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Efficacia clinica e analisi trascrittomica dei granuli di Congrong Shujing (苁蓉舒痉颗粒) in pazienti con malattia di Parkinson della sindrome da carenza di essenza di Shen (rene)

CHEN Shi-ya1, XIAO Shao-jian1, LIN You-ning1, LI Xi-yu1, XU Qian2,

YANG Sha-sha2, HUANG Lian-hong3,4 e CAI Jing1,2

ASTRATTOObiettivo: valutare l'efficacia clinica e la sicurezza diGranuli Congrong Shujing(苁蓉舒痉颗粒, CSG) nel trattamento di pazienti conmorbo di Parkinson(PD) e sindrome di medicina cinese (CM) di Shen (Rene) carenza di essenza e di studiare il potenziale meccanismo che implica l'efficacia attraverso un approccio di sequenziamento del trascrittoma. Metodi: I pazienti idonei con PD con la sindrome da carenza di essenza di Shen sono stati assegnati in modo casuale a un gruppo di trattamento o a un gruppo di controllo in base a una tabella di numeri casuali e sono stati trattati rispettivamente con CSG in combinazione con la medicina occidentale (WM) o placebo in combinazione con WM. Entrambi i cicli di trattamento sono durati 12 settimane. L'UnificatoMorbo di ParkinsonPrima e dopo il trattamento sono stati valutati il ​​punteggio della scala di valutazione (UPDRS), il punteggio della domanda PD{0}} (PDQ-39), il punteggio della scala della sindrome CM e l'uso di farmaci di tutti i pazienti. La sicurezza è stata valutata mediante test clinici di laboratorio ed elettrocardiografi. Campioni di sangue da 6 pazienti in ciascun gruppo sono stati raccolti prima e dopo lo studio e utilizzati per l'analisi trascrittomica mediante analisi di ontologia genica e analisi del percorso dell'Enciclopedia dei geni e dei genomi di Kyoto. I geni espressi differenzialmente sono stati convalidati utilizzando la reazione a catena della trascrizione inversa-polimerasi. Risultati: un totale di 86 pazienti con PD è stato selezionato dal Third Affiliated People's Hospital dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese del Fujian tra gennaio 2017 e dicembre 2017. Infine, 72 pazienti hanno completato lo studio, di cui 35 nel gruppo di trattamento e 37 nel gruppo di controllo. Rispetto al gruppo di controllo dopo il trattamento, i pazienti nel gruppo di trattamento hanno mostrato riduzioni significative del punteggio UPDRS sub-Ⅱ, del punteggio PDQ-39, del punteggio della sindrome CM e della dose equivalente di levodopa (P<0.05). during="" the="" treatment="" course,="" no="" significant="" changes="" were="" observed="" in="" safety="" indicators="" between="" the="" two="" groups="" (p="">0.05). È stato proposto un possibile meccanismo di efficacia clinica che prevedeva la regolazione dei processi correlati al metabolismo cellulare e dei percorsi correlati ai ribosomi. Il trattamento con CSG ha dimostrato di influenzare loci genici rilevanti per PD, inclusi AIDA, ANKRD36BP2, BCL2A1, BCL2L11, FTH1P2, GCH1, HPRT1, NFE2L2, RMRP, RPS7, TGFBR1, WIPF2 e COX7B. Conclusioni: i CSG combinati con WM possono essere usati per trattare i pazienti con PD con sindrome CM da carenza di essenza di Shen con buona sicurezza. Sono stati proposti il ​​possibile meccanismo d'azione e loci genici rilevanti. (Numero di registrazione ChiCTR-IOR-16008394)

PAROLE CHIAVE Granuli Congrong Shujing, morbo di Parkinson, studio randomizzato controllato, sequenziamento dell'RNA, trascrittomica, medicina cinese

morbo di Parkinson(PD) è una malattia neurodegenerativa che si verifica sia nella popolazione di mezza età che in quella anziana. La sua prevalenza, morbilità e onere economico associato sono costantemente aumentati. Nella popolazione generale, la prevalenza stimata di PDn nei paesi industrializzati è del 0,3 percento . Nell'anno 2030, il numero di pazienti con PD dovrebbe raggiungere 4.940,000 in Cina e 8.670,000 in tutto il mondo. Il rischio relativo di morte nei pazienti con PD è circa il doppio rispetto alla popolazione totale. Tuttavia, gli attuali regimi di trattamento non possono impedire la progressione della condizione. Con la progressione della malattia, l'efficacia clinica del regime terapeutico spesso diminuisce e il funzionamento quotidiano e la partecipazione sociale sono significativamente compromessi.) Pertanto, l'assistenza a lungo termine dei pazienti con PD comporta un onere economico significativo per gli individui, le famiglie e la società.

La levodopa, il "gold standard" per il trattamento del PD, è generalmente efficace per 3-5 anni. Successivamente, i pazienti presentano comunemente gravi complicazioni motorie, tra cui fenomeno di fine dose, rigidità mattutina, congelamento e discinesia. Trattamento del PD conmedicinali cinesi(CM) possono migliorare i sintomi clinici dei pazienti e i corrispondenti effetti collaterali, migliorando così la qualità della vita dei pazienti con PD.

Granuli Congrongjing(苁蓉精颗粒, CRJ) è composto principalmente daHerba Cistanchee Polygonatum sibiricum, che deriva dalla famosa ricetta classica CM Dihuang Decoction (地黄饮子) usata per il trattamento del PD. Nei nostri precedenti studi sperimentali, sono stati confermati gli effetti benefici di CRJ. I dati hanno mostrato che Polygonatum sibiricum eHerba Cistanche, il componente principale di CRJ, migliora l'espressione della dopamina, riduce il contenuto dei fattori di apoptosi correlati (caspasi-3, FasL), aumenta l'espressione dei fattori neurotrofici e diminuisce l'apoptosi delle cellule nervose dopaminergiche. Lo studio ha anche mostrato che CRJ proteggeva i neuroni dopaminergici regolando l'apoptosi e il fattore neurotrofico derivato dalle cellule gliali. Tutti questi sopra menzionati hanno suggerito che CRJ fosse un farmaco terapeutico sicuro e prezioso per il trattamento del PD.

Sulla base della nostra esperienza clinica e ricerca sperimentale, CRJ è stato modificato aggiungendo Radix Paeoniae Rubra, Cortex Moutan e Salvia miltiorrhiza Bge., quindiCGranuli Shujing ongrong(苁蓉舒痉颗粒, CSGs) sono stati composti. Questo studio ha osservato l'efficacia clinica dei CSG nel trattamento di pazienti con PD con sindrome CM da carenza di essenza di Shen (rene) e i cambiamenti genetici nell'mRNA del sangue periferico dei pazienti. Per studiare il meccanismo d'azione alla base dei CSG nel trattamento della malattia di Parkinson, è stato utilizzato un approccio di sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) per analizzare in modo completo le trascrizioni geniche dei pazienti prima e dopo lo studio e per identificare e convalidare i geni differenzialmente espressi (DEG) .

METODI

Criteri diagnostici

I criteri diagnostici della medicina occidentale (WM) si riferivano agli ultimi standard diagnostici del PD pubblicati dalla International Parkinson and Movement Disorder Society nel 2015. I criteri diagnostici CM della sindrome da carenza di essenza di Shen si riferivano ai relativi standard pubblicati dalla China Press of Traditional Chinese Medicinale.

Criteri di inclusione ed esclusione

I pazienti che soddisfacevano i criteri diagnostici WM di cui sopra e i criteri di differenziazione della sindrome CM per il deficit di essenza di Shen, di età compresa tra 50 e 80 anni, avevano una scala di stadiazione Hoehn-Yahr (HY) di 4 e nello studio sono stati inclusi i consensi informati scritti firmati . I pazienti a cui sono state diagnosticate malattie importanti, comprese gravi disfunzioni d'organo, malattie mentali o neurologiche, infezioni gravi, tumori, encefalite o costituzione allergica, hanno ricevuto un trattamento con CM per PD entro 3 mesi o hanno partecipato ad altri studi clinici negli ultimi 3 mesi sono stati escluso.

Criteri di abbandono e cessazione

I pazienti che si sono ritirati volontariamente dallo studio o che non sono stati contattati sono stati considerati drop-out. I pazienti che hanno manifestato gravi effetti avversi o malattie e complicazioni improvvise e gravi e non sono stati in grado di continuare lo studio, hanno avuto una scarsa compliance del soggetto, hanno ricevuto meno dell'80% o più del 120% delle dosi di trattamento designate, hanno violato i protocolli dello studio, hanno fornito informazioni incomplete che influenzato la valutazione di efficacia sono stati esclusi dallo studio.

Partecipanti

Sono stati arruolati pazienti ambulatoriali e ricoverati idonei per PD del Terzo Ospedale del Popolo Affiliato dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese del Fujian. Il piano sperimentale, il consenso informato e i moduli di case report hanno ricevuto l'approvazione scritta dal Comitato di etica medica del Third Affiliated People's Hospital dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese del Fujian (n. 2017KS-6-1) ed è stato registrato presso il Chinese Clinical Registro di prova (numero di registrazione ChiCTR-IOR-16008394).

Stima della dimensione del campione

La dimensione del campione è stata calcolata sulla base dei dati presentati nello studio precedente e il metodo di stima della dimensione del campione• 414 • Chin J Integr Med 2020 Jun;26(6):412-419 è stato stabilito dal China Clinical Trials Statistical Working Gruppo. Utilizzando la formula di progettazione del contenuto del campione di un progetto completamente randomizzato e considerando un tasso di abbandono del 20 percento, è stato determinato che il gruppo di trattamento e il gruppo di controllo dovrebbero includere rispettivamente 43 soggetti.

Randomizzazione, occultamento dell'allocazione e accecamento

In questo studio è stato impiegato un metodo in doppio cieco completamente randomizzato. Il software SPSS è stato utilizzato per assegnare casualmente i soggetti ai due gruppi e per generare una tabella numerata casualmente. I farmacisti hanno dispensato i farmaci secondo la tabella. Soggetti, medici e revisori erano tutti ciechi rispetto all'assegnazione di soggetti e farmaci.

Droghe

Ogni dose di CSG era composta dall'estratto diHerba Cistanche6 g, Polygonatum sibiricum 12 g, Salvia miltiorrhiza Bge. 15 g, Radix Paeoniae rubra 12 g e Cortex Moutan 10 g. Il placebo è composto per il 5% da Radix Bupleuri con amido, destrina, ecc. Il suo aspetto, odore e gusto sono simili a quelli dei CSG. Sia i CSG (lotto n. 16004691) che il placebo (lotto n. 16004728) sono stati forniti da Beijing Kangrentang Pharmaceutical Co., Ltd. (Pechino, Cina) e distribuiti dal Dipartimento di Farmacia del Terzo Ospedale Popolare Affiliato dell'Università Tradizionale del Fujian Medicina cinese.

Trattamento

I soggetti nel gruppo di trattamento sono stati trattati con WM in combinazione con CSG, mentre i soggetti nel gruppo di controllo sono stati trattati con WM in combinazione con placebo. I WM sono stati selezionati secondo la linea guida. Tra questi, i farmaci più comunemente usati erano Madopar (lotto n. H10930198, Shanghai Roche Pharmaceutical Co. Ltd., Cina) e Sifrol (Boehringer Ingelheim Pharma GmbH, Germania). Secondo le linee guida fornite, durante il trattamento, i medici primari adatterebbero il dosaggio del farmaco in base alle condizioni del paziente. Ciascuna dose di CSG e placebo è stata divisa in due confezioni uguali, assunte 0,5 ore dopo colazione e cena, rispettivamente, per 12 settimane consecutive.

Misure di esito

Per le misure di esito, comprese le scale di valutazione dell'uso di farmaci e gli indici correlati, i soggetti di entrambi i gruppi sono stati valutati da medici qualificati sia prima dello studio che a 3 mesi dopo la somministrazione della dose iniziale.

Misure di esito primarie

La Unified Parkinson's Disease Rating Scale (UPDRS) era composta da punteggi di Ⅰ (comportamento mentale, comportamento attivo ed emozione), Ⅱ (attività quotidiane), Ⅲ (esame motorio) e Ⅳ (complicazioni motorie). Più alto è il punteggio, più grave è la condizione.

Misure di risultato secondarie

Le misure di risultato secondarie incluseMorbo di ParkinsonPunteggio della domanda-39 (PDQ-39),(21) Punteggio della scala della sindrome CM e uso di droghe della WM. PDQ-39 valuta la qualità della vita quotidiana dei pazienti con PD valutando le loro azioni, emozioni, vita quotidiana e supporto sociale. La CM Syndrome Scale valuta le sindromi CM correlate dei pazienti con PD, in modo da valutare la gravità della malattia (Appendice 1). Il dosaggio di WM è stato calcolato come dose equivalente di Levodopa (LED). Per i farmaci correlati al trattamento del morbo di Parkinson e delle sue complicanze che non erano inclusi nella formula LED (es. benzexolo cloridrato), sono state fatte osservazioni corrispondenti.

Valutazione della sicurezza

I test clinici di laboratorio che includono 3 routine principali (sangue/urina/feci), funzionalità epatica (aspartato transaminasi (AST) e alanina aminotransferasi (ALT)) e funzionalità renale (azoto ureico nel sangue (BUN) e creatinina sierica (Cr)) e come elettrocardiografo (ECG) dei pazienti sono stati valutati prima e dopo lo studio. Eventuali eventi avversi sono stati registrati con dettagli su tempi, grado di gravità, sintomi, durata, misure adottate ed esiti.

Analisi statistica

SPSS versione 24.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) è stato utilizzato per l'analisi statistica. I dati di misurazione normalmente distribuiti sono stati espressi come media ± deviazione standard (x–± s), mentre i dati non normalmente distribuiti sono stati espressi come intervallo mediano e interquartile. I conteggi sono stati espressi come numeri assoluti e tassi. Quando si confrontano i dati di misurazione tra i gruppi, è stato applicato il test t a due campioni se i dati/i dati trasformati seguivano una distribuzione normale. In altri casi è stato applicato il test della somma dei due campioni. Quando si confrontavano i dati di misurazione prima e dopo lo studio, è stato applicato un t-test per campioni appaiati se i dati/dati trasformati seguivano una distribuzione normale, mentre è stato applicato il test della somma dei ranghi per campioni appaiati. Per il confronto dei dati di conteggio è stato utilizzato il test del chi quadrato. P<0.05 was="" considered="" statistically="">

Esperimenti di sequenziamento del trascrittoma

RNA-seq Campioni di sangue da 6 pazienti in ciascun gruppo sono stati selezionati casualmente prima e dopo lo studio e l'RNA è stato estratto, purificato e valutato. Per completare la costruzione della libreria di campioni di sequenziamento, l'RNA totale è stato sottoposto a rimozione dell'rRNA, frammentazione, sintesi del cDNA del primo filamento, sintesi del cDNA del secondo filamento, riparazione del terminale, aggiunta di A al terminale 3', collegamento articolare e arricchimento. La libreria costruita è stata convalidata da Qubit® 2.0 Fluorometer e Agilent 2100. Il sequenziamento è stato eseguito dopo la convalida della libreria.

Analisi bioinformatica

Per l'analisi bioinformatica, le letture grezze derivate dall'analisi di sequenziamento sono state prima purificate per ottenere letture pulite e di alta qualità. Successivamente, è stato utilizzato un algoritmo di mappatura spliced ​​di His at 2 (versione 2.04) per la mappatura del genoma delle letture pulite. Il numero di letture è stato convertito in frammenti per kilobase di letture mappate del modello esone per milione (FPKM) utilizzando Stringtie (versione 1.3.{8}}) ​​e la media ridotta dei metodi dei valori M per standardizzare l'espressione genica. Successivamente, il foldchange nell'espressione genica differenziale è stato calcolato dall'FPKM. I geni con valore aq 0,05 e foldchange 2 sono stati considerati DEG. A DEG dal gruppo corrispondente con efficacia clinica, analisi dell'arricchimento della funzione dell'ontologia genica (GO) e percorso dell'Enciclopedia dei geni e dei genomi di Kyoto (KEGG)

è stata applicata l'analisi di arricchimento. Dopo aver regolato i criteri di variazione, sono stati selezionati i DEG di ciascun gruppo prima e dopo lo studio, che erano i loci del gene dell'effettoCistanche deserticheestratto. I geni selezionati sono stati ulteriormente convalidati dalla reazione a catena della polimerasi della trascrizione inversa (RT-PCR).

RISULTATI

Condizioni di completamento della prova

A total of 86 PD patients were selected from the Third Affiliated People's Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine between January 2017 and December 2017, 43 patients in each group. Finally, 72 patients completed the trial following the protocol, including 35 in the treatment group and 37 in the control group. The study flow diagram is presented in Figure 1. Between groups, no statistically significant difference was observed in age, disease stage, and H-Y stage (P>0.05, Tabella 1).

Confronto dei punteggi UPDRS tra i due gruppi

There was no significant difference between the two groups before treatment in UPDRS total score and subsection score (P>0.05). Rispetto ai punteggi prima del trattamento, il punteggio totale UPDRS e il punteggio inferiore a Ⅱ sono stati significativamente ridotti nel gruppo di trattamento dopo il trattamento (P<0.05). moreover,="" when="" compared="" with="" the="" control="" group="" after="" treatment,="" the="" updrs="" sub-ⅱ="" score="" was="" significantly="" decreased="" in="" the="" treatment="" group=""><0.05). however,="" there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" updrs="" total="" score="" between="" the="" two="" groups="" after="" treatment="" (p="">0.05, Tabella 2).

Confronto tra i punteggi PDQ{0}}, i punteggi della sindrome CM e l'uso di droghe tra i due gruppi

There was no significant difference between the two groups before treatment in PDQ-39 scores, CM syndrome scores, and drug dosage (P>0.05). Rispetto a prima del trattamento, i punteggi PDQ-39, il punteggio della sindrome CM e il LED erano significativamente ridotti nel gruppo di trattamento dopo il trattamento (P<0.05). moreover,="" when="" compared="" with="" the="" control="" group="" after="" treatment,="" the="" pdq-39="" score,="" cm="" symptom="" score="" and="" led="" were="" significantly="" decreased="" in="" the="" treatment="" group=""><0.05, table="">

Valutazione della sicurezza

During the trial, 2 cases in the treatment group with adverse events were observed. Both adverse reactions were light in grade and occurred on day 4 after the start of the trial, with symptoms of internal heat, thirsty, and dryness heat. One of them was not willing to continue the trial and dropped out. One week after terminating the CM granules, the symptoms reduced and then disappeared. Regarding the other subject, after Paeoniae Rubra and Salvia Miltiorrhiza were added to the CSGs, symptoms reduced after 4 days and disappeared. No changes were observed in the clinical laboratory tests and ECG that were directly related to the trial. In addition, no statistically significant differences were observed between the two groups in any of the indices before and after the trial (P>0.05).

Confronto del genoma

Dei sei campioni in ciascun gruppo, l'intervallo del numero di letture nel gene di riferimento era 74452867–117774869. I rapporti di mappatura delle sequenze del trascrittoma del campione erano dell'87,30% -96,14%.

Analisi Funzionale dei DEG GO Analisi dei DEG
I DEG del gruppo di trattamento prima e dopo lo studio sono stati raggruppati in 47 cluster funzionali (Figura 2). Inoltre, i DEG tra il gruppo di trattamento e il gruppo di controllo dopo lo studio sono stati raggruppati in 35 cluster funzionali (Figura 3). I DEG erano principalmente correlati alla regolazione cellulare e ai processi metabolici.

Analisi di arricchimento KEGG di DEG
Analisi dell'arricchimento del percorso utilizzando il database pubblico KEGG dei DEG del gruppo corrispondente con significatività statistica clinica di P<0.05 of="" the="" efficacy="" evaluation="" indices="" above="" suggested="" that pd-related="" degs="" were="" likely="" to="" be="" enriched="" in="" the="" following="" 4="" signaling="" pathways:="" (1)="" ribosome-related signaling="" pathways,="" (2)="" endocytosis-related="" signaling="" pathways,="" (3)="" foxo="" signaling="" pathways,="" and="" (4)="" were="" identified.="" moreover,="" 1="" up-regulated="" gene="" and="" 12="" down-regulated="" genes="" were="" identified="" in="" the="" control="" group.="" according="" to="" the="" quantitative="" analysis="" of="" degs,="" 13="" highly="" degs="" related="" to="" csgs="" had="" an="" effect="" in="" the="" pd="" patients="" screened,="" including="" aida,="" ankrd36bp2,="" bcl2a1,="" bcl2l11,="" fth1p2,="" gch1,="" hprt1,="" nfe2l2,="" rmrp,="" rps7,="" tgfbr1,="" wipf2,="" and="">

Analisi RT-PCR
I geni sopra menzionati sono stati convalidati utilizzando l'analisi RT-PCR. Tra questi, AIDA, ANKRD36BP2, BCL2A1, GCH1, HPRT1, NFE2L2, RMRP, RPS7 e COX7B erano geni up-regolati, mentre TGFBR1 era down-regolato (Appendice 3). Inoltre, non vi era alcuna differenza significativa nel cambiamento degli altri tre geni.

DISCUSSIONE

Un totale del 95% dei pazienti con PD ha un'età compresa tra 40 e 70 anni. L'età di esordio è per lo più intorno ai 50 anni e l'incidenza aumenta con l'età. In studi precedenti, è stato suggerito che i principi attivi nei CSG riducessero il danno correlato all'ossidazione del PD e diminuissero l'apoptosi dei neuroni della dopamina. I risultati di questo studio hanno indicato che i CSG hanno ridotto il dosaggio del medicinale e migliorato la qualità della vita dei pazienti con PD. In questo studio, un totale di 72 soggetti su 86 hanno completato lo studio. Il tasso di completamento è stato solo dell'83,7 percento, che era relativamente basso rispetto ad altri studi clinici simili. Le ragioni possono riguardare le due serie di test completi dei soggetti prima e dopo lo studio, i questionari complicati e il regolare 3-mese di follow -up visite per l'aggiustamento della dose. Sono necessari ulteriori sforzi per migliorare la conformità dei soggetti e il tasso di completamento delle prove.

Ci sono però altre domande a cui rispondere. I CSG possono sostituire i farmaci, come la dopamina, nella fase iniziale del trattamento del PD e ritardare l'assunzione di farmaci? A quale stadio del PD i CSG hanno un effetto significativo sulla riduzione della dose di farmaco? I CSG possono prolungare il periodo effettivo di assunzione dei farmaci? Per rispondere a queste domande, sono necessari ulteriori sforzi, inclusi studi di casi aggiuntivi, periodi di trattamento più lunghi, follow-up esteso dopo il trattamento, gravità e stratificazione dell'età più dettagliate e analisi statistiche più complete.

Sulla base dell'osservazione dell'efficacia dei CSG nel trattamento dei pazienti con PD, in questo studio, abbiamo studiato il possibile meccanismo dell'efficacia clinica dei CSG e dei geni correlati attraverso la tecnologia RNA-seq. Sono stati ottenuti la trascrizione, i risultati dell'analisi della funzione GO relativi all'efficacia clinica, i risultati dell'analisi del percorso KEGG e i loci genici attivi nel trattamento dei CSG sul PD. Tuttavia, saranno necessari ulteriori sforzi per identificare la via primaria coinvolta nell'attività dei CSG, i principi attivi e i monomeri nei CSG per il trattamento del PD e i corrispondenti sintomi dei loci genici su cui agiscono i CSG. Futuro
gli studi dovrebbero concentrarsi sull'integrazione delle teorie del CM con la bioinformatica e la moderna biologia molecolare per studiare gli effetti e il meccanismo d'azione della terapia di rinforzo di Shen sul trattamento del PD.

In sintesi, i risultati hanno indicato che i CSG erano efficaci nel migliorare la qualità della vita, alleviare i sintomi del CM e ridurre il dosaggio del farmaco nei pazienti con PD con sindrome da carenza di essenza di Shen. Nessun effetto collaterale grave è stato osservato durante lo studio. Il nostro studio ha indicato che i CSG potrebbero essere un potenziale nuovo farmaco per il trattamento del PD. Tuttavia, sono necessari studi multicentrici su una dimensione del campione più ampia per confermare questi risultati, che rientrano nel nostro piano di ricerca futuro.

Estratto da: Efficacia clinica e analisi trascrittomica dei granuli di Congrong Shujing (苁蓉舒痉颗粒) in pazienti con malattia di Parkinson di Shen (rene) Sindrome da carenza di essenza di CHEN Shi-ya1 ecc.

------Chin J Integr Med 2020 giu;26(6):412-419