Risposte immunitarie dell'ospite alle proteine ​​dello strato S superficiale (SLP) di Clostridioides Difficile

Astratto:

Clostridioides difficile, un patogeno nosocomiale, è un patogeno intestinale emergente che causa diarrea associata agli antibiotici. L’infezione da C. difficile comporta la colonizzazione intestinale e la rottura della barriera epiteliale intestinale, con conseguente induzione di risposte infiammatorie/immunitarie. L'espressione di due principali esotossine, TcdA e TcdB, è la principale causa di patogenicità del C. difficile. L'attacco di abbondanti proteine ​​della parete cellulare batterica o di proteine ​​dello strato S superficiale (SLP) come SlpA con cellule epiteliali dell'ospite è fondamentale per la virulenza. Oltre ad essere tossine, questi componenti superficiali hanno dimostrato di essere altamente immunogenici. Studi recenti indicano che gli SLP di C. difficile svolgono un ruolo importante nell’adesione dei batteri alle cellule epiteliali intestinali, nella rottura delle giunzioni strette e nella modulazione della risposta immunitaria delle cellule ospiti. Queste proteine ​​potrebbero servire come nuovi bersagli per vaccini e nuovi agenti terapeutici. Questa recensione riassume la nostra attuale comprensione del ruolo immunologico degli SLP nell’indurre l’immunità dell’ospite e il loro utilizzo nello sviluppo di vaccini e nuove terapie per combattere l’infezione da C. difficile.

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Parole chiave:

diarrea associata agli antibiotici; proteine ​​della parete cellulare; terapeutica; proteine ​​dello strato S; vaccino

1. Introduzione

Clostridioides difficile, un batterio anaerobico produttore di tossine, è un importante patogeno opportunista e nosocomiale nell'intestino che causa sintomi di malattia come risultato di perturbazioni nel microbioma sano dovute a una moltitudine di fattori, tra cui l'uso di antibiotici, fattori genetici, espositivi, microbici, e altri fattori dell'ospite [1]. La selezione e la proliferazione di C. difficile innesca la condizione pericolosa per la vita della colite pseudomembranosa [2,3]. Secondo le ultime stime del rapporto 2019 dei Centri per il controllo e la prevenzione delle malattie, C. difficile ha causato 223.900 infezioni e 12.800 decessi nel 2017 con una perdita di 1 miliardo di dollari solo negli Stati Uniti [4]. Il trattamento del primo episodio di infezione da C. difficile (CDI) si ottiene con antibiotici. Tuttavia, la malattia presenta un elevato livello di recidiva: 20-30% dopo il primo trattamento di una CDI iniziale e oltre il 50% dopo la prima recidiva [5]. Pertanto, è necessario un intervento terapeutico urgente per combattere le CDI in tutto il mondo. Uno dei principali fattori molecolari della patogenesi del C. difficile è l'espressione e la secrezione di due tossine principali, TcdA e TcdB, codificate dai geni situati all'interno di un locus di patogenicità (PaLoc) da 19,6-kb nel C. difficile genoma [6]. La regolazione della produzione di tossine e i vari fattori di trascrizione coinvolti nella produzione di tossine sono stati ampiamente esaminati da Chandra et al. altrove [6].

La patogenesi della CDI inizia con l’ingestione/germinazione delle spore di C. difficile nelle cellule vegetative, che germinano nell’intestino dove proliferano e colonizzano la mucosa intestinale [1,6]. La barriera della mucosa intestinale (IMB) è la prima linea di difesa innata contro i patogeni. L'IMB ospite è costituito da vari tipi di cellule epiteliali che sono saldamente unite tra loro da giunzioni strette e ricoperte da uno spesso strato protettivo di muco secreto dalle cellule caliciformi [1]. La distruzione dell'IMB consente al C. difficile di attaccarsi alla superficie delle cellule epiteliali dove l'elaborazione dei suoi fattori di virulenza porta al danno e alla manifestazione della patogenicità del C. difficile [1,6]. La parete cellulare batterica di molte specie Gram-positive e negative, incluso C. difficile, è associata ad un abbondante strato esposto in superficie di molecole proteiche chiamate proteine ​​dello strato superficiale (proteine ​​dello strato S o SLP), costituite prevalentemente da un'abbondante proteina SlpA costituita da un dominio a basso e ad alto peso molecolare, disposti come una matrice bidimensionale regolare paracristallina vista al microscopio elettronico [7]. Altri componenti proteici della parete cellulare (Cwp) dello strato SLP sono meno abbondanti e scarsamente caratterizzati, ma svolgono anche un ruolo importante nella patogenicità della CD. Negli ultimi anni, la ricerca sugli SLP ha guadagnato maggiore attenzione, poiché è stato dimostrato che queste proteine ​​svolgono ruoli chiave nell'adesione superficiale, nell'attivazione dei recettori Toll-like, nell'induzione della produzione di citochine e nell'attivazione dell'inflammasoma come parte della risposta immunitaria dell'ospite oltre alla loro azione. ruolo nella crescita e nella sopravvivenza del batterio [7–9].

In questa recensione, discutiamo la risposta immunitaria dell’ospite ai principali componenti SlpA e ad altri Cwps meno abbondanti alla luce delle recenti conoscenze sugli SLP di C. difficile ed evidenziamo il loro potenziale per l’uso come nuovo vaccino e bersaglio terapeutico altamente rilevante nella patogenesi delle CDI.

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2. Ospitare risposte immunitarie innate contro CDI

È stato dimostrato che i ceppi non tossigeni di C. difficile (NTCD) dopo la colonizzazione in modelli animali forniscono protezione contro i ceppi patogeni di C. difficile. All'inizio degli anni '80, Wilson e Sheagren riferirono che i criceti colonizzati da un ceppo NTCD dopo essere stati sterilizzati con l'antibiotico cefoxitina erano protetti quando esposti a un ceppo tossigenico di C. difficile (TCD) [10]. Tuttavia, il trattamento con altre specie, come C. perfrigens, C. bifermentans, C. beijerincki, C. sporogenes e un ceppo NTCD non tossigenico di C. difficile ucciso con il calore, non è riuscito a proteggere dalle CDI. Inoltre, la protezione è andata persa quando il NTCD colonizzante è stato sterilizzato utilizzando il trattamento con vancomicina prima del test [11]. Incoraggiati da questi risultati, le spore del ceppo NTCD-M1 sono state utilizzate in un numero limitato di pazienti clinici affetti da CDI ricorrente (rCDI) con notevole successo (circa il 50%) [12]. Attualmente, le opzioni di trattamento delle CDI sono limitate e si basano fortemente sull’uso di antibiotici, come vancomicina, fidaxomicina e metronidazolo [13,14]. L’uso eccessivo di antibiotici porta alla disbiosi del microbioma sano e aiuta ulteriormente nella selezione di patogeni come C. difficile che possono recidivare in seguito [1,15]. Per aggirare efficacemente queste sfide, i metodi di trattamento alternativi necessitano di attenzione immediata. Alcune di queste opzioni di trattamento includono la neutralizzazione delle tossine di C. difficile utilizzando anticorpi monoclonali contro TcdB, come l’infusione di bezlotoxumab, che previene il danno dell’epitelio intestinale mediato dalle tossine [16]. Un altro metodo affascinante è il ripristino di un microbioma sano mediante il trapianto di microbiota fecale (FMT) da un donatore sano tra i familiari più stretti. La FMT ha mostrato risultati promettenti contro le recidive di CDI con percentuali di successo fino al 90% [17,18]. Sfortunatamente, questi studi non hanno affrontato il ruolo della risposta immunitaria dell’ospite nella protezione di questi pazienti. Pertanto, si può sostenere che il NTCD vivo secerne alcuni antigeni/componenti della parete cellulare che inducono una forte risposta immunitaria contro il TCD tossigenico. Allo stesso modo, la protezione FMT è scarsamente definita. Pertanto, comprendere come l’introduzione dell’FMT induce le risposte dell’ospite potrebbe aiutare nell’identificazione di antigeni chiave, che a loro volta potrebbero aiutare a comprendere meglio la risposta immunitaria e lo sviluppo di nuovi vaccini contro la CDI.

Nell'intestino, il sistema immunitario innato dell'ospite è la prima linea di difesa contro un agente patogeno invasore, che svolge un ruolo cruciale nel modellare e montare una robusta risposta immunitaria adattativa dell'ospite [1]. La risposta innata consiste principalmente di tre parti: (i) epitelio intestinale e strato mucoso (barriera fisica), (ii) peptidi antimicrobici, che sono il prodotto escretore delle cellule epiteliali, delle cellule di Paneth e di alcuni membri del microbiota intestinale (cellule chimiche). barriera) e (iii) risposte cellulari mediante il reclutamento di cellule immunitarie innate come neutrofili, eosinofili, macrofagi, cellule linfoidi innate (ILC) e cellule dendritiche (DC) che sono orchestrate da molteplici vie di segnalazione innate per combattere l'agente patogeno invasore. 1]. Le cellule ospiti portano sulla loro superficie recettori di riconoscimento dei pattern (PRR), come i TLR, che riconoscono alcune firme batteriche conservate sui microbi chiamate pattern molecolari associati ai patogeni (PAMP). Questi PRR sono noti anche come recettori Toll-like (TLR). Dopo il riconoscimento di questi segnali di pericolo (PAMP) da parte dei TLR, la cellula ospite innesca una risposta immunitaria. A questo proposito, è stato dimostrato che il recettore Toll-like 4 (TLR4) riconosce i segnali di pericolo di C. difficile, un'azione che partecipa all'avvio della risposta infiammatoria dell'ospite. In questo contesto, è stato dimostrato che gli SLP di C. difficile interagiscono con il TLR-4 dell'ospite mentre i flagelli di C. difficile interagiscono attraverso TLR5 [19,20].

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3. Proteine ​​dello strato S (SLP) in C. difficile

Negli ultimi dieci anni, le proteine ​​dello strato superficiale (strato S) di C. difficile hanno ricevuto notevole attenzione. Gli SLP furono identificati per la prima volta da Kawata et al. nel 1984 e rappresentano circa il 15% della massa cellulare totale [21,22]. Gli SLP si trovano in molte specie procariotiche diverse. La maggior parte degli SLP sono disposti sulla superficie più esterna delle cellule come una singola proteina in una matrice paracristallina bidimensionale [7]. In C. difficile, lo strato S è costituito principalmente dalle proteine ​​eterodimeriche SlpA. SlpA è un eterodimero costituito da una proteina ad alto peso molecolare (HMW) e una proteina a basso peso molecolare (LMW) codificata da un singolo gene slpA; l'LMW SLP costituisce lo strato superiore esposto mentre l'HMW SLP costituisce lo strato inferiore. L'LMW SLP è unico in C. difficile. Nel ceppo C. difficile 630, il locus slpA è una regione di 36,6 kb che ospita 11 paraloghi slpA. Inoltre, ci sono altri 17 paraloghi sparsi in tutto il genoma [23,24]. Questi geni paralogo sono ora chiamati proteine ​​della parete cellulare clostridica (CwpX), dove X denota il numero paralogo identificato (X=1–29) e sono descritti nella Tabella 1. Tuttavia, quattro Cwp precedentemente caratterizzati noti come SlpA, Cwp66, Cwp84 e CwpV furono nominati prima che questa nuova convenzione di denominazione fosse adottata [23]. Tutte le Cwps sono proteine ​​tipiche che contengono un peptide segnale N-terminale e tre presunti domini leganti la parete cellulare con significativa somiglianza con HMW SLP [25,26]. Diversi ceppi di C. difficile hanno mostrato variazioni nel locus slpA e sono stati documentati circa 12 diversi tipi di cassette S-layer. Gli altri 28 Cwps agiscono come componenti accessori, che sono ancorati nello strato paracristallino polimerizzato, che rappresenta circa il 5–20% dello strato S [7].

Tabella 1. Funzioni putative dei 29 geni cup trovati nei genomi di Clostridium difficile 630.

Tabella 1. Continua

4. Espressione e variazione del ceppo delle proteine ​​della parete cellulare

Nel ceppo C. difficile 630, è stato riportato che sono espressi circa nove geni che codificano per Cwps [25]. Mentre i geni cwp2, cwp84, cwp6, cwp12, cwpV, cwp24 e cwp25 sono espressi sulla superficie della cellula in normali condizioni di crescita [44], i geni cwp66 e cwp5 sono stati espressi ma non sono stati trovati negli estratti della superficie cellulare. In uno studio separato, Biazzo et al. tazze analizzate sparse nel genoma di C. difficile. Hanno osservato che i geni cwp13, cwpV, cwp16, cwp18, cwp19, cwp20, cwp22, cwp24 e cwp25 sono espressi e hanno sequenze ben conservate, mentre i geni cwp17, cwp26, cwp27, cwp28 e cwp29 presentavano variazioni significative nei livelli di espressione tra ribotipi ed erano meno conservati [45]. Molti geni del locus slpA mostrano variazioni significative tra i ceppi, in particolare nelle regioni esposte alla superficie. Ad esempio, è stato dimostrato che slpA, cwp66, secA2 e cwp2 presentano un'elevata variazione all'interno del locus slpA (che forma una cassetta da 10-kb); finora sono state trovate 12 varianti divergenti di questa cassetta come risultato della ricombinazione omologa tra diversi genotipi [46]. Secondo Karjalainen et al., cwp66 mostra solo il 33% di identità tra i ceppi [26]. La variante cwp2 è stata sostituita da un cluster di geni della glicosilazione dello strato S previsto da 23,8 kb nel locus slpA [46]. SlpA è l'SLP più abbondante presente negli estratti della superficie cellulare di C. difficile ed è il principale costituente dell'SLP di C. difficile. La proteina matura viene scissa dopo la secrezione nelle forme proteiche HMW e LMW mediante l'azione di una proteasi Cwp84 per formare il complesso eterodimerico H/L, che polimerizza per formare lo strato S [47] (Figura 1). L’inattivazione del gene cwp84 in C. difficile 630∆erm ha prodotto uno strato S costituito solo da una SlpA immatura a catena singola con morfologia della colonia alterata, suggerendo un ruolo importante di Cwp84 nella formazione dello strato S maturo [32]. La presenza del gene secA2 nel locus slpA è importante per il trasporto di SlpA e di altre Cwps attraverso la membrana citoplasmatica [48].

Figura 1. Gli SLP di C. difficile mediano l'adesione e l'attivazione delle cellule immunitarie. Il peptide nascente SlpA viene scisso dalla proteasi Cwp84 nelle subunità LMW e HMW, che formano il complesso SlpA maturo dello strato SLP della parete cellulare [31–33]. Gli SLP mediano l'adesione tramite TLR4 interrompono la stretta giunzione delle cellule epiteliali intestinali e attivano ulteriormente le cellule dendritiche/macrofagi, che a loro volta producono varie citochine e chemochine che portano all'induzione di Th1/Th2 e della risposta umorale [9,27]. Interleuchina (IL), Cellule dendritiche (DC), Basso peso molecolare (LMW), Alto peso molecolare (HMW), Recettore Toll-like 4 (TLR4).

5. Funzioni delle proteine ​​dello strato S

Gli SLP sono coinvolti in varie funzioni nella biologia del C. difficile (vedere Tabella 1), come l'integrità cellulare, il trasporto, la formazione di pori e ancoraggi, la degradazione, l'adesione/invasione della cellula ospite, l'evasione del sistema immunitario e la protezione dai microrganismi concorrenti [22] . Pechineet al. hanno rilevato anticorpi contro i domini N-terminale e C-terminale dell’antigene Cwp66 nei sieri di pazienti con malattia associata a Clostridium difficile (CDAD) [49]. In un altro studio, Wright et al. hanno separato i Cwps utilizzando 2D-PAGE e hanno identificato diversi Cwps (SlpA, Cwp2, Cwp5, Cwp84, Cwp18, Cwp19) che hanno reagito con i sieri dei pazienti infettati con il ceppo di C. difficile ribotipo 017, suggerendo l'induzione di una forte risposta immunitaria contro gli SLP [50]. Recentemente, Kirk et al. hanno identificato due ceppi di C. difficile privi di strato S e che non erano sensibili alla batteriocina che forma pori e depolarizza le cellule batteriche concorrenti. Tuttavia, questi ceppi di C. difficile hanno mostrato una sensibilità significativamente aumentata al lisozima e al peptide antimicrobico LL-37 e non hanno prodotto sintomi di CDI in un modello di infezione di criceto [51]. Uno studio recente ha studiato gli effetti della SlpA isolata da tre ceppi tossicogeni (RT126, RT001, RT084) sull'espressione delle proteine ​​della giunzione stretta (TJ) e sull'induzione di citochine proinfiammatorie nella linea cellulare di carcinoma del colon umano HT-29 . Il trattamento con SlpA ha ridotto significativamente i livelli di espressione della famiglia delle claudine e delle proteine ​​a giunzione stretta JAM-A (Figura 1) [9]. Inoltre, la proteina SlpA ha aumentato i livelli di espressione di TLR-4 e ha indotto la secrezione di TNF-, IL-1 e IL-8. Questi risultati dimostrano che la patogenesi mediata dalla proteina SlpA e le risposte infiammatorie indotte nell’intestino [9]. Pertanto, è ragionevole sostenere che gli SLP sono essenziali per la patogenicità e le risposte immunitarie del C. difficile.

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6. Risposta immunitaria agli SLP

Recenti indagini hanno sottolineato l'importante ruolo della SlpA non solo nella sopravvivenza e nella crescita batterica, ma anche nel modellare la risposta immunitaria dell'ospite. Approcci immunoproteomici hanno mostrato la presenza di anticorpi anti-SLP nei sieri di sei pazienti infetti da C. difficile ribotipo 017, suggerendo che le proteine ​​SLP sono immunodominanti ed espresse durante l'infezione [50]. Uno studio condotto da Bruxelles et al. hanno mostrato un livello elevato di anticorpi anti-SlpA nei pazienti con CDI rispetto ai pazienti sani [52]. In un altro studio, Negm et al. hanno rilevato anticorpi IgG nei sieri di un totale di 327 individui con CDI contro estratti SLP di vari ceppi di C. difficile [53]. Oltre a SlpA, il dominio C-terminale esposto della seconda proteina più abbondante, Cwp66, è altamente variabile mentre il dominio N-terminale è ben conservato. È stato dimostrato che i domini C-terminali variabili di Cwp66 e Cwp84 sono immunogenici negli esseri umani [49,54]. Inoltre, nei pazienti con CDI, i livelli medi totali di anti-Cwp66 e anti-Cwp84 erano inferiori rispetto al gruppo di controllo sano, suggerendo la natura protettiva degli anticorpi. Pertanto, gli SLP, in particolare SlpA, e altri componenti hanno ruoli importanti nella difesa immunitaria e sono potenziali bersagli per lo sviluppo immunoterapeutico e di vaccino, come descritto nelle sezioni seguenti.

7. Gli SLP mediano l'adesione di C. difficile

C. difficile avvia l'infezione aderendo alle cellule epiteliali intestinali portando alla colonizzazione. A questo proposito, gli SLP batterici come SlpA e Cwp66 svolgono un ruolo fondamentale nell'adesione. È stato riportato che la variazione degli SLP, in particolare della SlpA, nei ceppi isolati di C. difficile ha mostrato cambiamenti nell’aderenza [55]. È stato dimostrato che gli SLP si legano a diverse linee cellulari, come le linee cellulari gastrointestinali umane di cellule Hep-2 e Vero, e molte proteine ​​della matrice extracellulare. Inoltre, il trattamento con anticorpi anti-HMW-SLP ha inibito l’adesione di C. difficile. Inoltre, anche il pretrattamento delle cellule ospiti con subunità SlpA purificate o anticorpi anti-SlpA ha impedito l’adesione di C. difficile [55]. Il membro omologo più grande della famiglia di proteine ​​SlpA è la proteina CwpV, che è espressa in modo variabile in fase. In uno studio separato, è stato dimostrato che il dominio ripetitivo C-terminale della proteina CwpV media l'aggregazione di C. difficile. Inoltre, questo dominio varia tra i ceppi e sono stati identificati cinque tipi di ripetizioni antigenicamente distinti [40].

È stato dimostrato che un'altra proteina immunogenica denominata Cwp66 possiede proprietà di adesione. Cwp66 purificato e anticorpi contro i domini N-terminale e C-terminale hanno inibito l'adesione di C. difficile alle cellule Vero in coltura suggerendo le proprietà di adesione di Cwp66 [29].

8. Induzione di risposte infiammatorie

Bianco et al. hanno dimostrato il ruolo degli SLP nel processo infiammatorio. In quello studio, gli SLP provenienti da ceppi ipervirulenti ed epidemici (H/E) o non H/E di C. difficile sono stati purificati e studiati in monociti umani e cellule dendritiche derivate da monociti (MDDC) in termini di induzione di citochine immunomodulatorie [interleuchina (IL)-1 , IL-6 e IL- 10] [56]. Lo studio ha dimostrato che gli SLP non solo inducono la maturazione degli MDDC, con una maggiore attività di presentazione dell'antigene, ma inducono anche la secrezione di alti livelli di IL-10. Tuttavia, non sono state riscontrate differenze significative nell’attivazione di monociti e MDDC da parte di preparati SLP da ceppi H/E e non H/E, suggerendo che gli SLP non contribuiscono all’aumento della gravità della malattia [56]. In un altro studio, Ausiello et al. hanno estratto gli SLP dall'isolato clinico C253 e hanno dimostrato che gli SLP inducono la secrezione di livelli aumentati di citochine proinfiammatorie IL-1 e IL-6 nei monociti a riposo e inducono la maturazione degli MDDC umani e una maggiore proliferazione di T cellule [57]. Inoltre, questi MDDC trattati hanno anche rilasciato quantità elevate di IL-10 e IL-12p70 e hanno indotto una risposta immunitaria mista Th1/Th2. TLR-4 ha svolto un ruolo importante nell'attivazione dei DC mediata da SLP. È stato dimostrato che gli SLP non potevano attivare le DC isolate da topi C3H/HeJ mutanti TLR4- e non riuscivano a indurre una successiva risposta immunitaria Th, suggerendo che gli SLP attivano l'immunità innata e adattativa mediata dal recettore TLR4 [19]. In un altro studio, è stato dimostrato nei macrofagi che gli SLP di C. difficile inducono una risposta di eliminazione in termini di secrezione di citochine e chemochine proinfiammatorie con aumento della migrazione dei macrofagi e dell'attività fagocitotica [58]. Il trattamento con un inibitore di p38 ha invertito queste risposte suggerendo il ruolo delle molecole di segnalazione nelle risposte mediate da SLP [58]. Uno studio molto recente ha riportato l'attivazione dell'inflammasoma da parte degli SLP di C. difficile in modo dose-dipendente. Inoltre, è stato dimostrato che i microdomini ricchi di colesterolo (zattere lipidiche) sulle membrane cellulari aiutano nel legame degli SLP alla membrana cellulare. Ciò si basava sulla microscopia a fluorescenza, dove è stato dimostrato che il trattamento con metil- -ciclodestrina (M CD), che impoverisce il colesterolo di membrana, riduceva il legame con gli SLP, suggerendo che gli SLP reclutano i rafts lipidici, fondamentali per la colonizzazione di C. difficile e l'attivazione dell'inflammasoma [59 ]. Questi studi sostengono che gli SLP di C. difficile possono attivare le risposte immunitarie innate e adattative, che sono mediate in parte da TLR4, suggerendo un ruolo importante degli SLP nell'indurre una risposta immunitaria. Pertanto, questi risultati suggeriscono anche il potenziale degli SLP come candidati al vaccino contro la CDI.

9. Risposte anticorpali contro la CDI

Diversi studi immunologici indicano che l’infezione e l’esito di C. difficile dipendono dall’intensità della risposta immunitaria dell’ospite, un fattore chiave nella patogenicità della CDI. Pertanto, l’incapacità di sviluppare una risposta anticorpale robusta può essere una prognosi per la gravità e la recidiva della malattia [60]. A questo proposito, i livelli di anticorpi contro le principali tossine sono stati correlati alla recidiva e alla gravità della malattia [61,62]. Anticorpi contro i componenti superficiali di C. difficile sono stati segnalati nel siero di pazienti con CDI anche in studi precedenti [63]. Drudy et al. hanno valutato le risposte immunitarie umorali agli estratti SLP di C. difficile in una coorte di 146 pazienti comprendente 55 pazienti con diarrea associata a C. difficile (CDAD), 34 pazienti con portatori asintomatici e 57 soggetti di controllo [64]. Lo studio ha isolato l'estrazione delle frazioni ad alto e basso peso molecolare degli SLP, che contenevano principalmente l'abbondante proteina SlpA. Hanno misurato gli anticorpi sierici utilizzando il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) in questa coorte e non hanno riscontrato differenze significative nei livelli sierici di anticorpi IgM, IgA o IgG. È interessante notare che i pazienti con episodi ricorrenti di CDAD avevano livelli di IgM anti-SLP significativamente più bassi rispetto ai pazienti con episodi singoli. Lo studio ha concluso che dovrebbero essere condotti ulteriori studi per determinare le risposte anticorpali specifiche anti-SLP e studi di protezione utilizzando SLP di C. difficile [64].

L'immunizzazione passiva e attiva utilizzando estratti isolati di SLP HMW e LMW ha mostrato risultati incoraggianti con tassi di sopravvivenza migliorati in modelli di sfida letale con criceti. O'Brien et al. hanno dimostrato la risposta protettiva degli anticorpi anti-SLP sull’infezione da C. difficile nei criceti, dove la sopravvivenza era significativamente prolungata nei gruppi trattati con anti-SLP rispetto ai gruppi di controllo [65]. È stato dimostrato che l’effetto protettivo dell’antisiero avviene attraverso il potenziamento della fagocitosi di C. difficile [65]. Eidhin et al., utilizzando l'immunizzazione attiva, hanno testato l'estratto grezzo di SLP contenente quantità equimolari dei peptidi componenti LMW e HMW di SlpA come vaccino con diversi adiuvanti sistemici e mucosali in criceti siriani dorati e modelli murini BALB/c. Lo studio ha riportato una stimolazione anticorpale da modesta a scarsa all’interno di diversi regimi e modelli murini hanno mostrato risposte anticorpali più forti agli SLP rispetto ai criceti [66]. In un altro studio, Brunet al. ha esaminato l'attività adiuvante in vivo di due peptidi costituiti dal dominio legante il recettore della tossina A (TxA (C314)) e un frammento di SLP-36 kDa del ceppo C. difficile C253 contro la proteina A legante la fibronectina (FnbpA ), un antigene vaccinale protettivo contro lo Staphylococcus aureus [67]. Hanno valutato la risposta utilizzando vie intranasali e sottocutanee e hanno scoperto che entrambi i frammenti miglioravano la produzione di IgG e IgA anti-FnbpA circolanti. Hanno concluso che questi frammenti, quando usati come adiuvanti, influenzano e polarizzano in modo differenziale il sistema immunitario [67]. In un altro studio, Shirvan et al. hanno generato ed espresso anticorpi ricombinanti specifici contro gli SLP come Cwp66 e SlpA dalle proteine ​​di C. difficile 630 utilizzando il phage display e hanno dimostrato che questi anticorpi ricombinanti reagivano agli SLP e ai loro componenti in modo ceppo-specifico con elevata specificità [68].

La risposta immunitaria e la protezione in un modello di criceto utilizzando la proteasi Cwp84 come antigene sono state valutate mediante diverse vie di immunizzazione [69]. Lo studio ha rilevato titoli anticorpali differenziali in base alle vie di immunizzazione. La migliore protezione è stata osservata attraverso la via di immunizzazione rettale. Inoltre, i gruppi di criceti immunizzati hanno prodotto una colonizzazione intestinale di C. difficile più debole e più lenta del 26% dopo il test con C. difficile con un tasso di sopravvivenza significativamente più alto (33% maggiore) rispetto ai gruppi non immunizzati [69].

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10. Anti-C basato su SLP. Terapie difficili

Terapie specifiche a base di anticorpi per neutralizzare C. difficile possono essere una strategia efficace. Kandalaft et al. hanno utilizzato anticorpi a dominio singolo per colpire gli SLP [70]. Il gruppo ha preparato un pannello di anticorpi a dominio singolo (VHH) specifici per SLP dal ceppo ipervirulento di C. difficile QCD-32g58 (ribotipo 027). I loro risultati hanno dimostrato un numero di VHH legati agli epitopi QCD-32g58 situati sulla subunità LMW di SLP con elevata affinità. Inoltre, hanno riferito che questi VHH avevano specificità di legame con i ribotipi 001 e 027 e che un sottoinsieme di questi anticorpi VHH era ampiamente cross-reattivo con i ribotipi 012, 017, 023 e 078. È stato anche dimostrato che questi VHH inibiscono la motilità QCD-32g58 di C. difficile in vitro [70].

Lo sviluppo di un altro agente antibatterico di precisione Av-CD291.2 da parte di Kirk et al. è stato riportato che uccide specificamente C. difficile e previene la colonizzazione nei topi [51]. È stato dimostrato che Av-CD291.2 uccide diversi isolati di C. difficile in base alla presenza di sequenze SLP nei ceppi di C. difficile. Gli autori affermano di aver identificato mutanti nulli SLP contenenti una mutazione puntiforme nel gene slpA, che sono resistenti agli agenti Av-CD291.2. Questi mutanti presentavano anche difetti di sporulazione ma erano in grado di colonizzare il tratto intestinale nonostante l’attenuazione della virulenza in un modello di criceto [51]. Inoltre, hanno costruito un pannello di Avidocin-CD che uccide vari ceppi di C. difficile in modo dipendente dalla sequenza SLP, suggerendo un ruolo importante di questi antibatterici basati su SLP nella prevenzione delle CDI [51].

11. Osservazioni conclusive e domande critiche senza risposta

L'ospite sviluppa una robusta risposta immunitaria specifica contro le tossine e i componenti di superficie di C. difficile. È stato dimostrato che gli SLP hanno un ruolo nell'adesione cellulare, nell'induzione di varie citochine attraverso l'attivazione di TLR4 e nell'attivazione delle risposte immunitarie sia innate che umorali. Tuttavia, sono necessari studi sull'attivazione delle risposte delle cellule T da parte degli SLP per analizzare ulteriormente il ruolo delle cellule CD4 e CD8. Sulla base dell'attivazione della risposta umorale, questi anticorpi neutralizzanti contro le tossine e i componenti di superficie possono prevenire i segni clinici della CDI. Gli studi che utilizzano l’immunizzazione attiva o passiva contro gli SLP hanno mostrato risultati promettenti, indicando che la strategia può essere ulteriormente sviluppata in nuove terapie contro la patogenicità delle CDI. Molta attenzione è stata data alla SlpA come candidato vaccino; tuttavia, a causa dell’elevata variabilità della sequenza della SlpA tra i ceppi, il vaccino potrebbe non essere efficace contro tutti i ribotipi. Pertanto, potrebbero essere necessari vaccini basati su epitopi per aggirare questo problema. A questo proposito, gli anticorpi a dominio singolo (VHH) contro gli SLP sono opzioni praticabili, che legano la subunità LMW-SLP del C. difficile con elevata specificità e hanno dimostrato di inibire la motilità dei ceppi di C. difficile. Attualmente, la comprensione del ruolo meccanicistico degli SLP e dei loro paralleli nella patogenesi, nell’adesione e nella risposta delle cellule T delle CDI è ancora nelle fasi iniziali e rimane in gran parte inesplorata. Sono necessari ulteriori studi per analizzare le funzioni molecolari e le risposte immunitarie specifiche degli SLP, per contribuire a favorire il rapido sviluppo di nuovi bersagli vaccini/farmaci e terapie per combattere le infezioni da C. difficile.

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