dose maggiore di 1,0 g/kg, di ridurre ulteriormente i livelli di GSSG e Ca2 plus può essere correlata all'esistenza di un meccanismo di regolazione autolimitante che influenza il potenziale redox del glutatione e lo stato del calcio nei mitocondri.

I mitocondri generano un gradiente protonico elettrochimico attraverso la membrana interna, mediante trasporto di elettroni. Questo gradiente viene utilizzato dall'ATP sintasi per fosforilare l'ADP in ATP. La diminuzione del potenziale della membrana mitocondriale, come nell'ipossia/riossigenazione dopo la lesione dei cardiomiociti in coltura (Chiu et al., 2008), si traduce in una riduzione della generazione di ATP. Il trattamento con Herba Cistanche, che può aumentare il potenziale della membrana mitocondriale del miocardio, può aumentare la produzione di ATP, in particolare durante la riperfusione post-ischemica. Ancora una volta, l'esistenza di un meccanismo di regolazione autolimitante può spiegare perché gli effetti del trattamento Herba Cistanche sul potenziale della membrana mitocondriale non sono dose-dipendenti.

Il trattamento con Herba Cistanche ha notevolmente aumentato la frequenza respiratoria dello Stato 3 nei mitocondri del cuore di ratto, come valutato dal consumo di ossigeno. Questo risultato è coerente con i risultati ottenuti dalle misurazioni in vitro e situ della capacità di generazione di ATP mitocondriale (Leung & Ko, 2008). È interessante notare che, sebbene il trattamento con Herba Cistanche abbia ridotto il livello di ATP miocardico allo stato stazionario (dati non mostrati), il trattamento ha migliorato la generazione di ATP mitocondriale. Il coinvolgimento della respirazione disaccoppiata può spiegare queste osservazioni discrepanti. La fosforilazione ossidativa disaccoppiata si verifica quando i protoni vengono spostati attraverso la membrana interna mitocondriale nella matrice mitocondriale, dissipando così il potenziale di membrana formato dalla catena di trasporto degli elettroni. Ciò si traduce nella riduzione della forza motrice protonica che guida la formazione di ATP (Garvey, 2003). Di conseguenza, la concentrazione di Ca2 più e la produzione di ROS nei mitocondri sono drammaticamente attenuate (Teshima et al., 2003). Questo suggerimento è coerente con i risultati del presente studio, che ha mostrato una diminuzione dei livelli mitocondriali di Ca2 plus nei cuori trattati con Herba Cistanche. Per quanto riguarda la respirazione disaccoppiata, la sintesi delle proteine ​​disaccoppianti (UCP) può essere indotta dal trattamento con Herba Cistanche. È noto che gli UCP disaccoppiano la fosforilazione ossidativa e l'espressione di UCP1 nei cuori di topi transgenici protetti contro il danno miocardico indotto da I/R (Hoerter et al., 2004). L'effetto di disaccoppiamento degli UCP è stato inibito dai nucleotidi purinici difosfati e trifosfati (come ADP, ATP, guanosina difosfato (GDP) e GTP) (Echtay et al., 2002). Nel presente studio, i parametri mitocondriali come il potenziale di membrana e la frequenza respiratoria sono stati misurati in presenza di ADP (come substrato); l'effetto disaccoppiante degli UCP è stato quindi inibito. Tuttavia, quando la frequenza respiratoria mitocondriale dello Stato 4 è stata misurata in assenza di ADP, questa frequenza era più alta nei mitocondri preparati da cuori trattati con Herba Cistanche rispetto ai cuori dei controlli non trattati. La frequenza respiratoria dello Stato 4 riflette il consumo di ossigeno da parte dei mitocondri quando i protoni rifluiscono nella matrice mitocondriale tramite un meccanismo che non coinvolge F1F0 -ATPasi (Garvey, 2003). Il possibile coinvolgimento degli UCP nell'aumento della respirazione indotto da Herba Cistanche nello Stato 4 è supportato dalla constatazione che questo aumento è stato soppresso dal PIL (Bento et al., 2007).

In conclusione, il trattamento con Herba Cistanche può migliorare lo stato di glutatione mitocondriale, diminuire il livello mitocondriale di Ca2 plus e aumentare il potenziale della membrana mitocondriale e la frequenza respiratoria nei cuori di ratto. Il miglioramento dello stato del glutatione mitocondriale e della capacità funzionale, e la presunta induzione di UCP, possono essere correlati alla cardioprotezione offerta dal trattamento Herba Cistanche dopo la lesione I/R.

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Dichiarazione di interesse

Gli autori non segnalano alcun conflitto di interessi. Gli autori sono responsabili del contenuto e della scrittura del paper.

Riferimenti

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