Elevato apporto di sale e suoi effetti sul microbioma intestinale naturale nei topi bruti

1. Introduzione

L'intestino dei mammiferi è colonizzato da una comunità batterica complessa e diversificata, che insieme all'ospite crea un delicato rapporto simbiotico [1,2]. Questa comunità batterica esercita molte funzioni utili all’ospite, comprese funzioni metaboliche, immunomodulanti e trofiche [3–7] e la composizione del microbiota intestinale potrebbe cambiare durante la vita, in linea con le esigenze specifiche e la fisiologia dell’ospite [1,8, 9]. Molte funzioni benefiche dei batteri che promuovono la salute dell’intestino sono mediate da metaboliti derivati ​​dalla fermentazione anaerobica [10–13] e le condizioni disbiotiche potrebbero influenzare in modo significativo la salute dell’ospite [2,11,14,15]. La crescente preoccupazione per l’impatto dello stile di vita sulla salute ha portato ad un crescente interesse scientifico per il coinvolgimento del microbiota intestinale e le sue implicazioni traslazionali [16,17]. Infatti, il microbiota intestinale è modellato sia da fattori estrinseci (ad esempio, stile di vita, dieta e trattamenti medici) che intrinseci (ad esempio, genetica dell’ospite, regolazioni immunitarie e metaboliche) [8,18-20]. È generalmente riconosciuto che gli elementi estrinseci potrebbero suscitare effetti di grande impatto, con la dieta come uno dei principali fattori che contribuiscono ad influenzare la composizione e la funzione del microbiota intestinale [1,2,21]. È noto che i componenti della dieta occidentale, come un’elevata assunzione di sale, danneggiano l’omeostasi dell’ospite influenzando il sistema immunitario e alterando il microbiota intestinale e le malattie [18,22–37]. Nel microbiota intestinale murino, una dieta ricca di sale (HSD) è associata alla riduzione dei batteri che promuovono la salute notoriamente noti come produttori di acidi grassi a catena corta (SCFA) come Lactobacillus spp., Bifidobacterium, Blautia e Faecalibaculum [28, 29,38–41], insieme ad un aumento dell'abbondanza di Akkermansia, un altro produttore opportunistico di SCFA che ha dimostrato di influenzare l'immunità dell'ospite e la malattia in diversi sistemi modello [42,43]. I modelli animali murini vengono spesso utilizzati per studiare come i fattori dietetici potrebbero modellare il microbiota intestinale, il sistema immunitario e le malattie [29,44–46]. Sebbene l’uso di topi da laboratorio convenzionali (CLM) sia ancora un’opzione valida per molti studi, a volte non riesce a tradurre adeguatamente le applicazioni focalizzate sul microbiota intestinale [47-49]. Ad esempio, la ricerca immunologica e metabolomica su modelli murini di malattia infiammatoria intestinale (IBD) e obesità ha dimostrato di prevedere scarsamente i risultati traslazionali degli studi sul microbiota intestinale [50]. Ciò potrebbe essere dovuto a molte differenze intrinseche in questi sistemi modello, come la diversa anatomia, genetica e fisiologia dell’intestino [16,50]. Tuttavia, un altro problema legato all’utilizzo del CLM per studiare le interazioni microbiota-immunità è l’addomesticamento della composizione batterica intestinale nel CLM, che si riflette nella riduzione della complessità e della resilienza del microbiota intestinale del CLM rispetto ai topi selvatici [51]. La necessità di ambienti igienizzati e controllati si confronta con una ridotta presenza di potenziali agenti patogeni e parassiti, che si ritiene porti di conseguenza ad un sistema immunitario meno "istruito" nei CLM rispetto ai topi selvatici [51–53]. Per affrontare questo problema, il modello murino dei selvaggi è stato sviluppato mediante trasferimento di embrioni derivati ​​da topi C57BL/6 in topi selvatici per ottenere un microbiota intestinale di origine selvatica, per superare il problema traslazionale degli studi immunologici sul microbiota intestinale [54]. Studi recenti che hanno coinvolto questo modello murino hanno mostrato risultati superiori nel predire il valore traslazionale delle immunoterapie sperimentali rispetto al CLM [54,55]. Inoltre, il microbiota intestinale dei selvaggi era più resistente e resiliente al trattamento antibiotico e alla dieta ricca di grassi rispetto al CLM, paragonabile alla situazione più complessa negli esseri umani [54,55]. Tuttavia, nonostante gli effetti accertati dell’HSD sul microbiota intestinale, sul sistema immunitario e su vari modelli di malattia nella CLM, gli effetti dell’elevata assunzione di sale sul microbiota intestinale naturale di origine selvatica sono sconosciuti. In questo studio, abbiamo valutato l’effetto dell’HSD su diverse composizioni dell’ecosistema batterico intestinale e le funzioni predittive del CLM rispetto ai topi selvatici.

2. Materiali e metodi

2.1. Animali e dieta

Topi C57BL/6 di tipo selvatico (femmine di 7-8 settimane, n=20) sono stati acquistati da Charles River e ospitati nella struttura per animali dell'Università di Hasselt in condizioni standardizzate. Topi bruti (fondo genetico C57BL/6, maschi n=12 e femmine n=11) [54] sono stati alloggiati nell'allevamento di UHasselt in condizioni standardizzate. Gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato etico per gli esperimenti sugli animali (ECAE) presso l'Università di Hasselt (ID201618A4V1, ID202235). I topi sono stati alloggiati (4 topi/gabbia) in una stanza a temperatura controllata (21–23 ◦C) con un ciclo luce/luce scura di 12:12 h. Le seguenti diete purificate sono state acquistate da Ssniff (Soest, Germania): 0,5% NaCl/dieta di controllo (E15430-04) e 4% NaCl/HSD (E15431-34). Per l'HSD, gli animali sono stati alimentati con NaCl all'1% nell'acqua da bere oltre a E15431-34, come descritto in [28]. I topi CLM erano equamente distribuiti tra il gruppo di controllo (n=10) e l'HSD (n=10). Per i topi selvatici, anche gli individui maschi e femmine erano equamente distribuiti nei gruppi di controllo e nei gruppi dietetici HSD (6 maschi per il controllo, 6 maschi per l'HSD, 5 femmine per il controllo e 6 femmine per l'HSD).

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2.2. Estrazione del DNA

L'estrazione del DNA microbico è stata eseguita come descritto in [28], utilizzando un protocollo modificato del QIAmp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germania). In breve, pellet fecali sono stati aggiunti a un 2- ml di Eppendorf contenente 0 sfere di vetro, 5 mm e 1,5 ml di tampone di lisi (ASL) (Qiagen, Hilden, Germania). La battitura delle sfere è stata utilizzata per eseguire l'omogeneizzazione meccanica dei pellet. L'estrazione completa è stata eseguita secondo il protocollo del produttore con piccole modifiche (prolungamento del tempo di incubazione della proteinasi K a 2 ore a 70 ◦C). Le concentrazioni di DNA sono state valutate utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA) e conservate a -20 ◦C prima dell'amplificazione del gene 16S rRNA.

2.3. Amplificazione e sequenziamento del gene rRNA 16S

La sequenza del gene dell'rRNA 16S è stata amplificata utilizzando un primer specifico per la regione V4 (F515/R806), come precedentemente descritto [56]. In breve, sono stati utilizzati 25 ng di DNA per reazione PCR (30 µL) (KAPA HiFi HotStart ReadyMix, Roche, Basel, CH, USA) di denaturazione iniziale per 30 s a 98 ◦C, seguita da 25 cicli (10 s a 98 ◦ C, 20 s a 55 ◦C e 20 s a 72 ◦C). Le reazioni sono state eseguite in triplicato, raggruppate per campione e purificate mediante un sistema di pulizia basato su sfere magnetiche (Agencourt AMPure XP, Beckman Coulter, Brea, CA, USA). La preparazione della libreria è stata eseguita mediante PCR a ciclo limitato per ottenere la libreria indicizzata utilizzando la tecnologia Nextera (Nextera XT Index Kit, Illumina, San Diego, CA, USA), seguita da una seconda fase di pulizia delle sfere magnetiche AMPure XP. I campioni indicizzati sono stati quindi normalizzati alla stessa concentrazione di 4nM, raggruppati e sequenziati su una piattaforma Illumina MiSeq PE300 con un protocollo bidirezionale 2 × 300 bp secondo il protocollo aziendale (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA).

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2.4. Elaborazione e analisi statistica dei dati di sequenziamento del gene rRNA 16S

Le sequenze grezze sono state elaborate utilizzando una pipeline QIIME 2 [57]. Dopo il filtraggio di lunghezza e qualità (parametri predefiniti), le letture sono state filtrate e assegnate alle unità tassonomiche operative (OTU) utilizzando DADA2 [58]. L'assegnazione tassonomica è stata eseguita dall'algoritmo VSEARCH (https://github.com/torognes/vsearch; accesso il 9 novembre 2022) e dal database Silva v128 (https://www.arb-silva.de /; accesso effettuato il 9 novembre 2{{40}}22). La tabella ASV è stata quindi normalizzata mediante rarefazione a 6.147 profondità in modo che ogni campione raggiungesse il plateau alla fine della curva di rarefazione. La diversità alfa è stata valutata utilizzando due diverse metriche: indici ecologici di ricchezza OTU (osservata), Chao1, Shannon, Simpson, Inverse Simpson (InvSimpson). Per la diversità beta, la dissomiglianza di Bray-Curtis, la somiglianza di Jaccard e le metriche UniFrac ponderate e non ponderate [59] sono state calcolate e tracciate mediante analisi delle coordinate principali (PCoA) per visualizzare la distanza reale tra i campioni. Per normalizzare la tabella dei conteggi OTU, la rarefazione è stata eseguita a una profondità di 6305 sequenze per campione 100 volte. L'output ottenuto dall'assegnazione della tassonomia OTU, come tabella di tassonomia, è stato utilizzato per comprimere la tabella OTU normalizzata in tabelle per i livelli di tassonomia L2 (Phylum), L5 (Famiglia) e L6 (Genere). Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando R (https://www.R-project.org/; accesso il 25 novembre 2022; versione 4.2.0). Il pacchetto R "vegan" (Versione 2.6-4) [60] è stato utilizzato per generare metriche di diversità beta per confrontare le differenze compositive dei gruppi mediante PCoA o mediante analisi delle componenti principali (PCA). I pacchetti e la separazione dei dati sono stati testati mediante test di permutazione con rapporti pseudo-F (funzione "Adonis" in "vegan"). La separazione in termini di diversità beta tra i gruppi è stata testata mediante analisi multivariata permutazionale della varianza utilizzando matrici di distanza (PERMANOVA, funzione "Adonis" in "vegano"), mentre le differenze per la dispersione intra-gruppi sono state testate mediante test di omogeneità multivariata delle dispersioni dei gruppi (PERMDISP , funzione "betadisper" in "vegan"). I taxa che non erano presenti in almeno 4 campioni sono stati esclusi dall'analisi. Le differenze in termini di abbondanza relativa dei taxa sono state prima valutate con il test preliminare di Kruskal-Wallis tra 4 gruppi e poi ulteriormente valutate con il test di Wilcoxon tra le seguenti coppie di confronto: CLM Controllo vs. CLM HSD, Controllo dei bruti vs. HSD dei bruti, Controllo CLM contro Controllo dei Bruti, CLM HSD contro HSD dei Bruti. Per la valutazione delle differenze tassonomiche tra i selvaggi e il CLM, è stata utilizzata la dimensione dell'effetto dell'analisi discriminante lineare (LEfSe: https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/; accesso il 25 novembre 2022) per distinguere le caratteristiche principali a livello di genere [ 61]. I risultati LEfSe sono stati quindi mostrati come grafico a barre, con una soglia del punteggio dell'analisi discriminante lineare (LDA) superiore a 1,0. Quando necessario, i valori p di confronti multipli sono stati aggiustati mediante il metodo Benjamini-Hochberg. Un tasso di false scoperte (FDR) inferiore o uguale a 0,05 è stato considerato statisticamente significativo: * p inferiore o uguale a 0,05; ** p Inferiore o uguale a 0,01; *** p Inferiore o uguale a 0,001. Le differenze funzionali tra microbiomi con diverso contenuto di NaCl nel cibo (contenuto alimentare di NaCl allo 0,5% e al 4%) sono state analizzate da PICRUSt2, un pacchetto software bioinformatico per prevedere il contenuto funzionale del metagenoma dai dati di sequenziamento del gene rDNA 16s (https://huttenhower.sph. harvard.edu/picrust/; accesso il 29 novembre 2022; PICRUSt2 2.4.1) [62]. La pipeline PICRUSt2 è stata applicata a sequenze rappresentative e alla relativa tabella di abbondanza da DADA2 utilizzando parametri standard (https://github.com/picrust/picrust2/wiki/Full-pipeline-script; accesso il 29 novembre 2022). Dall'intero output della pipeline, la previsione metagenomica per i percorsi KEGG Orthology e MetaCyc è stata costruita come tabelle, con funzioni predittive come righe e campioni come colonne, e utilizzata per confrontare le funzioni del microbiota intestinale nei bruti e nel CLM in regime HSD. Le funzioni predittive della comunità microbica che hanno contribuito maggiormente alla variazione tra bruti e CLM per primo (PC1), secondo (PC2) e terzo componente principale (PC3) sono state selezionate per ulteriori analisi sul consumo di HSD nei due modelli. La matrice con le abbondanze della funzione predittiva è stata quindi normalizzata, trasformata in valori di Centered Log Ratio (CLR) e calcolato il rapporto log2mean (HSD/Control) sia per i bruti che per CLM. Infine, i rapporti log2medi sono stati confrontati tra i gruppi mediante il test di Wilcoxon e tracciati come grafico cuneiforme. Le differenze tra i gruppi sono state confrontate statisticamente nel software R utilizzando le funzioni di test di Wilcoxon e Kruskal-Wallis e valori p aggiustati con il metodo Holm o Benjamini-Hochberg.

3. Risultati

3.1. L'HSD influisce sulla diversità e sulla composizione del CLM e del microbiota dell'intestino dei selvaggi

Per studiare l’impatto dell’HSD su un ecosistema microbico intestinale di origine selvatica nei topi, abbiamo somministrato HSD o diete di controllo a topi selvatici e CLM. I topi sono stati mantenuti a regime dietetico per due settimane e la composizione del microbiota intestinale fecale è stata successivamente studiata mediante sequenziamento del gene dell'RNA 16S da pellet fecali raccolti al giorno 14 (Figura 1A). In linea con un rapporto precedente, non sono state rilevate forti differenze in termini di peso corporeo tra i gruppi di controllo e HSD di topi CLM e bruti [29]. Per valutare il diverso microbiota intestinale tra i due modelli CLM e i topi bruti al basale, abbiamo stimato la diversità alfa (indici Observed o Richness, Chao1, Shannon, Simpson e Inverse Simpson), la diversità beta (dissomiglianza di Bray-Curtis) e i principali differenze tassonomiche. In linea con studi precedenti [54], il microbiota intestinale dei selvaggi era caratterizzato da una maggiore ricchezza microbica (Figura 1B, tutti gli indici di diversità alfa), nonché da una composizione microbica distinta e più eterogenea rispetto a CLM (Figura 1C, PERMANOVA p {{9} }.001 & PERMDISP p=0.0009, bruti contro CLM e Figura S1). In termini di firme microbiche, il microbiota intestinale di CLM e di topi selvatici erano caratterizzati da diversi taxa batterici (Figura S1). In linea con Rosshart et al. [54], i taxa batterici dei topi selvatici appartengono a Intestinomonas, Desulfovibrio, Tuzzerella, Oscillobacter, Orodibacter e al genere patogeno Helicobacter, che ha caratterizzato il profilo non addomesticato di derivazione selvatica di questo modello (Figura S1).

Figura 1. Impatto dell'HSD sulla composizione batterica di CLM (n=10/gruppo) e di topi bruti (n=11 per i bruti Ctrl e n=12 per i bruti HSD). (A) Progettazione sperimentale. C57BL/6 CLM o topi bruti sono stati alimentati con 0,5% NaCl (controllo, Ctrl) o NaCl al 4% ad alto contenuto di sale (HSD) e intestino della comunità batterica intestinale caratterizzato dal sequenziamento dell'amplicone del gene rRNA 16S. (B) Indici per la diversità alfa del microbiota intestinale fecale di CLM e selvatici; da sinistra a destra sono mostrati i seguenti indici: Observed (OUT richness), Chao1, Shannon, Simpson, Simpson (Inverse Simpson). Le differenze tra i gruppi vengono valutate statisticamente mediante il test di Wilcoxon. (C) Grafico dell'analisi delle coordinate principali dell'ordinazione della diversità beta dalla metrica di dissomiglianza di Bray-Curtis tra CLM vs. bruti (in alto), controllo CLM vs CLM HSD (in basso a sinistra) e controllo dei bruti vs. bruti HSD (in basso a destra); la separazione e l'omogeneità tra i gruppi sono state calcolate rispettivamente mediante i test PERMANOVA e PERMDISP. * p Minore o uguale a 0.05; ** p Minore o uguale a 0.01; **** p Inferiore o uguale a 0.0001. Figura 1. Impatto dell'HSD sulla composizione batterica di CLM (n=10/gruppo) e di topi bruti (n=11 per i bruti Ctrl e n=12 per i bruti HSD). (A) Progettazione sperimentale. C57BL/6 CLM o topi selvatici sono stati alimentati con NaCl allo 0,5% (controllo, Ctrl) o NaCl al 4% ad alto contenuto di sale (HSD) e intestino della comunità batterica intestinale caratterizzato dal sequenziamento dell'amplicone del gene rRNA 16S. (B) Indici per la diversità alfa del microbiota intestinale fecale di CLM e selvatici; da sinistra a destra sono mostrati i seguenti indici: Observed (OUT richness), Chao1, Shannon, Simpson, Simpson (Inverse Simpson). Le differenze tra i gruppi vengono valutate statisticamente mediante il test di Wilcoxon. (C) Grafico dell'analisi delle coordinate principali dell'ordinazione della diversità beta dalla metrica di dissomiglianza di Bray-Curtis tra CLM vs. bruti (in alto), controllo CLM vs CLM HSD (in basso a sinistra) e controllo dei bruti vs. bruti HSD (in basso a destra); la separazione e l'omogeneità tra i gruppi sono state calcolate rispettivamente mediante i test PERMANOVA e PERMDISP. * p Inferiore o uguale a 0,05; ** p Inferiore o uguale a 0,01; **** p Inferiore o uguale a 0,0001.

L'HSD ha indotto una significativa riduzione della diversità batterica (Figura 1B, tutti gli indici di diversità alfa) nonché un significativo cambiamento microbico nella composizione di CLM (Figura 1C, PERMANOVA p=0.001, PERMDISP p=0 .1, CLM Ctrl contro CLM HSD). Al contrario, il microbiota intestinale dei topi selvatici era caratterizzato da una maggiore diversità su HSD (Figura 1B, indici Observed e Chao1), in modo divergente da CLM, ed erano anche caratterizzati da uno spostamento della composizione microbica meno pronunciato su HSD rispetto a CLM (Figura 1C, PERMANOVA p=0.001, PERMDISP p=0.5, Ctrl dei bruti contro HSD dei bruti).

3.2. La composizione microbica intestinale dei topi bruti è più resistente all'HSD rispetto alla CLM

Le differenze nella composizione batterica tra i bruti e il CLM sono state ulteriormente caratterizzate tassonomicamente. A livello di phylum, i phyla più abbondanti in termini di abbondanza relativa sono stati: Firmicutes (CLM: 52 ± 12%, bruti: 32 ± 34%), Bacteroidota (CLM: 24 ± 23%, bruti: 57 ± 19%), Actinobacteriota (CLM: 1{{10}} ± 7%, bruti: 0,7 ± 1,3%) e Verrucomicrobiota (CLM: 24 ± 23%, bruti: 0%/non rilevato) (Figura 2). Il profilo microbico intestinale ha mostrato abbondanze ulteriormente diverse per tutti i phyla rilevati nei campioni fecali tra topi selvatici e CLM (Figura 2). In particolare, i phyla del microbiota centrale Firmicutes, Bacteroidota e Verrucomicrobiota erano significativamente diversi tra i due modelli (Figura 2). Più specificamente, a livello di famiglia, è stato osservato un contributo diverso nel microbiota intestinale dei bruti rispetto a quello CLM per la maggior parte dei batteri precedentemente segnalati come sensibili all’HSD [28], tra cui Lactobacillaceae, Clostridiaceae, Peptostreptococcaceae e Akkermansiaceae (Figura 3). In linea con ciò, tendenze simili sono state confermate a livello di genere tra i campioni di bruti e CLM per i principali membri delle famiglie sopra menzionate; tra questi i più rappresentativi sono stati Lactobacillus, Roseburia, Tuzzerella, Faecalibaculum e Akkermansia (Figure S1 e 4). Per caratterizzare ulteriormente l’impatto dell’HSD sulle composizioni del CLM e del microbiota intestinale dei bruti, abbiamo anche analizzato l’impatto del regime dietetico a diversi livelli di classificazione. A livello di phylum, il microbiota intestinale CLM trattato con HSD era caratterizzato da una significativa deplezione di Firmicutes e da un arricchimento di Verrucomicrobiota (Figura 2), ma nessuno dei principali phyla è stato influenzato dall'HSD nei campioni di wildling (Figura 2). A livello familiare, il microbiota intestinale CLM era caratterizzato da una significativa deplezione di batteri produttori di acido lattico come Lactobacillaceae, nonché di produttori di SCFA come Peptostreptococcaceae e Clostridiaceae (Figura 3). Inoltre, nel CLM alimentato con HSD, abbiamo osservato aumenti di Akkermansiaceae, Sutterellaceae, Defluvitaleaceae ed Eggerthellaceae (Figura 3). Al contrario, l’HSD ha colpito diverse famiglie batteriche nel microbiota intestinale dei bruti, tra cui le due Muribaculaceae e Prevotellaceae altamente abbondanti, entrambe aumentate con l’HSD (Figura 3). La modulazione batterica che ha contribuito maggiormente all'effetto HSD nella CLM includeva l'aumento dei generi Akkermansia, Parasutterella ed Enterorhabdus, nonché la diminuzione di Lactobacillus, Roseburia, Tuzzerella, gruppo (Eubacterium) ossidoreducens, Muribaculum e Anaerovorax (Figura 4). Ad eccezione di Roseburia, nessuno dei generi sopra menzionati è stato influenzato dall'HSD nel microbiota intestinale dei bruti, mentre il genere Anaerovorax ha mostrato una tendenza opposta a quella del CLM (Figura 4).

Figura 2. Effetto HSD sui phyla batterici del microbiota intestinale di CLM (n=10/gruppo) e topi selvatici (n=11 per i bruti Ctrl e n=12 per i bruti HSD). La composizione totale in termini di abbondanza relativa dei phyla è mostrata dal grafico a barre per ciascun individuo (in alto) e dal boxplot per phyla specifici (in basso); i confronti statistici sono stati eseguiti tra i gruppi mediante il test di Wilcoxon. * p Minore o uguale a 0.05; ** p Minore o uguale a {{10}}.01; *** p Inferiore o uguale a 0,001; **** p Inferiore o uguale a 0,0001.

Figura 3. Impatto del consumo di cibo ad alto contenuto di sale sulle famiglie batteriche di CLM (n=10/gruppo) e sui topi selvatici (n=11 per i bruti Ctrl e n=12 per i bruti HSD). La composizione totale a livello familiare è rappresentata dal grafico a barre per ciascun individuo (in alto) e dal grafico a scatole per famiglie specifiche (in basso); i confronti statistici sono stati eseguiti tra i gruppi mediante il test di Wilcoxon. * p Minore o uguale a 0.05; ** p Minore o uguale a {{10}}.01; *** p Inferiore o uguale a 0,001; **** p Inferiore o uguale a 0,0001.

Figura 4. Cambiamenti nei generi batterici in CLM (n=10/gruppo) e topi bruti (n=11 per i bruti Ctrl e n=12 per i bruti HSD). Il contributo complessivo all'abbondanza relativa a livello di genere viene tracciato come un diagramma a barre circolari per ciascun individuo (in alto) e un diagramma a scatole per generi specifici (in basso); i confronti statistici sono stati eseguiti tra i gruppi mediante il test di Wilcoxon. * p Minore o uguale a 0.05; ** p Minore o uguale a 0.01; *** p Inferiore o uguale a 0,001; **** p Inferiore o uguale a 0,0001.

3.3. L'HSD influisce sulle funzioni microbiche predittive nella CLM ma non nei topi bruti

L'output di PICRUSt 2 non ha rilevato alcuna differenza significativa tra le funzioni della comunità microbica dei topi selvatici HSD rispetto ai topi selvatici non trattati sia per le annotazioni del percorso KEGG Orthology che MetaCyc, con l'unica eccezione dell'aumento della funzione indotto dall'HSD sul gene recG per un'elicasi ATP-dipendente da l'ortologia KEGG (Figura 5A). L'impatto dell'HSD sulla CLM è stato caratterizzato da una significativa diminuzione delle funzioni predittive per l'ortologia KEGG, tra cui il gene spp (saccarosio-6-fosfatasi) e pfkA (fosfofruttochinasi 1), entrambi coinvolti nel metabolismo dell'amido e del saccarosio, che è in linea con risultati precedenti [28] (Figura 5A). Inoltre, il microbiota intestinale delle CLM alimentate con HSD era caratterizzato da una diminuzione delle funzioni predittive dei geni coinvolti nel trasporto di membrana (feoB per il trasporto del ferro, proteina permeasi AB 2P AB 2, proteina legante AB 2A AB 2 ATP), biosintesi della glutammina (glnA) , regolatore trascrizionale della famiglia LacI (lacI, galR) e transchetolasi (tktA, tktB) (Figura 5A). Per i percorsi MetaCyc, l'HSD ha arricchito significativamente il microbiota intestinale CLM di funzioni predittive associate alla riduzione dei nitrati (via di denitrificazione), alla degradazione del galattosio (degradazione del D-galattarato, super via di degradazione del D-glucarato e del D-galattarato), degradazione del fenil-propanoato, recupero dell'acido, degradazione del succinato in acido butanoico e degradazione degli amminoacidi (degradazione delle ammine aromatiche, degradazione della L-leucina) (Figura 5B). Inoltre, in linea con i risultati precedenti [28], il microbiota intestinale dell’HSD nel CLM ha perso funzioni predittive per la biosintesi degli amminoacidi (super percorso della biosintesi della L-alanina, biosintesi della L-lisina), fermentazione acida mista, con ulteriore nuova firma persa come N- Degradazione dell'acetilglucosamina/N-acetil-mannosamina/N-acetilneuraminato e degradazione dei desossiribonucleosidi (degradazione della pirimidina e delle purine, biosintesi dell'inosina5fosfato III) (Figura 5B).

Figura 5. Continua

Figura 5. Effetto dell'HSD sulle funzioni metagenomiche predittive dell'intestino nel microbiota intestinale CLM (n=10/gruppo) e dei selvatici (n=11 per i selvatici Ctrl e n=12 per i selvatici HSD). Output PICRUSt2 tracciato come grafico cuneiforme per l'annotazione KEGG Orthology (A) e i percorsi MetaCyc (B) espressi come rapporto medio log2 dei conteggi delle funzioni predittive tra i campioni HSD e Ctrl. Tutti i confronti statistici sono stati eseguiti tra i gruppi Ctrl vs. HSD mediante test di Wilcoxon.

4. Discussione

È noto che il microbiota intestinale complesso e diversificato dei selvaggi è più resistente a determinati modelli di malattie [51] e regimi dietetici, come l’assunzione di grassi elevati [54,55]. Tuttavia, nessuno studio precedente ha valutato gli effetti di un’elevata assunzione di sodio sul microbiota intestinale murino di origine selvatica. Qui, abbiamo studiato per la prima volta il modo in cui l’HSD influisce sul microbiota intestinale dei bruti rispetto al CLM. È interessante notare che i nostri risultati hanno dimostrato che, rispetto al CLM, il microbioma dei bruti è più resistente ai disturbi dell’HSD sia a livello compositivo che funzionale predittivo. È risaputo che un’elevata assunzione di sale potrebbe esacerbare il rischio di varie malattie, come quelle cardiovascolari o autoimmuni, alterando la composizione del microbioma intestinale e l’omeostasi immunitaria [25,29,31,34,63–65]. In linea con i rapporti precedenti, i cambiamenti indotti dall’HSD nel microbiota intestinale nella CLM sono stati caratterizzati da alterazioni significative nella diversità microbica, nella composizione e nelle funzioni predittive [28]. I batteri che promuovono la salute come la famiglia Peptostreptococcaceae e i generi Lactobacillus, Roseburia e Tuzzerella sono diminuiti in termini di abbondanza relativa nei CLM, mentre Akkermansia è aumentato significativamente nei gruppi alimentati con HSD. Abbiamo anche rilevato abbondanze relative più elevate di HSD in Defluvitaleaceae, Enterorhabdus e Parasutterella. È interessante notare che il genere Parasutterella è un componente fondamentale del microbiota intestinale sia della CLM che dell’uomo, dove si comporta come un asaccarolitico e produttore di succinato [66]. È noto che sia Enterorhabdus della famiglia delle Eggerthellaceae che Parasutterella della famiglia delle Sutterellaceae sono arricchiti nei pazienti con IBD [67,68], indicando ulteriormente come l’HSD possa influenzare lo sviluppo della malattia. Tuttavia, cosa interessante, i topi selvatici non hanno mostrato un’entità simile di cambiamenti microbici indotti dall’HSD, come il CLM. Nonostante ciò, la diversità dei selvaggi è aumentata significativamente sull’HSD per le OTU osservate e le metriche Chao1, e solo pochi taxa sono stati coinvolti nel disturbo dell’HSD del microbiota intestinale dei selvaggi, tra cui un aumento di Anaerovorax, accoppiato con una diminuzione di Erysipelatoclostridium, Roseburia e Lachnospiraceae Genere UCG-004. La roseburia era l'unica firma batterica comunemente condivisa tra i gruppi HSD rispetto ai controlli corrispondenti, nonostante il CLM alimentato con HSD fosse ancora caratterizzato da una maggiore abbondanza di questo batterio rispetto ai topi selvatici alimentati con HSD. Da notare che i batteri produttori di butirrato come Roseburia hanno dimostrato di avere un’abbondanza relativa inferiore nei pazienti con colite ulcerosa [69] e questa riduzione è stata anche osservata correlata al rischio genetico IBD dei soggetti umani [70]. Ciò è in linea con i risultati precedenti, in cui si è scoperto che i cambiamenti nei generi batterici come Roseburia o Lactobacillus sono associati a un rischio di ipertensione, possibilmente promosso da una dieta occidentale [71]. La composizione batterica dell’intestino è anche associata alla motilità e alla fisiologia intestinale [72].

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Il genere Anaerovorax è stato precedentemente osservato in topi con fisiologia intestinale anormale e motilità ridotta [73]; tuttavia, l’arricchimento di Anaerovorax nell’HSD per i topi selvatici può portare a un ruolo diverso di questi taxa nel contesto dell’omeostasi intestinale e del corretto funzionamento. In linea con i risultati precedenti, abbiamo osservato un aumento del genere Akkermansia nel gruppo HSD di CLM [28], mentre il microbiota intestinale dei topi selvatici era impoverito in questo genere, il che è coerente anche con studi precedenti su questo modello [51, 53–55]. Sebbene il genere Akkermansia sia un potenziale probiotico grazie al suo effetto positivo sul miglioramento dei profili immunologici e metabolici dell'ospite (ad esempio, nell'obesità e nel diabete di tipo 2) [42,74-77], il ruolo di questo genere non è ancora chiaro a causa del suo effetto negativo. correlazione con gli esiti clinici nel cancro del colon-retto [78], nella malattia di Parkinson [79,80] e nei pazienti con sclerosi multipla [81]. Coerentemente con i nostri precedenti risultati ottenuti con i percorsi MetaCyc [28], CLM su HSD ha mostrato una diminuzione delle funzioni microbiche predittive associate al metabolismo dell'amido e del saccarosio per l'ortologia KEGG. Tuttavia, i cambiamenti minori nella composizione batterica intestinale dei topi selvatici alimentati con HSD non sono riusciti a indurre alcuna variazione significativa nelle funzioni batteriche predittive, indicando che il microbiota intestinale e le reti metaboliche/ecologiche derivate dai selvatici sono molto più stabili e potrebbero adattarsi molto più facilmente ai topi selvatici. Variazioni dietetiche indotte dall’HSD rispetto agli ecosistemi intestinali CLM, che meritano ulteriori indagini. Vale la pena menzionare anche la possibile influenza della comunità fungina intestinale sulla rete batterica intestinale in seguito a regimi dietetici differenziati. Studi precedenti hanno già suggerito come le potenziali interazioni tra batteri e funghi siano implicate nell’omeostasi del sistema immunitario ospite e nello sviluppo della malattia [82-85]. In questo contesto, i CLM sono ulteriormente limitati dalla loro minore complessità batterica rispetto ai topi selvatici, che può ostacolare la creazione di un micobiota intestinale diversificato [54]. Studi futuri saranno in grado di determinare il contributo delle comunità fungine intestinali nelle impostazioni del microbiota intestinale e dell’immunità dell’ospite utilizzando il modello dei bruti. In sintesi, il nostro studio fornisce dati su come un’elevata assunzione di sodio influisce su un ecosistema microbico intestinale naturale di origine selvatica rispetto a una comunità batterica intestinale domestica di CLM. Il nostro studio ha dimostrato che l’HSD non influenza i taxa batterici e il microbiota intestinale nei topi selvatici nello stesso modo in cui lo fa per un microbiota intestinale addomesticato da CLM. Questa divergenza, come precedentemente affermato per altri regimi dietetici o condizioni come le diete ad alto contenuto di grassi [54,55], indica che sono necessarie ricerche future sui sistemi modello murini naturali per ricapitolare e stimare l’impatto degli interventi dietetici su ecosistemi intestinali più complessi, come negli esseri umani.

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