L'iperglicemia induce l'immunità addestrata nei macrofagi e nei loro precursori e promuove l'aterosclerosi

SFONDO:

Il rischio cardiovascolare nel diabete rimane elevato nonostante le terapie ipoglicemizzanti. Abbiamo ipotizzato che l'iperglicemia induca un'immunità allenata nei macrofagi, promuovendo caratteristiche proaterogeniche persistenti.

Inoltre, in vari tipi di letteratura, abbiamo anche appreso che una pianta chiamata Cistanche ha un grande effetto sul miglioramento dell'immunità. Cistanche è una medicina tradizionale cinese con una vasta gamma di funzioni di regolazione immunitaria. Il rilascio di fattori, il miglioramento della funzione degli organi immunitari e altri modi per migliorare l'immunità del corpo umano. Pertanto, nella vita quotidiana, le persone possono migliorare la propria immunità mangiando Cistanche deserticola con moderazione, per prevenire e curare varie malattie.

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METODI:

Macrofagi derivati ​​dal midollo osseo da topi di controllo e topi con diabete sono stati cresciuti in glucosio fisiologico (5 mmol/L) e sottoposti a sequenziamento dell'RNA (n=6), test per il sequenziamento della cromatina accessibile alla trasposasi (n=6 ) e sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina (n=6) per la determinazione dell'immunità addestrata indotta dall'iperglicemia. Il trapianto di midollo osseo da topi con (n=9) o senza (n=6) diabete in topi Ldlr -/− (normoglicemici) è stato utilizzato per valutare il suo significato funzionale in vivo. La prova dell'immunità allenata indotta dall'iperglicemia è stata ricercata nelle cellule mononucleate del sangue periferico umano di pazienti con diabete (n =8) ​​rispetto ai soggetti di controllo (n =16) e nei macrofagi della placca aterosclerotica umana asportati mediante microdissezione a cattura laser .

RISULTATI:

Nei macrofagi, l'alto glucosio extracellulare ha promosso l'espressione genica proinfiammatoria e le caratteristiche funzionali proaterogeniche attraverso meccanismi dipendenti dalla glicolisi. I macrofagi derivati ​​dal midollo osseo di topi diabetici hanno mantenuto queste caratteristiche, anche se coltivati ​​in glucosio fisiologico, indicando un'immunità allenata indotta dall'iperglicemia. Il trapianto di midollo osseo da topi diabetici in topi Ldlr-/- (normoglicemici) ha aumentato l'aterosclerosi della radice aortica, confermando una forma persistente e rilevante per la malattia di immunità innata allenata. Il test integrato per la cromatina accessibile alla trasposasi, l'immunoprecipitazione della cromatina e le analisi di sequenziamento dell'RNA delle cellule staminali ematopoietiche e dei macrofagi derivati ​​dal midollo osseo hanno rivelato un effetto di innesco proinfiammatorio nel diabete. Il modello di cromatina aperta ha implicato il fattore di trascrizione Runt-correlato fattore di trascrizione 1 (Runx1). Allo stesso modo, i trascrittomi dei macrofagi della placca aterosclerotica e dei leucociti periferici nei pazienti con diabete di tipo 2 sono stati arricchiti per gli obiettivi Runx1, in linea con un potenziale ruolo nella malattia umana. L'inibizione farmacologica di Runx1 in vitro ha inibito il fenotipo addestrato.

CONCLUSIONI:

L'immunità allenata indotta dall'iperglicemia può spiegare perché il targeting di glucosio elevato è inefficace nel ridurre il rischio macrovascolare nel diabete e suggerisce nuovi obiettivi per la prevenzione e la terapia delle malattie.

Parole chiave:

diabete mellito ◼ epigenetica ◼ glucosio ◼ infiammazione ◼ macrofagi

Il diabete è associato a un alto rischio di aterosclerosi e delle sue complicanze, compreso l'infarto del miocardio.1 L'iperglicemia è una caratteristica fondamentale sia nel diabete di tipo 1 che in quello di tipo 2 e i trattamenti si sono concentrati principalmente sull'abbassamento della glicemia. La terapia ipoglicemizzante intensiva è efficace nel ridurre il rischio vascolare nei pazienti con diabete di tipo 1, ma l'effetto è differito di diversi anni2 e temporaneamente disconnesso dal controllo della glicemia.3 Nel diabete di tipo 2, la riduzione del glucosio non ha mostrato alcun effetto o un effetto modesto sugli esiti vascolari correlati all'aterosclerosi come l'infarto miocardico acuto.4-6 Il rischio persistente di complicanze cardiovascolari, anche dopo la riduzione del glucosio, è stato chiamato effetto legacy o memoria metabolica,4,7 ma i meccanismi sottostanti rimangono oscuri.

L'aterosclerosi è una malattia infiammatoria cronica caratterizzata dalla deposizione e dalla ritenzione di lipoproteine ​​modificate e dall'accumulo di cellule immunitarie nelle pareti delle grandi arterie. I macrofagi sono fondamentali in tutti gli stadi dell'aterosclerosi e sono ampiamente considerati bersagli terapeutici.8 Sono eterogenei e rispondono funzionalmente ai segnali microambientali. I macrofagi sono stati sottotipizzati in fenotipi opposti, vale a dire proinfiammatori (M1), in risposta al lipopolisaccaride del ligando del recettore Toll-like (LPS) e interferone- (IFN), o riparatore tissutale (M2), per esempio, in risposta all'interleuchina (IL )-4, sebbene in vivo il loro ambito funzionale sia indubbiamente più complesso.9

L'iperglicemia esacerba la progressione dell'aterosclerosi e ritarda la regressione della placca,10 con una maggiore espressione di geni proinfiammatori e resistenza all'induzione dell'espressione genica associata a M2-.10,11 Nei monociti e nei macrofagi, i percorsi energetici cellulari sono governati da un'interazione tra stimoli intrinseci e ambientali, che, a loro volta, influenzano marcatamente la funzione immunitaria e l'espressione genica.12 In risposta a IL-4, i macrofagi M2 metabolizzano principalmente gli acidi grassi e si affidano alla fosforilazione ossidativa.13 Al contrario, i macrofagi M1 richiedono glucosio e un passaggio alla glicolisi aerobica, simile all'effetto Warburg nel cancro.14,15 Questi cambiamenti metabolici si verificano come conseguenza della stimolazione delle citochine, ma possono anche determinare la funzione dei macrofagi.16 Inoltre, rapporti recenti indicano che i cambiamenti nel metabolismo dei monociti e dei macrofagi , inclusa la glicolisi aerobica o l'attivazione della via del mevalonato,17,18 inducono la memoria delle cellule immunitarie innate a lungo termine (chiamata immunità addestrata) attraverso modificazioni epigenetiche e alterazioni della struttura della cromatina.19 La persistenza a lungo termine dei monociti addestrati circolanti è guidata dalla riprogrammazione dei loro progenitori del midollo osseo (BM).20

Abbiamo ipotizzato che l'immunità allenata in risposta a livelli elevati di glucosio sia responsabile della memoria iperglicemica diabetica sull'aterosclerosi. Di conseguenza, abbiamo cercato di determinare se i cambiamenti rilevanti per la malattia indotti dall'iperglicemia nella funzione dei monociti e dei macrofagi e se questi cambiamenti persistessero dopo il ripristino del glucosio normale, implicando una riprogrammazione fondamentale. Abbiamo combinato studi sulla funzione cellulare, metabolomica, trascrittomica ed epigenomica per definire in che modo l'iperglicemia altera il metabolismo per modulare l'attivazione a lungo termine attraverso modifiche epigenetiche. Abbiamo esplorato come questi cambiamenti possono verificarsi a livello di cellule staminali ematopoietiche (HSC) e nei macrofagi differenziati. Il significato funzionale è testato attraverso il trapianto di BM in un modello murino di aterosclerosi e i risultati sono convalidati dall'interrogazione dei macrofagi estratti dal sangue periferico umano e dalle placche aterosclerotiche mediante microdissezione a cattura laser (LCM). I nostri risultati possono spiegare la resistenza delle complicanze macrovascolari del diabete ai trattamenti ipoglicemizzanti convenzionali.

METODI

Risorse dati

I dati generati in questo studio sono stati depositati presso il National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibus e sono accessibili tramite il numero di accesso GSE176068.

Animali

Murine BM transplantation experiments were performed at The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) in vivo facility by the Institutional Animal Care and Use Committee regulations (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care accredited facility, project reference 70195 IVAT). All other animal protocols were conducted by the UK Home Office under the guidance of the operation of the Animals (Scientific Procedures) Act 1986, complying with all ethical regulations and the institutional review board guidelines (project license 30/3374; January 27, 2016). Wild-type C57BL/6J (12–14 weeks old) were randomly assigned to control or diabetic experimental groups. Diabetes was induced through an intraperitoneal injection of streptozotocin at a low dose range (42–45 mg·kg−1·/d−1) over 5 consecutive days. After 6 weeks after the final streptozotocin injection, diabetic mice with nonfasted blood glucose levels >13,9 mmol/L sono stati soppressi e il tessuto è stato raccolto.

Linee cellulari

Tutte le linee cellulari sono state coltivate a 37 gradi e al 5% di CO2. Le cellule L929 sono state coltivate nel terreno del Roswell Park Memorial Institute integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS), il 2% di penicillina-streptomicina e 2 mmol/L di glutammina. Le cellule L929 sono state coltivate fino alla piena confluenza per 7-8 giorni e il terreno condizionato è stato rimosso, diviso in aliquote e conservato a -20 gradi fino a quando richiesto. Cellule endoteliali di topo derivate dalla pelle sono state coltivate in 25 mmol/L di glucosio DMEM con 10% di FBS, 2% di penicillina-streptomicina e 2 mmol/L di glutammina.

Macrofagi derivati ​​da BM

I macrofagi derivati ​​da BM (BMDM) utilizzati in questo studio sono stati generati lavando BM da femori e tibie murini e placcando su piastre di Petri non trattate con coltura tissutale in DMEM di glucosio completo da 5 mmol/L (integrato con 10% FBS, 2% penicillina -streptomicina e 2 mmol/L di glutammina) più il 20% di terreno condizionato da cellule L929 per la differenziazione. Dopo la differenziazione per 7 giorni, i BMDM sono stati selezionati positivamente, placcati a una densità di 2 × 105 cellule/mL e stimolati in DMEM di glucosio completo da 5 mmol/L (se non diversamente specificato) con 10 ng/mL di interferone murino ricombinante- (IFN - ; R&D Systems, Regno Unito) più 100 ng/mL di LPS (Sigma-Aldrich, Regno Unito), 10 ng/mL di IL di topo ricombinante-4 (R&D Systems, Regno Unito) o controllo solo su terreno per 16 ore prima dell'uso . I BMDM sono stati anche coltivati ​​simultaneamente in varie condizioni glicemiche (5 mmol/L di glucosio DMEM con l'aggiunta di glucosio per ottenere una concentrazione finale di 11 o 20 mmol/L di glucosio) o una condizione di controllo osmotico (mannitolo; 5 mmol/L di glucosio DMEM più 15 mmol/L di mannitolo). Gli studi metabolici sono stati eseguiti in assenza o in presenza di 10 mmol/L dicloroacetati (Sigma-Aldrich, UK) o 1 mmol/L 2-deossi-d-glucosio (Sigma-Aldrich, UK).

Isolamento HSC

Le HSC sono state isolate con il MagniSort Mouse Hematopoietic Lineage Depletion Kit (ThermoFisher Scientific, UK) lavando BM da femori e tibie murini e incubando con marcatori per rimuovere le cellule impegnate nel lignaggio (CD3, CD4, B220, Ter119 e Gr1) e arricchire per HSC. Le HSC sono state coltivate in provette di smistamento cellulare attivate dalla fluorescenza da 5 mL in DMEM completo da 5 mmol/L (o 20 mmol/L di glucosio o mannitolo per le stimolazioni wild-type indicate) con l'aggiunta di 100 ng/mL di LPS più 10 ng/mL di IFN - o 10 ng/mL di IL di topo ricombinante-1 (R&D Systems, UK) per 16 ore per l'analisi Western blot o 2 ore per il test per l'analisi del sequenziamento della cromatina accessibile alla trasposasi (ATAC-seq).

Modello di memoria in vitro BMDM

Il BM di topo è stato differenziato in BMDM come descritto sopra in 5 o 20 mmol/L di glucosio per 1, 2, 4 o 7 giorni. I BMDM sono stati selezionati positivamente attraverso l'adesione, sostituiti in DMEM completo da 5 mmol/L e lasciati in incubazione per 48 ore per consentire un periodo di normalizzazione del glucosio. I BMDM sono stati quindi stimolati per l'uso con 10 ng/mL IFN- più 100 ng/mL LPS o terreno di controllo per 16 ore in assenza o presenza di 0,25, 0,5, 1, 5 o 10 µmol/L Ro 5-3335 (Merck Millipore, Regno Unito) prima dell'uso per l'analisi dell'espressione genica.

Isolamento dei monociti di topo

I monociti murini sono stati isolati dal sangue periferico con il kit di isolamento dei monociti di topo EasySep (Stemcell Technologies, Canada) secondo il protocollo del produttore. Le cellule sono state utilizzate immediatamente per il test di adesione statica.

Kit per il dosaggio dell'ATP in tempo reale Seahorse XFe 96

L'analisi del flusso extracellulare è stata eseguita con il kit XFp RealTime ATP Rate Assay su BMDM (8×104 cellule per pozzetto; 5 pozzetti replicati per animale e condizione), secondo le istruzioni del produttore. Sono state effettuate tre misurazioni del tasso di consumo di ossigeno al basale e del tasso di acidificazione extracellulare prima dell'iniezione di diverse concentrazioni di glucosio (5 o 20 mmol/L) o di controllo (mannitolo; porta di iniezione A). Dopo altre 7 misurazioni, composti oligomicina (2 µmol/L; porta di iniezione B) e combinati antimicina A (0,5 µmol/L) e rotenone (0,5 µmol/L; porta di iniezione C), dall'XFp Real-Time ATP Rate Assay kit, sono stati iniettati in sequenza con 3 misurazioni successive. La quantità di ATP prodotta dalla glicolisi e l'indice del tasso di ATP (tasso di produzione di mitoATP/tasso di produzione di ATP glicolitico) sono stati calcolati automaticamente con Wave (versione 2.6, Agilent).

Saggio di adesione statica

Cellule endoteliali di topo derivate dalla pelle sono state coltivate fino alla confluenza su vetrini coprioggetto in 12-piastre di pozzetti e attivate da 10 ng/mL di fattore di necrosi tumorale di topo ricombinante (R&D Systems, Regno Unito) per 16 ore. I monociti del sangue periferico non stimolati o stimolati con IFN più LPS (o BMDM da topi diabetici con streptozotocina coltivati ​​in 5 mmol/L di glucosio) sono stati etichettati in modo fluorescente in verde con il kit di collegamento cellulare fluorescente PKH67 (Sigma-Aldrich, Regno Unito) secondo le istruzioni del produttore. Le cellule marcate sono state aggiunte alle cellule endoteliali a una densità di 5 × 104 cellule per coprioggetto per 1 ora prima che i media e le cellule non attaccate fossero rimosse, lavate con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e fissate in paraformaldeide al 4%. Sono state acquisite quattro immagini per coprioggetto; è stato contato il numero di cellule aderite ed etichettate; e le immagini per coprioggetto sono state mediate. Le immagini visualizzate sono state ugualmente regolate in luminosità su ImageJ.

Analisi delle cellule schiumose

I BMDM non stimolati o stimolati (LPS più IFN-) sono stati coltivati ​​su vetrini coprioggetti in 12-pozzetti e incubati con 25 µg/mL di lipoproteine ​​a bassa densità (LDL; Bioquote, US) DiI-acetilate per 48 ore. I terreni e le restanti LDL DiI-acetilate sono state rimosse e le cellule sono state lavate 3 volte con PBS e fissate in paraformaldeide al 4%. Il lipide è stato colorato con Oil Red O e i coprioggetti sono stati montati con DAPI. Sono state scattate immagini a contrasto di fase della colorazione Oil Red O e immagini fluorescenti dei nuclei (4 immagini per coprioggetto) e utilizzate per quantificare la quantità di lipidi o il numero di cellule, rispettivamente, con il software ImageJ. L'area lipidica per immagine è stata quindi normalizzata al numero di cellule per immagine e i risultati sono espressi come cambiamento di piega su campioni di controllo del glucosio di 5 mmol/L (per esperimenti sul glucosio BMDM) e campioni di controllo (per esperimenti BMDM diabetici). Le immagini visualizzate sono state regolate in modo uniforme sulla luminosità.

Esperimento di trapianto di midollo osseo diabetico

BM transplantation experiments were performed at The Jackson Laboratory. Diabetes was induced in CD68–green fluorescent protein (GFP) transgenic mice as previously described for 4 weeks. Diabetic CD68-GFP mice with nonfasted blood glucose levels >13,9 mmol/L e topi CD68-GFP di controllo della stessa età sono stati utilizzati come donatori di BM. BM è stato raccolto da topi donatori e 5 × 106 cellule vitali sono state iniettate per via endovenosa in topi LdLr−/− B6.129S 7- Ldlr-tm1Her/J irradiati letalmente (2 × 500 rad) (stock JAX n. 002207 ). Dopo l'attecchimento, tutti gli animali riceventi sono stati sottoposti a una dieta occidentale (Open Source Diets D12079B; 1% di grassi, 40% di kcal) per 12 settimane. Il sangue intero è stato raccolto a 4, 8 e 12 settimane dopo l'attecchimento per l'analisi citometrica a flusso delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e per monitorare i livelli di attecchimento e valutare i numeri della popolazione dei leucociti. L'attecchimento, valutato ogni 4 settimane dopo l'attecchimento, è stato monitorato colorando le cellule con antiCD45 e valutando la proporzione relativa di cellule CD45 plus GFP plus nella popolazione totale CD45 plus. A 12 settimane, i topi sono stati sottoposti a eutanasia, è stato raccolto sangue intero e i sieri sono stati elaborati per le misurazioni di trigliceridi, acidi grassi non esterificati, LDL e colesterolo lipoproteico ad alta densità. I topi sono stati perfusi con PBS, seguiti da perfusione e fissazione con paraformaldeide al 4% durante la notte. Il cuore e l'aorta sono stati sezionati e posti in etanolo al 70% fino al trattamento.

Analisi della placca della radice aortica e immunofluorescenza

Per quantificare il carico di placca, le radici aortiche fissate con paraformaldeide sono state poste in un mezzo di taglio ottimale e sezionate su un piano parallelo agli atri. Per quantificare il volume della placca, il contenuto lipidico della placca,21 e il contenuto di collagene, 5 sezioni, distribuite uniformemente attraverso la radice aortica, sono state colorate con tricromia di Masson-Goldner (Merck, Regno Unito). In breve, le sezioni sono state nuovamente fissate nella soluzione di Bouin a temperatura ambiente per 1 ora, lavate in acqua corrente per 5 minuti e quindi sottoposte al protocollo del kit di colorazione Masson-Goldner dalla seconda incubazione con etanolo al 70 percento secondo le istruzioni del produttore tempistiche del protocollo. I vetrini bagnati con xilene sono stati quindi montati con Neo-Mount e sigillati con vetrino coprioggetto. Le caratteristiche della placca sono state quantificate sul software Image Pro Plus versione 6.0 (Media Cybernetics, Silverspring, MD) e i dati sono stati visualizzati come media di tutte le sezioni.

L'immunofluorescenza è stata quindi eseguita su 6 sezioni adiacenti. Le sezioni sono state colorate per il contenuto di macrofagi con GFP (rabbit anti-GFP, A6455, Invitrogen) o il marcatore di macrofagi galectin-3 (goat anti-galectin 3, AF1197, R&D Systems), per il contenuto di cellule muscolari lisce con -actina ( coniglio anti-actina del muscolo liscio, ab32575, Abcam PLC) e per i marchi epigenetici H3K4me3 (coniglio policlonale all'istone H3 [trimetil K4], Ab8580, Abcam PLC) e H3K27ac (coniglio policlonale all'istone H3 [acetil K27], Ab4729, Abcam PLC). Per la colorazione con immunofluorescenza, le sezioni sono state reidratate con PBS per 5 minuti a temperatura ambiente e bloccate per 1 ora con DAKO blocking buffer (Agilent, UK). L'anticorpo primario è stato diluito a 1 µg/mL in DAKO e aggiunto alle sezioni durante la notte a 4 gradi. Gli anticorpi secondari sono stati diluiti 1:200 in DAKO e aggiunti per 1 ora a temperatura ambiente (donkey anti-rabbit [A488], A21206, Life Technologies; donkey antigoat [A594], A11058, ThermoFisher Scientific). Le sezioni sono state infine montate con DAPI (mezzo di montaggio del glicerolo con DAPI e DABCO, Abcam, Regno Unito). Le immagini fluorescenti sono state analizzate con il software Image J.

Espressione genica

L'RNA totale è stato isolato con un kit RNeasy Plus Mini (Qiagen, Regno Unito) e quantificato con uno spettrofotometro UV-visibile Nanodrop 2000. La sintesi del cDNA è stata eseguita con 0,2-2 μg di RNA in una reazione a catena della polimerasi (PCR) con il kit di trascrizione inversa QuantiTect (Qiagen, Regno Unito), secondo le istruzioni del produttore. La PCR quantitativa in tempo reale è stata eseguita su 5 ng/µL di cDNA con sonde Taqman specifiche per B2m (Mm00437762), Il-6 (Mm00446190), Il-1 (Mm00462531_ m1), iNos (Mm00440502), Ym1 (Mm00657009) e Fizz1 (Mm00556208). La PCR quantitativa è stata eseguita con TaqMan universal master mix II con UNG su QuantStudioTM 7 Flex Real-Time PCR System (ThermoFisher). Tutti i dati della PCR sono stati normalizzati all'espressione genica della governante interna (B2m) e analizzati con il metodo 2-ΔCT per calcolare l'espressione relativa dell'mRNA.

Analisi Western Blot

Le cellule sono state lavate in PBS ghiacciato e lisate in tampone di lisi del saggio di radioimmunoprecipitazione (150 mmol/L NaCl, 1.0 percento IGEPAL CA-630, 0.5 percento di sodio desossicolato, 0,1 percento SDS, 50 mmol/L Tris, pH 8,0) integrato con inibitori della proteasi e della fosfatasi. La concentrazione proteica è stata determinata mediante dosaggio dell'acido bicinconinico (Pierce BCA Protein Assay Kit, ThermoFisher Scientific, Regno Unito) secondo le istruzioni del test. Concentrazioni uguali di proteine ​​sono state caricate e fatte funzionare su un gel SDS-PAGE (dal 4% al 12% di Bis-Tris Gel, Life Technologies, Regno Unito) per separarle. Le proteine ​​sono state trasferite su una membrana di nitrocellulosa (Bio-Rad, Regno Unito) e sondate con anticorpi specifici come indicato con -actina (topo anti- -actina [15G5A11/E2], Invitrogen) come governante e controllo del carico. Le membrane sono state sviluppate (SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate, Thermo Scientific, UK) e rilevate mediante chemiluminescenza su una Biorad Image Station.

Campioni umani e isolamento LCM dei macrofagi della placca

Tutte le indagini cliniche sono state condotte dalla Dichiarazione di Helsinki e i campioni sono stati conservati ai sensi della legge sui tessuti umani del Regno Unito (2004). Lo studio è stato approvato dal comitato di revisione etica competente e tutti i soggetti hanno fornito il consenso informato scritto. Sono stati reclutati pazienti in attesa di endoarteriectomia carotidea e le placche carotidee sono state raccolte al momento dell'intervento chirurgico (caratteristiche del paziente riassunte nel file Excel I nel Data Supplement). Le placche carotidee espiantate sono state lavate in PBS sterile ghiacciato, congelate a scatto in un mezzo di taglio ottimale e conservate a -80 gradi fino al trattamento.

LCM è stato eseguito con un sistema LCM Microbeam PALM (Carl Zeiss GmbH, Germania) utilizzando un approccio adattato di "vetrina guida".22,23 I campioni di placca carotidea sono stati appena sezionati a 15 µm. I vetrini guida erano costituiti da 3 sezioni consecutive: la prima sezione è stata colorata con il protocollo del kit di colorazione Masson-Goldner per aiutare nella determinazione delle posizioni microanatomiche, e le successive 2 sono state immunocolorate per entrambi i macrofagi (topo antiumano CD68 [clone KP{{7} }], Dako, Cambridge UK) o cellule muscolari lisce (actina antiumana di topo [clone 1A4], Dako, Cambridge UK). Le sezioni successive (fino a 15) sono state tagliate su vetrini con membrana LCM (ThermoFisher Scientific, Regno Unito) e colorate con cresil violetto pronte per l'elaborazione immediata. I cluster di cellule di macrofagi sono stati identificati manualmente in base alla colorazione del vetrino guida utilizzando PALM RoboSoftware (versione 4.5, Carl Zeiss GmbH, Germania). Un'area di interesse combinata totale compresa tra 3 e 5 × 106 μm2 è stata catturata al laser su uno Zeiss PALM AdhesiveCap (Carl Zeiss GmbH, Germania). Le cellule sono state immediatamente lisate, congelate a scatto su ghiaccio secco e conservate a -80 gradi fino a quando l'RNA non è stato estratto con il micro kit RNEasy (Qiagen, Regno Unito), secondo il protocollo del produttore.

Microarray di macrofagi di placca umana

Isolated plaque macrophage RNA concentration was determined with the Agilent RNA 6000 Pico LabChip on the Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, US). Samples with an RNA integrity number >5 sono stati portati avanti per l'amplificazione dell'RNA, la biotinilazione e l'analisi dei microarray di espressione genica. Questi campioni sono stati inviati ai Cambridge Genomic Services (Dipartimento di Patologia, Università di Cambridge, Regno Unito) per un'ulteriore elaborazione. L'amplificazione e la biotinilazione sono state eseguite con il kit Ovation Pico WTA V2 (Nugen Technologies Inc, USA), quindi l'ibridazione è stata variata in ordine casuale su 2 Illumina Human HT12 v4.0 BeadChips (Illumina, USA) per ridurre al minimo il batch /variazione chip. Illumina BeadArrays sono stati elaborati con il pacchetto di array di sfere Bioconductor (versione 2.24.0)24,25 utilizzando la normale normalizzazione esponenziale. I set di sonde sono stati compressi per gene in base all'intervallo interquartile massimo per evitare valori estremi ma catturare la variabilità in tutti i campioni. I set di sonde non annotati e di controllo sono stati esclusi da ulteriori analisi. L'espressione differenziale (DE) dell'elenco finale di 21036 geni è stata valutata con il pacchetto Bioconductor limma (versione 3.30.13)26 per confrontare il diabetico con il controllo, aggiustando per lo stato sintomatico/asintomatico. Data la disponibilità di set di dati ortogonali e 8 campioni per gruppo, abbiamo utilizzato un valore aggiustato relativamente indulgente di P<0.2 with no fold change cutoff to select genes to pursue.

Isolamento di monociti umani

Il sangue venoso periferico (15-20 mL) è stato ottenuto da donatori sani in provette rivestite con K2-EDTA (BD Vacutainer, New Jersey) ed elaborato entro 1 ora. Il plasma e una frazione arricchita di cellule mononucleate sono stati ottenuti centrifugando il sangue intero su colonne Accuspin Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, USA) secondo le istruzioni del produttore. La frazione arricchita di cellule mononucleate è stata portata avanti per l'isolamento dei monociti con un kit di isolamento di sferette di selezione negativa (kit di arricchimento di monociti umani EasySep senza deplezione di CD16, StemCell Technologies, Canada), seguendo il protocollo descritto dal produttore.

Isolamento e stimolazione delle cellule mononucleari del sangue periferico umano

I pazienti con diabete e i pazienti di controllo sono stati reclutati per gli studi clinici dopo l'approvazione etica locale e regionale presso il Karolinska Institute, Stoccolma (2011/1002-31/1 e 2009/1881-31/1). I PBMC sono stati isolati da campioni di sangue periferico raccolti dopo il digiuno notturno con SepMate (StemCell Technologies) e Lymphoprep (StemCell Technologies) secondo le istruzioni del produttore. I PBMC isolati sono stati congelati e conservati in FBS al 90% e dimetilsolfossido al 10%.

I PBMC immagazzinati sono stati scongelati e lavati in PBS mediante centrifugazione (500 g per 10 minuti), le cellule vitali sono state contate e placcate in singoli pozzetti di una 12-piastra di coltura tissutale in DMEM di glucosio fisiologico (basso), FBS al 10%, 2 mmol/L l-glutammina e 1% di penicillina e streptomicina. Le PBMC sono state lasciate a riposo durante la notte e trattate con PBS-veicolo o 100 ng/mL di LPS e 10 ng/mL di IFN- ricombinante (R&D Systems) per 6 ore. Dopo la stimolazione, le PBMC sono state lisate in RLT (QIAGEN), congelate a scatto e conservate a -80 gradi . L'RNA è stato isolato e sottoposto a sequenziamento dell'RNA (RNAseq) come descritto.

Metabolomica e misurazioni dei metaboliti

I monociti umani isolati sono stati coltivati ​​a una densità di 3,5×105 cellule per campione in DMEM di glucosio completo da 5 mmol/L, terreno integrato con glucosio per ottenere una concentrazione finale di 20 mmol/L di glucosio , o media con mannitolo 15 mmol/L in provette di smistamento cellulare attivate dalla fluorescenza da 5 mL per 12 ore. I lisati cellulari sono stati preparati mediante estrazione con metanolo ghiacciato per 20 minuti su ghiaccio secco e congelati a scatto in azoto liquido. Il giorno dell'analisi, i campioni sono stati sottoposti a vortex e quindi centrifugati a 10,000g per 10 minuti a 4 gradi . Un campione di controllo qualità raggruppato è stato preparato miscelando 60 µl di ciascun estratto di campione e analizzato periodicamente durante l'intero ciclo analitico per confermare le prestazioni del metodo. I campioni sono stati filtrati con un filtro centrifugo Ultrafree-MC da 0.1-µm (5000 g, 3 minuti) e quindi trasferiti in fiale per cromatografia liquida-spettrometria di massa. Le analisi metabolomiche non mirate sono state eseguite come descritto in precedenza.27 In breve, i campioni sono stati analizzati su una cromatografia liquida ad altissime prestazioni Thermo Ultimate 3000 accoppiata a un Q-Exactive Orbitrap utilizzando l'acquisizione a commutazione di polarità (positivo-negativo) operante a un potere di risoluzione di massa di 70000 larghezze complete a metà massimo. I composti idrofili sono stati separati cromatograficamente su una colonna Merck Sequant ZIC-HILIC (150×4,6 mm, dimensione delle particelle 5-µm) e i composti idrofobi utilizzando una colonna Thermo Accucore aQ RP C18 (150×2,1 mm, 2.{{38 }}µm dimensione delle particelle). I metaboliti sono stati identificati utilizzando un database interno.27 L'arricchimento del set di metaboliti e l'analisi delle vie metaboliche sono state eseguite su tutte le misurazioni dei metaboliti utilizzando MetaboAnalyst (versione 4.0).

Per le misurazioni del metabolita BMDM e HSC, le cellule sono state coltivate come descritto in precedenza a una densità di 5 × 105 per pozzetto e i surnatanti di coltura sono stati eseguiti su ABX Pentra 400 (Horiba) per misurare il glucosio (ABX Pentra Glucose PAP CP, Horiba, Regno Unito) e livelli di lattato (ABX Pentra Lactic Acid). Le misurazioni sono state normalizzate alle concentrazioni di glucosio e lattato presenti nel mezzo di coltura cellulare completo di controllo che è stato incubato nelle stesse condizioni ma non in presenza di cellule. I lisati cellulari BMDM sono stati utilizzati per misurare i livelli di succinato (Succinate Assay Kit, Abcam, UK) secondo le istruzioni del produttore.

Analisi ATAC-seq

Control or diabetic isolated HSCs or BMDMs, unstimulated or stimulated with IL-1β or LPS+IFN-γ for 2 hours, respectively, in 5 mmol/L glucose DMEM were used for ATAC-seq analysis according to a previously described protocol.28 Briefly, nuclei from 50000 HSCs or 75000 BMDMs per replicate were isolated, lysed on ice, and immediately put through transposition reaction using Tn5 transposase and TD buffer (Illumina, US) for 30 minutes at 37°C. Library amplification (NEBNext High Fidelity 2× PCR master mix, New England Biolabs, US) was followed by SPRI size selection to exclude fragments >1200 bp. Le concentrazioni di DNA sono state misurate con un fluorometro Qubit (Life Technologies) e la distribuzione delle dimensioni della libreria è stata valutata con il Bioanalyser DNA HighSensitivity Chip (Agilent, Regno Unito). L'amplificazione della libreria è stata eseguita con primer Nextera personalizzati.28 Le librerie sono state sequenziate dalla Biomedical Sequencing Facility presso CeMM utilizzando la piattaforma Illumina HiSeq 3000/4000 e la configurazione a lettura singola 50-bp.

Le letture sono state controllate per la qualità e tagliate da eventuali adattatori rimanenti. Le letture sono state quindi allineate al genoma del topo (Mm10) con Bowtie (versione 2.2.6) in modalità "locale sensibile". Le letture allineate sono state filtrate per rimuovere corrispondenze di bassa qualità (qualità della mappatura inferiore o uguale a 10) o letture mappate su sequenze mitocondriali. Le posizioni iniziali dell'allineamento sono state spostate in modo consapevole del filamento (4 bp, -5 bp, 28) prima della chiamata di picco con MACS2 (versione 2.1.129). Le regioni con legame differenziale sono state identificate con DiffBind (versione 2.4.830) con centratura del picco (vertice=100) e edgeR.31

L'analisi del percorso è stata quindi eseguita su picchi arricchiti in campioni diabetici (false discovery rate [FDR] inferiore o uguale a {{0}}.1) inserendo la posizione del cromosoma di picco nello strumento di arricchimento delle annotazioni delle regioni genomiche ( versione 3.0).32 Le regioni dei picchi differenziali sono state quindi analizzate con MEME-immunoprecipitazione della cromatina (ChIP; versione 4.12.0),33 che esegue un'analisi completa del motivo per identificare eventuali motivi di legame noti o sconosciuti che sono arricchiti (arricchiti motivi E<0.05; minimum width, 6; minimum number of sites, 3).

Fattore di trascrizione relativo al runt 1 Identificazione del target

MEME-ChIP delle regioni ATAC-seq ha identificato il fattore di trascrizione correlato a Runt 1 (RUNX1) come potenziale regolatore sia dell'IL-1 che delle HSC diabetiche non stimolate. MEME GOMo (versione 4.12.0)33 è stato utilizzato per eseguire la scansione di promotori di topi e umani (−1000, più 200) per il motivo di consenso RUNX1 (MA002.2). Oltre all'analisi dell'arricchimento di Gene Ontology, GOMo restituisce un elenco di geni identificati come bersagli. Questi successi erano limitati a promotori conservati legati sia nei topi che negli esseri umani con valori P empirici<0.05 or 0.01. Mouse Genome Informatics identifiers were converted to Mouse Ensembl identifications on the Mouse Genome Informatics website and then to Human Ensembl identification and gene symbol using the Ensembl BioMart interface. For values of P<0.05, 1300 target genes were converted, of which 1251 were represented on the arrays; for values of P<0.01, there were 355 converted and 347 on the arrays. The overrepresentation of RUNX1 target genes among the DE genes was assessed by the Fisher exact test as implemented in R. The heatmap package (version 1.0.8) was used to generate the heat maps, with row-normalized log2 values shown for DE genes. Both genes and samples were clustered by Pearson correlation.

Analisi dell'RNA-seq

Per l'analisi RNA-seq sono stati utilizzati BMDM di controllo o diabetici (n=6), coltivati ​​in 5 mmol/L e stimolati con LPS più IFN- per 6 ore o cellule di controllo non stimolate. In breve, l'RNA è stato isolato con il kit di isolamento mRNA/miRNA mirVana (ThermoFisher Scientific, Regno Unito), secondo le istruzioni del produttore. La quantità di RNA totale è stata quantificata con il sistema di quantificazione fluorometrica Qubit (Life Technologies) e il numero di integrità dell'RNA è stato determinato con il sistema di elettroforesi automatizzato Experion (Bio-Rad). Le librerie RNA-seq sono state preparate con il kit di preparazione del campione TruSeq Stranded mRNA LT (Illumina, Regno Unito) utilizzando sia la robotica per la gestione dei liquidi Sciclone che Zephyr (PerkinElmer, Regno Unito). Le concentrazioni della libreria sono state quantificate con il sistema di quantificazione fluorometrica Qubit (Life Technologies, Regno Unito) e la distribuzione delle dimensioni è stata valutata con il sistema di elettroforesi automatizzato Experion (Bio-Rad, Stati Uniti).

Per il sequenziamento, i campioni sono stati diluiti e raggruppati in quantità equimolari e sequenziati su strumenti Illumina HiSeq 3000/4000 in configurazione a lettura singola 50- bp dalla Biomedical Sequencing Facility presso CeMM. Le chiamate di base fornite dal software Illumina Real-Time Analysis sono state successivamente convertite in formato di mappa di allineamento binario (Illumina2bam) prima del demultiplexing (BamIndexDecoder) in singoli file di mappa di allineamento binario specifici del campione tramite gli strumenti Illumina2bam (1.17.3). Le librerie sono state preparate e sequenziate dalla Biomedical Sequencing Facility del CeMM.

Le letture sono state allineate al genoma del topo (GRCm38/ mm10) utilizzando STAR (versione 2.5.3a34) in modalità di conteggio genico (quantMode GeneCounts) con annotazioni Gencode (versione M16) (da cui è stata rimossa la mega trascrizione Gm20388 per evitare la sovrapposizione di geni intermedi). I conteggi sono stati caricati in R (versione 3.3.3) e analizzati con edgeR (versione 3.16.535) dopo aver rimosso le trascrizioni con<0.5 mapped reads per million sequenced in all samples (13568 transcripts retained). Genes with adjusted values of P<0.05 and fold change >1.5 sono stati considerati DE. Le tabelle DE e gli elenchi di geni sono inclusi come file Excel II nel supplemento dati (non stimolato) e file Excel III nel supplemento dati (LPS più IFN stimolato). La funzione edgeR cpm è stata utilizzata per normalizzare i conteggi (Excel File IV nel Data Supplement) per mappe di calore e altri grafici. Le mappe di calore sono state generate con la mappa di calore del pacchetto R (versione 1.0.836). La sovrarappresentazione dell'analisi dei geni target RUNX1 tra i geni DE nei diabetici rispetto ai campioni LPS di controllo più IFN- è stata eseguita come descritto in precedenza per i dati dell'array umano.

Sequenziamento del chip

Un totale di 1 × 106 cellule/mL è stato fissato con formaldeide all'1% a temperatura ambiente per 10 minuti, lavato con PBS e conservato a -80 gradi . Le cellule sono state tagliate con il kit Chromatin EasyShear – Low SDS (Diagenode, Belgio) e sonicate con un dispositivo di sonicazione Bioruptor Pico (numero di catalogo B01080010, Diagenode, Belgio) secondo le raccomandazioni del produttore. Il sistema di immunoprecipitazione della cromatina MAGnify (Thermo Scientific) è stato utilizzato per selezionare i frammenti di cromatina utilizzando l'anti-istone H3 (trimetil K4; ab8580) o l'anti-istone H3 (acetil K27; ab4729). Le librerie di sequenziamento sono state preparate con il kit di preparazione della libreria del DNA NEBNext Ultra II secondo le istruzioni del produttore. In breve, il ChIP purificato o il DNA di input è stato riparato all'estremità e con la coda A seguita dalla legatura dell'adattatore. Il DNA legato all'adattatore è stato selezionato in base alle dimensioni con perline SPRI Ampure XP (Agencourt) e arricchito con primer di sequenziamento compatibili con Illumina. Le librerie finali sono state purificate con sfere SPRI Ampure XP per rimuovere i dimeri dell'adattatore e sequenziate dalla Biomedical Sequencing Facility presso CeMM utilizzando la piattaforma Illumina HiSeq 3000/4000 e la configurazione a lettura singola 50-bp.

Bioinformatica

Per esaminare la relazione tra l'apertura della cromatina e l'espressione genica nei BMDM non stimolati, il diabete rispetto ai picchi ATAC-seq di controllo (cambiamenti di piega log2) e il livello di mRNA dei geni prossimi (cambiamenti di piega log2) sono stati confrontati mediante correlazione lineare di Pearson.

Le letture degli esperimenti ATAC-seq, H3K4me3 ChIP-sequencing (ChIPseq) e H3K27ac ChIP-seq sono state visualizzate in campioni rappresentativi utilizzando Integrative Genome Browser, con altezze delle tracce ridimensionate per esperimento e tipo di cella per tenere conto delle differenze sistematiche nella profondità di lettura.

Analisi statistica

Tutte le analisi statistiche dei dati non sequenziali sono state eseguite nel software GraphPad Prism. I dati sono stati analizzati per la distribuzione normale mediante il test di normalità di Shapiro-Wilk. I confronti tra i 2 gruppi sono stati calcolati mediante 2-tailed Student t-test o Mann-Whitney U test per dati distribuiti normalmente o non normalmente, rispettivamente. I confronti tra più gruppi sono stati calcolati mediante analisi ANOVA 1-way o 2-way con la correzione post hoc di Bonferroni. I dati sono riportati come media ± DS per dati distribuiti normalmente o mediana ± intervallo interquartile per dati distribuiti non normalmente. Diverse repliche e altri dettagli statistici possono essere trovati nelle legende delle figure. Sia per gli esperimenti in vivo che in vitro, n è il numero di singoli animali o singoli volontari o pazienti sani. I cambiamenti di piegatura sono calcolati come il valore medio della condizione di test diviso per il valore medio di controllo.

RISULTATI

L'iperglicemia diabetica altera il metabolismo cellulare, determinando l'espressione e la funzione genica proinfiammatoria

La glicolisi aerobica aumenta l'espressione genica proinfiammatoria (M1),37 e l'iperglicemia promuove anche l'espressione genica associata a M1-. .

L'analisi del metabolismo dei monociti umani primari ha indicato che un elevato livello di glucosio extracellulare (20 mmol/L) ha spostato il profilo metabolico rispetto alle condizioni di glucosio fisiologico corrispondente osmoticamente (5 mmol/L). L'analisi del percorso (Figura 1A) ha rivelato che il glucosio elevato ha determinato cambiamenti significativi nel ciclo dell'acido tricarbossilico (FDR, 0.002) e nel metabolismo del piruvato (FDR, 0,005), indicato da un aumento del succinato, malato ( Figura 1B), livelli di lattato e piruvato (Figura 1C), rispettivamente, con analisi di arricchimento del set di metaboliti (Figura 1D) che evidenziano l'effetto Warburg (FDR, 0,04).

Figura 1. Il glucosio alto altera il metabolismo cellulare. Un'analisi della via metabolica. Misurazioni individuali per (B) succinato, malato, (C) lattato e piruvato e (D) analisi di arricchimento del set di metaboliti (Metaboanalyst) per campioni di metabolomica di lisato cellulare di monociti umani (n=5). L'analisi del flusso extracellulare sui macrofagi derivati ​​dal midollo osseo di topo (bioanalizzatore Seahorse; n =6 singoli animali) ha misurato (E) il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) e (F) il tasso di consumo di ossigeno (OCR) in risposta a vari livelli di glucosio extracellulare, controllo osmotico (mannitolo) e iniezioni di inibitori metabolici. Il glucosio alto (G) ha aumentato la produzione di ATP glicolitico (glicoATP) e (H) ha diminuito l'indice di velocità di ATP (tasso di produzione di ATP mitocondriale/tasso di produzione di glicoATP), indicando uno spostamento verso un fenotipo più glicolitico. I dati sono stati analizzati mediante (B e C) 2-way ANOVA o (E–H) 1-way ANOVA più test post hoc di Bonferroni. Tutti i dati mostrati sono media ± DS. AU indica unità arbitrarie; FDR, tasso di false scoperte; e TCA, acido tricarbossilico. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

Un fenotipo più glicolitico (e meno ossidativo) in risposta a livelli elevati di glucosio (20 mmol/L) è stato confermato nei BMDM di topo, che hanno mostrato un aumento del tasso di acidificazione extracellulare, una maggiore produzione di ATP glicolitico (2- volte; P<0.01), decreased ATP rate index (by 56%; P<0.05; Figure 1E–1H), and increased glucose consumption and lactate production (P<0.001; Figure Ia and Ib in the Data Supplement). Cultured BMDMs also increased succinate levels in response to high extracellular glucose in both unstimulated (2.5-fold, P<0.05) and M1-stimulated states (1.9-fold; P<0.001; Figure Ic in the Data Supplement).

Questo aumento del tasso glicolitico è stato prevenuto dall'inibitore della glicolisi dicloroacetato (Figure Ia e Ib nel Data Supplement).

Nei BMDM, gli alti livelli di glucosio promuovevano entrambi l'espressione proinfiammatoria di Il{-6 associata a M1-(2.7-volte; P<0.001; Figure 2A) and suppressed M2-associated Ym1 (70%; P<0.001) and Fizz1 (42%; P<0.001) expression (Figures 2C and 2D). These bidirectional changes in gene expression were restored in the presence of dichloro-acetate (Figure 2A–2D) and 2-deoxy-d-glucose (Figure IIa–IId in the Data Supplement), together indicating that the proinflammatory effects of high extracellular glucose were mediated through changes in glycolysis and were not merely the result of nonspecific changes to overall metabolic activity.

Figura 2. Alti livelli di glucosio alterano l'espressione e la funzione genica dei macrofagi. M1 (lipopolisaccaride [LPS] più interferone- [IFN-] stimolato) macrofago derivato dal midollo osseo (BMDM) (A) Il-6 e (B) è l'espressione genica in presenza o assenza di dicloroacetato (DCA). Espressione genica M2 (interleuchina-4 stimolata) BMDM (C) Ym1 e (D) Fizz1. Da A a D, i dati della reazione a catena della polimerasi quantitativa sono normalizzati all'espressione B2m; n=7 a 10. E, Quantificazione dell'immagine dell'adesione dei monociti di topo alle cellule endoteliali (n=5). F, Quantificazione dell'immagine dell'assorbimento di lipoproteine ​​​​a bassa densità acetilate da parte dei BMDM, normalizzata per numero di cellule per immagine. Immagini di adesione statica rappresentative (G) di monociti di topo marcati con fluorescenza con PKH67- alle cellule endoteliali e (H) Oil Red O (ORO)– e immagini di cellule schiumose colorate con DAPI. Tutti i dati (A–H) sono mostrati come media±DS; (A–D) 1-way ANOVA o (E e F) 2-way ANOVA con l'analisi post hoc di Bonferroni. Ogni punto rappresenta un singolo animale (media di 4 immagini per l'adesione statica e la formazione di cellule schiumose). AU indica unità arbitrarie; NS non è significativo. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

Dati i suoi effetti sulla promozione dell'infiammazione, abbiamo quindi testato se l'alto glucosio extracellulare alterasse le funzioni dei monociti e dei macrofagi rilevanti per l'aterogenesi.<0.001; Figure 2E and 2G) and promoted BMDM uptake of modified LDL to form foam cells (4.1-fold [and 2.7-fold when M1 stimulated]; P<0.001 for both; Figure 2F and 2H). The effects on monocyte adhesion were negated entirely by inhibition of glycolysis with dichloroacetate (P<0.001; Figure 2E and 2G) and 2-deoxy-glucose (P<0.001; Figure IIe in the Data Supplement), whereas foam cell formation, was decreased by 30% (and by 42% when M1-stimulated; P<0.001 for both; Figure 2F and 2H).

Le cellule derivate da BM da topi diabetici mostrano un'immunità addestrata indotta dall'iperglicemia

Successivamente abbiamo utilizzato un modello murino di diabete per verificare se i cambiamenti proinfiammatori persistenti indotti dall'iperglicemia nei macrofagi, anche dopo la normalizzazione del glucosio. Abbiamo ottenuto BM da topi di controllo non diabetici, di pari età e da topi diabetici singenici in cui l'iperglicemia era stata indotta dalla streptozotocina e mantenuta per 6 settimane in vivo (Figura IIIa-IIId nel supplemento dati). Le cellule sono state differenziate in BMDM sotto glucosio fisiologico (5 mmol/L; Figura 3A). Dopo la stimolazione, i BMDM di origine murina diabetica hanno mostrato un'espressione del gene Il-6 associata a M1- migliorata (4.1-volte; P<0.0001; Figure 3B) and, with IL-4 treatment, decreased M2-associated Ym1 expression (by 75%; P=0.0003) and Fizz1 (by 70%; P=0.0326; Figure 3D and 3E). RNA-seq analysis of control and diabetic BMDMs revealed clear delineation based on gene expression profiles, which was further accentuated by LPS and IFN-γ stimulation (Figure 3F). Indeed, when expression levels of a panel of 39 previously identified M1- and M2-associated genes were examined,9 BMDMs from control and diabetic origin showed clear segregation after LPS+IFN-γ stimulation (Figure 3G).

Figura 3. I macrofagi derivati ​​dal midollo osseo (BM) (BMDM) di topi diabetici manifestano una memoria iperglicemica nell'espressione genica. A, Schema del protocollo BMDM diabetico e di controllo (n=10–12). Analisi dell'espressione genica M1 di (B) Il-6 (P<0.0001) and (C) is. M2 (D) Ym1 (P=0.0003) and (E) Fizz1 (P=0.0326) gene expression. B through E, All quantitative polymerase chain reaction data are normalized to B2m expression and analyzed by the unpaired t-test. F, Principal component (PC) analysis of all control and diabetic BMDM RNA sequencing (RNA-seq) transcript reads (n=6); percent indicates sample variability. G, Unsupervised hierarchical clustering shows marked segregation of 39 previously identified M1 and M2 macrophage marker genes in lipopolysaccharide (LPS)+interferon-γ (IFN-γ)–stimulated BMDMs from diabetic or control origin (RNA-seq analysis). IL indicates interleukin.

Inoltre, c'era una maggiore adesione all'endotelio attivato (di 6.3-volte; P<0.05; and by 9.4-fold when LPS-stimulated; P<0.001; Figure 4A and 4C) and enhanced modified LDL uptake and foam cell formation (LPS stimulated, 1.6-fold; P<0.01; Figure 4B and 4D). This array of persistently heightened responses was indicative of hyperglycemia-induced trained immunity.

Figura 4. I macrofagi derivati ​​dal midollo osseo (BMDM) di topi diabetici mostrano funzioni alterate nonostante la normalizzazione del glucosio. I BMDM dei topi diabetici sono stati differenziati in 5 mmol/L (n=5–8). A, Quantificazione dell'immagine dell'adesione BMDM alle cellule endoteliali (n=8). B, Quantificazione dell'immagine dell'assorbimento di lipoproteine ​​​​a bassa densità acetilate da parte dei BMDM, normalizzata per numero di cellule per immagine. Rappresentanti (C) immagini di adesione statica di BMDM marcati con fluorescenza (PKH67) alle cellule endoteliali e (D) Oil Red O (ORO)– e immagini di cellule schiumose colorate con DAPI. Tutti i dati sono mostrati come media ± SD e ogni punto rappresenta un singolo animale (media di 4 immagini per l'adesione statica e la formazione di cellule schiumose). I dati sono stati analizzati mediante 2-way ANOVA con il test post hoc di Bonferroni. IFN- indica interferone-; e LPS, lipopolisaccaride. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

L'immunità addestrata indotta dall'iperglicemia guida l'aterosclerosi

Pertanto, per testare il significato funzionale dell'immunità allenata indotta dall'iperglicemia nell'aterosclerosi, abbiamo trapiantato BM da topi con controllo normoglicemico o topi donatori diabetici indotti da streptozotocina (glicemia, 33,9 ± 6,9 mmol/L) in Ldlr-/ − topi riceventi (Figura 5A). In ogni caso, i topi donatori erano transgenici per GFP sotto il controllo del promotore CD68 umano.40 L'attecchimento efficace ed equivalente è stato dimostrato dall'analisi citometrica a flusso delle PBMC, confermando la presenza di cellule CD45 più GFP più positive per CD11b o Ly6C ( Figura IVa e IVb nel supplemento dati). Dopo 12 settimane di dieta di tipo occidentale, non sono state rilevate differenze nelle misurazioni dei lipidi nel sangue (Figura IVc e IVd nel supplemento dati) o nei sottoinsiemi di leucociti valutati mediante citometria a flusso (figura IVe nel supplemento dati).

I topi che avevano ricevuto BM diabetico hanno mostrato un marcato aumento dell'aterosclerosi, con una maggioranza che presentava un carico di aterosclerosi superiore a quello maggiore nei riceventi non diabetici (aree di placca mediane, 44461 µm2 [intervallo interquartile, 18368-59597 µm2] rispetto a 79809 µm2 [44745-177740 µm2] ; Mann-Whitney, P=0.036). Questi topi hanno anche mostrato un aumento del contenuto di macrofagi delle placche (P=0.052; Figura V nel supplemento dati), area centrale necrotica ricca di lipidi (2.8-volte, P{{18 }}.0076; Figura VIa nel supplemento dati) e proporzione nucleo necrotico ricco di lipidi (2.4-volte, P=0.046; Figura VIb nel supplemento dati), ma senza differenze nel contenuto di collagene (percentuale di placca; Figure VIc e VId nel Supplemento ai dati) o cellule muscolari lisce (percentuale di placca; Figure VIe e VIf nel Supplemento ai dati).

L'immunità addestrata indotta dall'iperglicemia negli HSC è guidata dai cambiamenti nel metabolismo che portano alla riprogrammazione epigenetica

Data la dimostrazione che la BM da topi iperglicemici ha promosso l'aterosclerosi, insieme alla persistente espressione genica proinfiammatoria e alle risposte funzionali trovate nella BMDM in vitro, abbiamo pensato che questa memoria fosse una manifestazione dell'immunità allenata nelle cellule derivate dalla BM. L'immunità addestrata è stata associata ad alterazioni del metabolismo cellulare che inducono segni epigenetici di lunga durata che alterano la cromatina come H3K4me3 e H3K27ac.17,18,41 , cellule B, cellule natural killer, cellule dendritiche, monociti, granulociti, cellule eritroidi: CD3−, CD4−, B220−, Ter119, Gr1− coltivate in condizioni di elevato glucosio extracellulare hanno anche mostrato un aumento dell'assorbimento di glucosio e della produzione di lattato, indicando una glicolisi disregolata (P<0.001; Figure VIIa–VIId in the Data Supplement), and both H3K4me3 and H3K27ac modifications were increased (Figure VIIIa–VIIIf in the Data Supplement). In the case of H3K4me3 (but not H3K27Ac), this effect was negated with dichloroacetate inhibition (Figure VIIIa, VIIIc, and VIIId in the Data Supplement). These chromatin marks were also consistently increased in HSCs from diabetic mice compared with control HSCs and remained heightened after differentiation into BMDMs using physiological glucose levels (5 mmol/L; Figure VIIIb, VIIIe, and VIIIf in the Data Supplement).

Nelle placche della radice aortica, la proporzione di nuclei associati ai macrofagi colorati positivamente per H3K4me3 era più alta nei topi che avevano ricevuto BM da donatori diabetici (1.8- volte, P<0.05) compared with control donors (Figure 5E and 5F), which is in line with the corresponding analysis of BMDM in vitro experiments (Figure VIIIb and VIIIe in the Data Supplement). These data point to a direct causal link between increased glycolytic rate and the development of hyperglycemia-induced trained immunity. In addition to metabolic mediators,17,18 recent work has implicated the inflammatory cytokine IL-1β in the development of trained immunity.42 This is particularly relevant because IL-1β has been identified in diabetes43 as an important driver of atherosclerosis and in obesity in which adipose tissue macrophage-produced IL-1β induces the proliferation of BM progenitors.44,45 Therefore, we hypothesized that IL-1β and hyperglycemia may work synergistically to induce atherosclerosis-relevant epigenetic changes that alter chromatin structure. To interrogate chromatin accessibility, we performed an assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) on HSCs from diabetic or control mice, both with and without IL-1β stimulation28 (sample processing summarized in Excel File V in the Data Supplement). HSCs from a diabetic origin showed differential chromatin profiles (summarized in Excel File VI in the Data Supplement) in response to IL-1β exposure, with 530 differential peaks (FDR ≤0.1) of which 50% exhibited increased accessibility in diabetic cells. 

Figura 5. Il midollo osseo diabetico (BM) guida l'aterosclerosi nonostante la prolungata normalizzazione del glucosio. A, Schema dell'esperimento di trapianto di BM. B, Analisi citofluorimetrica delle popolazioni di leucociti periferici nei topi dopo 12 settimane di trapianto di midollo osseo. C, Immagini rappresentative della radice aortica di topi Ldlr-/- che avevano ricevuto un donatore diabetico o un donatore di controllo CD 68- GFP BM. Colorazione Masson Trichrome (a sinistra) e colorazione con immunofluorescenza per i macrofagi derivati ​​dal trapianto di BM (il verde indica la proteina fluorescente verde [GFP]) o tutti i macrofagi (il rosso indica la galectina -3 [GAL3]). Quantificazione dell'immagine del volume della placca (D) (P=0.036). Dati mostrati come media±SD, analizzati mediante 1-way ANOVA con test post hoc di Bonferroni (B), o intervallo mediano±interquartile, analizzati mediante test U di Mann-Whitney (D); controllo n=6, diabetico n=9. E, Immagini rappresentative della radice aortica di topi Ldlr-/- che avevano ricevuto trapianto di BM diabetico o di controllo. F, Quantificazione della percentuale di nuclei colorati positivi per H3K4me3 o H3K27ac all'interno della regione positiva del macrofago GAL3. Ogni punto dati rappresenta un singolo animale (media, 6 sezioni; da n= 7 a 10). Mostrato come media ± DS. Analisi ANOVA unidirezionale. BMDM indica macrofagi derivati ​​da BM; HSC, cellula staminale ematopoietica; IFN-, interferone-; e LPS, lipopolisaccaride. *P<0.05.

Per esplorare la rilevanza biologica di questo insieme di regioni genomiche non codificanti (con enfasi sulla presunta funzione di regolazione cis), le regioni della cromatina con maggiore accessibilità nelle cellule diabetiche sono state assegnate ai 2 geni più vicini (entro 10{{ 11}}0 kb) e analizzato con lo strumento Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool.33 Questa analisi del percorso ha rivelato l'aumento di diversi percorsi correlati all'infiammazione, inclusa l'attivazione dei leucociti (3.3-volte; FDR, 0,0005 ) e geni associati alla tolleranza LPS nei macrofagi (2.7-volte; FDR, 0.0009). Per capire se il glucosio elevato in isolamento potesse anche indurre la modifica della cromatina, abbiamo utilizzato ATAC-seq per esaminare le HSC di topi di controllo e diabetici in assenza di stimolazione IL-1. Le HSC non stimolate hanno mostrato 357 picchi differenziali (FDR inferiore o uguale a 0,2), di cui il 51% aveva una maggiore accessibilità nelle cellule di origine diabetica rispetto al controllo, con la maggior parte nelle regioni introniche (48%) o intergeniche (21%).

Alla luce di questi risultati negli HSC, abbiamo successivamente esaminato l'accessibilità della cromatina e l'espressione genica nei loro BMDM derivati. Abbiamo eseguito ATAC-seq e RNA-seq su BMDM da topi di controllo e diabetici in condizioni non stimolate o stimolate proinfiammatorie (LPS più IFN-). I BMDM di topi diabetici hanno mostrato un'accessibilità differenziale della cromatina in condizioni non stimolate, con 1047 regioni differenziali (FDR<0.05; Figure 6A) but only 40 differentially open regions (FDR <0.05) after stimulation (Figure 6B). In contrast, unstimulated BMDMs from diabetic mice differentially express 632 genes (324 upregulated expression and 308 downregulated expression; Excel File II in the Data Supplement) compared with unstimulated control BMDMs, but this increases to 1348 genes (802 increased and 546 decreased; Excel File III in the Data Supplement) on stimulation (FDR <0.05; fold change >1.5). Presi insieme, i dati ATAC-seq e RNAseq suggeriscono che il diabete ha innescato i macrofagi per una risposta esagerata allo stimolo proinfiammatorio.

Figura 6. Il diabete altera i livelli di H3K4me3 e H3K27ac e l'accessibilità della cromatina. Grafico MA di tutti i saggi per il sequenziamento della cromatina accessibile alla trasposasi La cromatina si legge in (A) macrofagi derivati ​​dal midollo osseo (BMDM) non stimolati o (B) stimolati, dove picchi con accessibilità differenziale (falso tasso di scoperta<0.05, fold change >1.5) sono evidenziati in rosa (1047 non stimolati, 40 stimolati, n=6). C, Regioni variabili di H3K4me3 e H3K27ac quantificate mediante sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina in cellule staminali ematopoietiche (HSC) e BMDM da topi di controllo rispetto a topi diabetici (n=6 per gruppo). D, Istogramma della copertura media di H3K27ac e K3K4me3 in HSC, BMDM non stimolati e BMDM stimolati proinfiammatori (lipopolisaccaride [LPS] più interferone- [IFN]) nei siti di inizio della trascrizione ± 1 kb di geni codificanti proteine ​​​​prossimi alle regioni di aumento accessibilità nei BMDM non stimolati (rispetto ai controlli; n=405) e rispetto ai livelli di fondo nelle regioni non selezionate.

We further undertook an unbiased examination of the relationship between differential gene expression and altered chromatin accessibility in the diabetic BMDMs. We annotated the nearest or overlapping gene for each region of differentially accessible chromatin in BMDMs (M0 state) from diabetic mice versus controls. For genes within this set that were also DE (cutoff FDR, 0.1; log fold change >0.5 per ciascuno), abbiamo confrontato la variazione di piega per il picco ATAC-seq differenziale rispetto alla variazione di piega per DE. Esaminate come variabili continue, c'era una forte correlazione tra le alterazioni della cromatina e l'espressione dei geni prossimi (R=0.65; P<1×10−6).

Furthermore, to ascertain the nature of diabetes-induced chromatin modifications, we undertook ChIPseq in HSCs and BMDMs from control versus diabetic mice (n=6 per group). Diabetic HSCs and BMDMs were distinguishable from control samples based on the quantification of both H3K27ac and H3K4me3 histone modifications (Figure 6C), and we confirmed these results by Western blot analysis (Figure VIII in the Data Supplement). To integrate the ChIP-seq and ATACseq data, we examined the distribution of H3K4me3 and H3K27ac histone modifications in the regions of open chromatin that were identified by ATACseq in unstimulated diabetic BMDMs. A majority of these regions were identified as enhancers, located >1 kb dai siti di inizio della trascrizione annotata. Ci siamo concentrati sui geni in prossimità di questi potenziatori perché le loro regioni del promotore genico (siti di inizio della trascrizione ± 1 kb) rappresentano gli obiettivi normativi più probabili. ATAC-seq aveva identificato 405 regioni di cromatina differenzialmente aperta (P<0.05) in BMDMs derived from diabetic mice versus control mice under basal conditions. In the HSCs from diabetic mice, there was a marked increase in promoter-associated H3K27ac compared with control HSCs (Figure 6D). 

Figura 6. Il diabete altera i livelli di H3K4me3 e H3K27ac e l'accessibilità della cromatina. Grafico MA di tutti i saggi per il sequenziamento della cromatina accessibile alla trasposasi La cromatina si legge in (A) macrofagi derivati ​​dal midollo osseo (BMDM) non stimolati o (B) stimolati, dove picchi con accessibilità differenziale (falso tasso di scoperta<0.05, fold change >1.5) sono evidenziati in rosa (1047 non stimolati, 40 stimolati, n=6). C, Regioni variabili di H3K4me3 e H3K27ac quantificate mediante sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina in cellule staminali ematopoietiche (HSC) e BMDM da topi di controllo rispetto a topi diabetici (n=6 per gruppo). D, Istogramma della copertura media di H3K27ac e K3K4me3 in HSC, BMDM non stimolati e BMDM stimolati proinfiammatori (lipopolisaccaride [LPS] più interferone- [IFN]) nei siti di inizio della trascrizione ± 1 kb di geni codificanti proteine ​​​​prossimi alle regioni di aumento accessibilità nei BMDM non stimolati (rispetto ai controlli; n=405) e rispetto ai livelli di fondo nelle regioni non selezionate.

Queste differenze sono diminuite nei BMDM (Figura 6D), in parte a causa dell'aumento di H3K27ac nelle cellule di origine non diabetica dopo la differenziazione. Tuttavia, il segno H3K4me3 è stato aumentato a questi promotori in HSC, con differenze identificabili persistenti nei macrofagi differenziati, anche dopo la stimolazione delle citochine (Figura 6D). Questo modello di segni H3K27ac transitori e H3K4me3 persistenti è coerente con i nostri risultati sia nella coltura tissutale (Figura VIII nel supplemento dati) sia nell'immunoistochimica nei macrofagi della placca di topo (Figura 5E e 5F).

Le aree di cromatina differenzialmente aperta identificate da ATAC-seq erano altamente significativamente associate ai cambiamenti nella trascrizione dei geni prossimi. Inoltre, la quantificazione della differenza nell'accessibilità della cromatina (diabete rispetto al controllo) e il confronto diretto con il cambiamento nei livelli di espressione dell'mRNA del gene prossimo erano altamente correlati (R=0.5; P=6.2e -15; Figura 7A). Per esaminare questi effetti in loci genomici rilevanti, abbiamo combinato i dati ATAC-seq, H3K4me3 ChIP-seq e H3K27ac ChIP-seq sui promotori di 2 geni precedentemente implicati nell'immunità addestrata indotta dalla glicolisi e con prodotti coinvolti nella guida dell'infiammazione (Il -6) e il metabolismo del glucosio (Hk1). Questi geni hanno mostrato regioni di cromatina accessibile nei siti di inizio della trascrizione, con picchi H3K4me3 e H3K27ac associati in questi loci genomici (Figura 7B).

Per ottenere informazioni su quali fattori di trascrizione potrebbero essere implicati come mediatori di questo modello di immunità allenata indotta dall'iperglicemia, è stata eseguita l'analisi dell'arricchimento del motivo33 su regioni della cromatina con maggiore accessibilità in condizioni diabetiche. I motivi del fattore di trascrizione significativamente arricchiti includevano in particolare RUNX1 (FDR, 0.0001), che è stato precedentemente associato alla memoria immunologica,46 così come PU.1 (FDR, 0.04) e legame CCCTC fattore (FDR, 1,8 × 10-7; Figura 8A). Avendo implicato il fattore di trascrizione RUNX147 basato sull'accessibilità dei motivi di legame, abbiamo studiato se i geni bersaglio RUNX1 fossero significativamente sovrarappresentati tra i geni DE in LPS più BMDM stimolati da IFN. Questa analisi ha identificato 95 dei 1348 geni DE come target RUNX1 (P<0.05; odds ratio, 1.3; RUNX1 binding site P<0.05; Figure 8B and full differential gene list with RUNX1 target genes marked in Excel File VII in the Data Supplement), confirming its relevance in these disease-modifying cells. To test for RUNX1 involvement in human disease, we interrogated the gene expression of macrophages obtained from carotid atherosclerotic plaques of patients with or without diabetes (Excel File I in the Data Supplement). LCM was used to isolate macrophages from human carotid atherosclerosis plaques in patients undergoing clinically driven endarterectomy. Figure 8C shows the DE genes between diabetic and nondiabetic plaque macrophages (FDR <0.2) and highlights in red the RUNX1-associated genes (further detailed in Figure IX in the Data Supplement). RUNX1 target genes were significantly overrepresented among the DE genes, even more so when target binding sites were more stringently restricted: At a binding site P<0.05, 12 of 106 DE genes were among the 1251 RUNX1 targets (P=0.03; odds ratio, 2.0). These target genes include diabetes-induced DE of atherosclerosis-relevant genes such as Traf3ip3 (log fold change, 0.56; FDR, 0.02),48 Crnkl1 (log fold change, 0.63; FDR, 0.04),49 and Pla2g5 (log fold change, 0.16; FDR, 0.1).50

Per stabilire se il profilo funzionale dei macrofagi della placca umana corrispondesse a quello dei macrofagi di topo, lo abbiamo confrontato con l'insieme di 39 geni M1 e M2 con un'espressione che era stata misurata in BMDM stimolati da topi diabetici rispetto a quelli di controllo (Figura 3G). Questi sono stati riassunti dalla variazione logaritmica positiva o negativa (diabetico rispetto al controllo) e confrontati con i cambiamenti equivalenti nei macrofagi della placca umana dei pazienti con diabete di tipo 2 (rispetto al controllo). Un test esatto di Fisher ha mostrato una relazione significativa tra il BMDM del topo e i set di dati dei macrofagi della placca umana per i geni sovraregolati o sottoregolati nei soggetti diabetici rispetto ai soggetti di controllo (P=0.0155; odds ratio, 6,83).

Having shown a hyperglycemia-induced trained immunity phenotype in mouse HSCs and BMDMs and confirmed shared transcriptional features with macrophages from human plaques, we hypothesized that circulating human blood cells from patients with diabetes might also show evidence of priming. We obtained PBMCs from patients with type 2 diabetes and control subjects without diabetes matched for age and body mass index (Figure X in the Data Supplement). After isolation, PBMCs were restored to normal glucose conditions (5 mmol/L) in tissue culture for 24 hours. Comparing transcriptomes in basal conditions and after stimulation with LPS+IFN-γ, we found that the cells derived from patients with diabetes showed DE of >3000 geni confrontati con i controlli non diabetici abbinati. L'analisi dell'arricchimento del set genico di geni alterati ha mostrato un arricchimento positivo nei PBMC diabetici stimolati (rispetto ai controlli) per i percorsi Hallmark, inclusa la risposta infiammatoria (P=1.70×10−5) e la segnalazione IL-6 JAK STAT3 ( P=0.0221) e Reactome pathways, compresa la produzione di specie reattive dell'ossigeno e di specie reattive dell'azoto (P=0.0049), segnalazione IL- /IL- (P=0.0110) , e recettore Toll-like 1/2 cascata (P=0.0033). Questi percorsi dimostrano che queste cellule periferiche hanno anche mostrato caratteristiche di innesco simili a quelle che riportiamo nei BMDM da topi diabetici (Figura 3G).

Infine, per esplorare ulteriormente un possibile ruolo causale per RUNX1 nelle risposte immunitarie addestrate indotte dall'iperglicemia, i BMDM che erano stati precedentemente differenziati in glucosio fisiologico o elevato sono stati ripristinati a 5 mmol/L di glucosio e quindi stimolati in assenza o presenza del RUNX farmacologico 1-inibitore specifico Ro5-333551 (Figura 8D). Le cellule differenziate in glucosio elevato hanno mostrato una maggiore espressione di Il-6 (2-volte, P<0.001) and Il-1β (2.1-fold, P<0.001), despite normalization of glucose levels (Figure 8E and 8F and Figure XIb and XIc n the Data Supplement). Ro5-3335 normalized heightened Il-6 and Il-1β expression in a dose-dependent manner (Figure 8E and 8F), with the starting effective dose (0.5 µmol/L) being equal to the Ro5-3335 IC50 value.52

Figura 8. Un ruolo per l'immunità allenata indotta dall'iperglicemia RUNX1. I 3 principali motivi del fattore di trascrizione identificati in un test per i picchi di sequenziamento della cromatina accessibile alla trasposasi (ATAC-seq) differenzialmente arricchiti (A) HSC diabetici non stimolati (n=3) rispetto alle cellule staminali ematopoietiche (HSC) di controllo non stimolate; n{{6 }}). Raggruppamento gerarchico senza supervisione di geni espressi in modo differenziato dall'analisi del sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) di (B) diabetici (n=6) ​​o controllo (n=6) macrofagi derivati ​​dal midollo osseo (BM) (BMDM) stimolato con lipopolisaccaride (LPS) più interferone- (IFN-). Raggruppamento gerarchico non supervisionato di geni espressi in modo differenziato da campioni di macrofagi di placca carotidea umana (C) diabetica (n=8) o di controllo (n=16) cattura laser microdissezionati. B e C, geni bersaglio del fattore di trascrizione correlato a Runt 1 (Runx1) (RUNX1) (P<0.05 stringency) are highlighted in red to the left of the heat map. Wild-type (WT) BM was differentiated into BMDMs in physiological (5 mmol/L) or high (20 mmol/L) glucose, rested for 2 days in 5 mmol/L glucose, and then stimulated in 5 mmol/L glucose±varying concentrations of Ro5-3335, (D) as illustrated. M1 gene expression of (E) Il-6 and (F) Il-1β assessed by quantitative polymerase chain reaction; data normalized to B2m expression. Data displayed as mean±SD, 2-way ANOVA with Bonferroni post hoc. Sample n=5 individual animals. FC indicates fold change. *P<0.05; ***P<0.001.

DISCUSSIONE

Alti tassi di complicanze cardiovascolari persistono nei pazienti con diabete nonostante il controllo intensivo del glucosio.52 Qui, forniamo la prova che l'iperglicemia induce l'immunità allenata nelle HSC e nei macrofagi e che questo aggrava notevolmente l'aterosclerosi. Mostriamo che l'iperglicemia induce modifiche persistenti nelle HSC BM guidando la glicolisi aerobica, portando a particolari modelli di accessibilità della cromatina, con evidenza di uno stato di innesco proinfiammatorio che persiste nei macrofagi differenziati. I nostri risultati implicano fattori di trascrizione, in particolare RUNX1, come mediatori dell'immunità addestrata. L'inibizione farmacologica di RUNX1 ha rimosso queste manifestazioni di immunità addestrata indotta da iperglicemia in vitro.

I cambiamenti nel metabolismo cellulare possono indurre immunità allenata, un termine che denota la memoria immunitaria innata che può svilupparsi dopo una breve stimolazione con prodotti microbici o sostanze aterogeniche endogene, comprese le LDL ossidate e la lipoproteina(a).53 Ad esempio, l'immunità allenata indotta da -glucano , un componente della parete cellulare di Candida albicans, è mediato dall'attivazione della via dectin-1–Akt–mTOR–HIF-1, che provoca il passaggio dalla fosforilazione ossidativa alla glicolisi aerobica (effetto Warburg). 18 In effetti, diversi metaboliti della glicolisi e del ciclo dell'acido tricarbossilico agiscono come cofattori per gli enzimi che modificano gli istoni, che a loro volta determinano l'accessibilità della cromatina; per esempio, l'istone acetiltransferasi e le deacetilasi richiedono acetil-CoA e NAD plus, mentre le demetilasi come Tet e JmjC usano -chetoglutarato come cofattore.19,54 Recentemente, la regolazione metabolica dell'espressione del gene infiammatorio dei macrofagi è stata direttamente collegata alla modifica dell'istone acetilazione derivata dall'aumento dei livelli di lattato.55

I collegamenti diretti tra il metabolismo del glucosio e le modificazioni epigenetiche, insieme alle osservazioni che suggeriscono una memoria iperglicemica nei pazienti con diabete, ci hanno portato all'ipotesi che l'iperglicemia stessa possa guidare i cambiamenti nel metabolismo cellulare, portando alla memoria immunitaria innata nel diabete. Nel caso del -glucano, l'aumento della glicolisi aerobica nei macrofagi ha provocato un aumento della trimetilazione dell'istone 3 Lys4 (H3K4me3) e dell'acetilazione dell'istone 3 Lys27 (H3K27ac). Entrambi questi marcatori di modifica della cromatina sono stati aumentati nel contesto di un'elevata glicolisi guidata dal glucosio. Come dimostrato qui e in studi precedenti, vi era un arricchimento di H3K4me3 sui promotori dei geni correlati all'infiammazione (ad es. Il-6) e al metabolismo del glucosio (ad es. Hk1).16,17 Gli intermedi del ciclo degli acidi tricarbossilici succinato e si dice che il fumarato agisca come antagonista dell'istone e delle DNA demetilasi,54 e coerentemente con questo, abbiamo anche scoperto che i metaboliti del ciclo dell'acido tricarbossilico succinato e malato sono aumentati nelle cellule iperglicemiche.

Metropolis et al.20 hanno dimostrato che, nel contesto dell'immunità innata indotta da -glucano nei progenitori delle cellule mieloidi, le citochine possono mediare l'immunità allenata. Nello specifico, l'inibizione dell'IL-1 con l'antagonista del recettore anakinra ha inibito l'immunità allenata indotta da -glucano. È stato anche dimostrato che la dieta occidentale induce la riprogrammazione epigenetica nelle cellule progenitrici della BM, portando a un'immunità addestrata mediata dall'inflammasoma, implicando le vie di segnalazione dell'IL-1 nell'immunità addestrata.56 Dato che l'IL-1 media molteplici processi patologici nel diabete,44 abbiamo esaminato se IL-1 aumentasse gli effetti del glucosio elevato nello sviluppo dell'immunità allenata. Sebbene il diabete da solo abbia mostrato effetti sull'accessibilità della cromatina (con l'analisi del motivo che implica PU.1, RUNX1 e il fattore di legame CCCTC), gli effetti di IL-1 , nel contesto delle cellule che erano state innescate dal diabete, erano ancora più pronunciati ( e ERG implicato, ZNF263 [proteina 263 del dito di zinco] e RUNX1). Ciò suggerisce una relazione gerarchica in cui i macrofagi sono stati innescati dall'iperglicemia ma manifestano cambiamenti più floridi in risposta a un secondo stimolo.43 In effetti, è ben noto che i cambiamenti negli stati della cromatina nei promotori possono essere alla base di complesse interazioni funzionali tra diversi stimoli che attivano i macrofagi. Ad esempio, sebbene l'IFN- non sia in grado di attivare molti geni inducibili dall'LPS, può indurre l'acetilazione dell'istone e il rimodellamento della cromatina nei loro promotori, preparando così la cellula per l'attivazione futura in risposta all'LPS.57

L'analisi del motivo nei siti di cromatina aperta ha rilevato un arricchimento nei siti di legame RUNX1. Da un punto di vista funzionale, RUNX1 è necessario per la generazione e il mantenimento di HSC e la differenziazione di diversi lignaggi.58 Nei monociti e nei macrofagi, RUNX1 coopera con PU.1 (anche qui implicato) per regolare il fattore stimolante le colonie di macrofagi (fattore stimolante le colonie recettore -1), che è essenziale per la sopravvivenza, la differenziazione e l'espansione dei macrofagi. regolazione dell'antigene 1/CD11a associato alla funzione dei linfociti.31 Infine, l'infiammazione mediata dal recettore Toll-like 4 e la sovraespressione di RUNX1 aumentano la produzione di IL-6 e IL-1 indotte dal recettore Toll-like 4 attraverso RUNX1 si lega alla subunità p50 del fattore nucleare-κB, sinergizzando come coattivatore trascrizionale.60 Nel loro insieme, ci sono prove di una forte convergenza della funzione RUNX1 nei macrofagi verso i processi di regolazione che sono importanti nell'aterogenesi.

Pertanto, abbiamo incrociato i geni sotto il presunto controllo di RUNX1 con i profili trascrizionali delle cellule derivate da BMDM di topo e nei macrofagi da un ambiente umano in vivo pertinente. I macrofagi della placca aterosclerotica umana e i BMDM, in presenza di diabete, hanno mostrato DE di geni regolati da RUNX1-, inclusi diversi precedentemente collegati all'infiammazione e all'aterosclerosi.49,50 Il nostro lavoro estende quello di Alrdahe e colleghi,61 che hanno recentemente mostrato che i macrofagi umani derivati ​​​​dal diabete coltivati ​​​​per 6 giorni in vitro mantengono il priming proinfiammatorio e iperpolarizzano a un fenotipo proinfiammatorio quando stimolati con LPS e IFN- o fattore di necrosi tumorale- .

È interessante notare che alcuni di questi geni bersaglio RUNX1 mostrano una maggiore espressione nei macrofagi della placca di pazienti con diabete, vale a dire CRNKL1 e PLA2G5, mentre altri, come ZNF32 (proteina del dito di zinco 32) e NUP214 (nucleoporina 214), hanno mostrato un'espressione inferiore nei diabetici rispetto ai non diabetici macrofagi a placca. Sebbene ciò possa sembrare superficialmente incoerente, è stato dimostrato che RUNX1 promuove l'espressione genica e agisce come repressore trascrizionale.62 Ciò si verifica principalmente attraverso il reclutamento di istone deacetilasi come HDAC1 e HDAC663 e istone metiltransferasi.62 Inoltre, le interazioni fisiche di RUNX1 con la cromatina può contribuire all'identità della progenie cellulare. Ad esempio, l'interruzione dell'interazione RUNX1 durante la mitosi porta alla transizione epiteliale-mesenchimale.64 L'inibizione farmacologica di RUNX1 con Ro5-3335 ha normalizzato l'espressione genica infiammatoria alterata associata all'immunità allenata indotta da iperglicemia in vitro. L'intervento mirato contro RUNX1 fornisce ulteriori prove del coinvolgimento di RUNX1 negli effetti a valle dell'immunità addestrata indotta dall'iperglicemia nei macrofagi.

L'induzione dell'immunità allenata indotta dall'iperglicemia nei macrofagi periferici da sola potrebbe aver guidato la progressione della malattia, ma dati gli effetti a lungo termine dell'immunità allenata e la durata di vita relativamente breve delle cellule mieloidi periferiche, abbiamo pensato che anche l'immunità allenata fosse probabilmente stata indotta a livello di HSC, come è stato recentemente dimostrato per il -glucano e la dieta di tipo occidentale.20 Sebbene studi precedenti abbiano tipicamente correlato i cambiamenti epigenetici nell'immunità allenata a un fenotipo in vitro (ad esempio, produzione di citochine), mostriamo come l'immunità allenata direttamente guida la progressione dell'aterosclerosi, una patologia importante con una componente infiammatoria integrale. Il trapianto di BM da topi diabetici a topi normoglicemici inclini all'aterosclerosi ha avuto effetti marcati sulla progressione della lesione ed è stato associato ad un aumento del nucleo necrotico ricco di lipidi, coerente con la forma aggressiva di aterosclerosi osservata nel diabete negli esseri umani.65

Questo studio si basa su un esame degli effetti dell'alto livello di glucosio/iperglicemia. Per permetterci di caratterizzare gli effetti a lungo termine dell'iperglicemia, le caratteristiche cardinali del diabete, abbiamo usato il modello murino di diabete streptozotocina piuttosto che un modello murino di diabete di tipo 2, che avrebbe potuto incorporare caratteristiche più sfumate di quella sindrome ma avrebbe effettivamente confuso studi sugli effetti del glucosio. Esistono differenze materialmente importanti tra il diabete di tipo 1 e quello di tipo 2. Tuttavia, l'iperglicemia è comune alla loro diagnosi, determina il rischio cardiovascolare in ciascuno di essi ed è stata per molti anni l'obiettivo principale dei trattamenti e del monitoraggio per entrambi i tipi di diabete. Ci aspettiamo che l'immunità allenata indotta dall'iperglicemia appena identificata qui riportata venga elaborata in futuro per tenere conto di una modulazione più specifica su molte altre potenziali influenze (ad esempio, zucchero nella dieta,66 modelli di aumento del glucosio,67 concomitante iperlipidemia57).

I nostri risultati hanno importanti implicazioni per la gestione delle complicanze aterosclerotiche del diabete. Le più importanti caratteristiche proaterogeniche delle cellule mieloidi e dei precursori BM persistono dopo la normalizzazione della glicemia. Questo può aiutare a spiegare la mancanza di efficacia dei trattamenti convenzionali e sfida fondamentalmente l'approccio alla gestione del rischio vascolare e delle complicanze del diabete. L'identificazione di driver metabolici e particolari modificazioni epigenetiche suggerisce anche potenziali nuovi bersagli terapeutici.

INFORMAZIONI SULL'ARTICOLO

Ricevuto il 27 febbraio 2020; accettato il 23 giugno 2021.

Affiliazioni

Divisione di Medicina Cardiovascolare, Dipartimento di Medicina di Radcliffe, Università di Oxford, Regno Unito (LE, NA, ATB, JB, JTC, MA, KZ, RA, TJC, MJC, KMC, RC, RPC). Centro di ricerca CeMM per la medicina molecolare dell'Accademia austriaca delle scienze, Vienna, Austria (TK, AFR, CB). Divisione di Chimica Fisiologica II, Dipartimento di Biochimica Medica e Biofisica, Karolinska Institutet, Stoccolma, Svezia (HG-A., CEW). Dipartimento di Medicina Respiratoria e Allergologia (HG-A., CEW) e Dipartimento di Medicina (H7) (JL, MR), Karolinska University Hospital, Stoccolma, Svezia. Il Kennedy Institute of Rheumatology, Università di Oxford, Regno Unito (ALC, TEK, IAU). Istituto di Intelligenza Artificiale e Supporto alle Decisioni, Centro di Statistica Medica, Informatica e Sistemi Intelligenti, Università di Medicina di Vienna, Austria (CB). Bioinfo, Plantagenet, ON, Canada (MEL). Dipartimento di Medicina Interna, Radboud University Medical Centre, Nijmegen, Paesi Bassi (NPR., MGN). Dipartimento di genomica e immunoregolazione, Life and Medical Sciences Institute (LIMES), Università di Bonn, Germania (MGN).

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Lisa Heather, Maria da Luz Sousa Fiahlo e Thomas Milne per la loro assistenza. RPC, NA e LE hanno ideato lo studio. LE ha eseguito tutte le sperimentazioni in vitro, le analisi dell'espressione genica e l'immunoblotting descritti. MA ha contribuito agli studi su campioni umani. CEW e HG-A. ha eseguito la metabolomica basata sulla spettrometria di massa. Il JTC ha eseguito il lavoro LCM sui macrofagi della placca umana e la preparazione dell'array. LE ha eseguito esperimenti con Seahorse Bioanalyser sotto la guida di JB e la supervisione di MJCALC e ha eseguito analisi di selezione delle cellule. Campioni di RNA-seq preparati da LE. LE ha preparato campioni ATAC-seq sotto la guida di TEK e la supervisione di IAU. NA ha eseguito tutte le preparazioni cellulari di sequenziamento ChIP. Il sequenziamento è stato eseguito da TK e AFR sotto la supervisione di CB. MEL e ATB hanno eseguito l'allineamento dei dati di sequenziamento, la normalizzazione e il controllo di qualità, mentre LE ha eseguito l'analisi a valle. MEL e ATB hanno eseguito l'analisi dei dati di matrice e sequenziamento. KZ, RA e RC hanno condotto indagini sugli animali. LE, NA, TJC, NPR e MGN hanno partecipato alla progettazione e all'esecuzione sperimentale. RPC, LE, NA e MEL hanno preparato il manoscritto. Tutti gli autori hanno letto e approvato l'invio finale del manoscritto.

Fonti di finanziamento

Questo lavoro è stato sostenuto dal British Heart Foundation Centre of Research Excellence Oxford (RE/13/1/30181), dalla British Heart Foundation Project Grant (Drs Akbar e Choudhury: PG/18/53/33895), dal National Institute for Health Research Oxford Biomedical Research Center, the Tripartite Immunometabolism Consortium–Novo Nordisk Foundation (concessione NNF15CC0018486; Drs Choudhury, Udalova, Rydén, Channon e Wheelock), Metabolite-Related Inflammation in Diabetes-Spectrum Diseases: New Targets Beyond Glucose (MeRIAD–Novo Nordisk Foundation , concessione 0064142; Dott.ssa Choudhury, Udalova, Rydén e Channon) e 4-anni di dottorato della British Heart Foundation. borsa di studio e il Doris Field Trust (Dr. Edgar). L'High-Throughput Genomics Group presso il Wellcome Trust Center for Human Genetics è stato finanziato dalla sovvenzione Wellcome Trust riferimento 090532/Z/09/Z e dalla sovvenzione MRC Hub G0900747 91070. La struttura di sequenziamento biomedico presso il Centro di ricerca CeMM per la medicina molecolare dell'Accademia austriaca delle scienze a Vienna, Austria. I dottori Riksen e Netea hanno ricevuto finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell'Unione europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione 667837. Il dottor Netea è stato sostenuto da una sovvenzione di consolidamento del CER (n. 310372) e dall'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica.

Divulgazioni

Nessuno.

Materiali supplementari

Supplemento ai dati Figure I–XI

Supplemento ai dati File Excel I–VII

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Laurence Edgar, DPhil*; Naveed Akbar, Ph.D.*; Adam T. Braithwaite, Ph.D.; Thomas Krausgruber, Ph.D.; Héctor Gallart-Ayala, Ph.D.; Jade Bailey, DPhil; Alastair L. Corbin, DPhil; Tariq E. Khoyratty, DPhil; Joshua T. Chai, DPhil; Mohammad Alkhalil, DPhil; André F. Rendeiro, Ph.D.; Klemen Ziberna, DPhil; Ritu Arya, MRes; Thomas J. Cahill, DPhil; Christoph Bock, PhD; Jurga Laurencikiene, Ph.D.; Mark J. Crabtree, Ph.D.; Madeleine E. Lemieux, PhD; Niels P. Riksen, MD, Ph.D.; Mihai G. Netea, MD, Ph.D.; Craig E. Wheelock, PhD; Keith M. Channon, MD; Mikael Rydén, MD, Ph.D.; Irina A. Udalova, Ph.D.; Ricardo Carnicer, PhD; Robin P. Choudhury, DM.

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