L'ipotermia indotta dall'oxcarbazepina dopo un'ischemia transitoria del proencefalo esercita una neuroprotezione terapeutica attraverso i potenziali vanilloidi di tipo 1 e 4 dei recettori transitori nei gerbilli Parte 3

4. Materiali e metodi

4.1. Animali sperimentali

I gerbilli maschi (numero totale=252) sono stati utilizzati all'età di 6 mesi (peso corporeo, 63–78 g). I gerbilli sono stati allevati nel Centro Sperimentale per Animali dell'Università Nazionale di Kangwon (Chuncheon, Corea).

I gerbilli sono animaletti molto carini. Vivono in aree desertiche, sono bravi a scavare caverne e hanno un forte istinto per immagazzinare e localizzare il cibo. Tra questi piccoletti, i gerbilli maschi hanno una memoria particolarmente buona, che fa sì che le persone vogliano conoscere i loro segreti.

Innanzitutto, quando i gerbilli maschi cercano cibo, usano una serie di segnali come punti di riferimento e terreno per determinare la direzione. Attraverso l'osservazione e la pratica a lungo termine, hanno stabilito il proprio "sistema di informazione geografica". Al contrario, le femmine di gerbillo hanno una memoria peggiore per questi segnali, soprattutto in un ambiente in costante cambiamento.

In secondo luogo, i gerbilli maschi mostrano anche una forte memoria quando combattono i nemici naturali. Secondo gli scienziati, quando i gerbilli sono minacciati, entrano rapidamente nella tana e cercano di scappare. Ma di fronte alla stessa minaccia, i gerbilli maschi ricorderanno la modalità di attacco dei nemici naturali e li eviteranno, aumentando le loro possibilità di sopravvivenza.

Infine, la memoria dei gerbilli maschi risiede anche nel loro comportamento sociale tra loro. Ogni gerbillo ha il suo odore unico. Quando incontrano altri gerbilli, useranno il loro senso dell'olfatto per identificare l'identità e lo status l'uno dell'altro. Questa capacità di memoria non solo consente ai gerbilli di stabilire una connessione sociale relativamente stabile, ma costituisce anche un'importante garanzia per la loro riproduzione.

In sintesi, il rapporto tra gerbilli maschi e memoria è inseparabile. Nel processo di ricerca della sopravvivenza e della riproduzione nella natura, fanno affidamento sulla loro forte memoria per adattarsi costantemente all’ambiente e migliorarsi. Come esseri umani, dovremmo imparare da questi piccoli ragazzi e affinare costantemente la nostra memoria per adattarci meglio a questo mondo in continua evoluzione. Si vede che abbiamo bisogno di migliorare la nostra memoria, e la Cistanche può migliorare significativamente la memoria perché può anche regolare l'equilibrio dei neurotrasmettitori, come ad esempio aumentando i livelli di acetilcolina e i fattori di crescita, che sono molto importanti per la memoria e l'apprendimento. Inoltre, Cistanche può anche migliorare il flusso sanguigno e promuovere l'apporto di ossigeno, il che può garantire che il cervello ottenga nutrimento ed energia sufficienti, migliorando così la vitalità e la resistenza del cervello.

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Per questo studio, il protocollo sperimentale è stato approvato (approvazione n. KW-200113-1; data di approvazione, 18 febbraio 2020) dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.

Il protocollo di ricerca ha aderito alle linee guida suggerite nelle "Current International Laws and Policies" della Guide for the Care and Use of LaboratoryAnimals pubblicata da The National Academies Press (8th Ed., 2011).

4.2. Gruppi sperimentali, induzione di tFI e trattamenti HyT e OXC

Per dimostrare gli effetti protettivi di OXC contro il danno ischemico conseguente a tFI nei gerbilli, i gerbilli sono stati divisi in sei gruppi: (1) gruppo sham+veicolo (n=24); (2) gruppo tFI+veicolo (n {{5 }}); (3) gruppo sham+HyT (n=24); (4) gruppo tFI+HyT (n=60); (5) gruppo sham+OXC (200 mg/kg) (n=24); e (6) gruppo tFI+OXC (n=60).

Sette e cinque gerbilli nei tre gruppi tFI sono stati utilizzati per l'analisi Western blot e l'esame istologico, rispettivamente, a 30 minuti, 12 ore, 1 giorno, 2 giorni e 4 giorni dopo l'operazione tFI, e nei tre gruppi fittizi, sette e cinque i gerbilli sono stati utilizzati 30 minuti e 4 giorni dopo l'operazione fittizia per ridurre al minimo i numeri. In questo esperimento, il tFI è stato sviluppato come descritto in precedenza [34].

In breve, i gerbilli sono stati anestetizzati con isoflurano al 2,5% (in 32% di ossigeno e 68% di protossido di azoto). Sotto anestesia, entrambe le arterie carotidi comuni sono state isolate dalla guaina carotidea e occluse con clip per aneurisma (Yasargil FE 723K) (Aesculap, Tuttlingen, Germania ) per cinque minuti.

L'arresto perfetto dell'afflusso di sangue al cervello è stato confermato attraverso l'osservazione del flusso sanguigno arterioso in entrambe le arterie retiniche (rami delle carotidarterie interne) utilizzando un oftalmoscopio (HEINE K180®) della Heine Optotechnik (Herrsching, Germania).

La temperatura corporea prima e durante l'intervento in tutti i gruppi è stata controllata a normotermia (37 ± 0,2 ◦C) utilizzando una coperta termometrica. Dopo cinque minuti di occlusione, le clip sono state rimosse.

In questo studio, è stata eseguita un'operazione fittizia sottoponendoli allo stesso intervento chirurgico tFI senza l'occlusione delle arterie carotidi comuni. L'HyT nei due gruppi sham+HyT e tFI+HyT è stato controllato (simile alla variazione della temperatura corporea nei gruppi tFI+ gruppo OXC) mediante raffreddamento del corpo intero con un impacco di ghiaccio per sei ore.

La temperatura corporea dei due gruppi sham+OXC e tFI+OXC è stata registrata per sei ore dopo l'immediata iniezione intraperitoneale di 200 mg/kg OXC (Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, USA) dopo l'operazione tFI.

Il dosaggio di OXC è stato selezionato sulla base di uno studio precedente che riportava che 200 mg/kg di OXC proteggevano efficacemente dalla morte cellulare nel cervello dopo il [36]. Per registrare il cambiamento della temperatura corporea, la temperatura corporea è stata misurata nel retto ogni ora dopo il tFI, per oltre un periodo di 6 ore, a temperatura ambiente (circa 22 ◦C).

I gerbilli hanno ricevuto un tempo di recupero di quattro giorni dopo il tFI perché le cellule piramidali situate nella regione CA1 dell'ippocampo iniziano a morire quattro giorni dopo il tFI [30,34,62].

4.3. Prova della SMA

Il test SMA è stato eseguito per esaminare i cambiamenti nell’iperattività in tutti i gruppi. In breve, come descritto in precedenza [63], il test SMA è stato eseguito il giorno 1 dopo il tFI poiché l'attività locomotoria raggiunge il punto più alto il giorno 1 dopo la lesione ischemica successiva al tFI.

I gerbilli di tutti i gruppi hanno ricevuto un adattamento ambientale per due ore e sono stati posti in una gabbia a campo aperto (larghezza 44 cm; lunghezza 44 cm; altezza 30) ottenuta da Ugo Basile SRL (Gemonio, Italia), in cui due gerbilli orizzontali paralleli Sono stati installati raggi infrarossi 4×8 dal pavimento, per un'ora. La SMA è stata registrata utilizzando un Photobeam Activity System-Home Cage della San Diego Instruments (San Diego, CA, USA).

Il movimento (traiettoria e distanza totale percorsa) veniva rilevato attraverso l'interruzione del fascio di raggi infrarossi prodotto dalle fotocellule.

La SMA è stata monitorata continuamente per un'ora e i dati sono stati raccolti utilizzando un analizzatore AMB di IPC Electronics (Cumbria, Regno Unito).

La raccolta dei dati è stata avviata 15 minuti dopo l'assuefazione nella gabbia in campo aperto. Infine, i risultati ottenuti sono stati valutati come distanza (metri) di movimento nel periodo di prova (un'ora).

4.4. Test delle funzioni cognitive

4.4.1. RAMT

Per confrontare la memoria spaziale in tutti i gruppi, la RAMT è stata effettuata secondo studi precedenti [38,44]. Per questo test è stato utilizzato un labirinto a bracci radiali 8-della Stoelting Co (Wood Dale, IL, USA).

Lo strumento del labirinto consisteva in una piattaforma centrale e otto bracci (larghezza di ciascun braccio, 5 cm; altezza, 9 cm; lunghezza, 35 cm). I gerbilli venivano addestrati una volta al giorno per tre giorni prima.

Vale a dire, il mangime in pellet ottenuto da DBL Co (Chungbuk, Corea) è stato messo nella parte terminale di ciascun braccio e ciascun gerbillo è stato posizionato sulla piattaforma centrale. Successivamente, il gerbillo ha cercato il mangime.

Dopo l'operazione fittizia o tFI, il test vero e proprio è stato effettuato una volta al giorno per quattro giorni a partire dal giorno successivo all'operazione.

Per l'analisi è stato valutato il numero di errori, con un errore che si verificava ogni volta che il gerbillo entrava in un braccio già visitato in precedenza. Il test è terminato quando il gerbillo ha consumato il mangime.

4.4.2. PAT

Per confrontare la memoria a breve termine tra i gruppi, il PAT è stato condotto secondo metodi precedentemente riportati [64,65] con alcune modifiche. In breve, i gerbilli sono stati testati utilizzando il Gemini Evitance System (GEM 392) della San Diego Instruments (SanDiego, CA, USA), che consiste di due compartimenti (scuro e chiaro) che comunicano tra loro tramite un cancello scorrevole verticalmente.

Le sessioni sperimentali sono state eseguite in due fasi: una sessione di allenamento e una sessione di test reale eseguita un giorno prima e quattro giorni dopo l'operazione tFI o sham.

Il test vero e proprio è stato eseguito 20 minuti dopo la sessione di addestramento misurando il tempo di latenza (secondi) durante la permanenza nella camera oscura. Vale a dire, nella sessione di addestramento, al gerbillo è stato permesso di esplorare liberamente i due compartimenti per un minuto mentre il cancello era aperto .

Successivamente, quando il gerbillo entrava nello scompartimento buio, la porta veniva chiusa e al gerbillo veniva data una scossa elettrica (0,5 mA) da una griglia d'acciaio sul pavimento per cinque secondi.

Nella sessione di test reale, il giorno 4 dopo il tFI, il gerbillo è stato posto nel compartimento luminoso ed è stato registrato il tempo di latenza nel compartimento luminoso prima di entrare nel compartimento buio.

4.5. Analisi Western Blot per TRPV1 e TRPV4

Per esaminare i livelli di espressione di TRPV1 e TRPV4 nell'ippocampo CA1 del gerbillo, la tecnica Western blot è stata eseguita secondo i metodi precedentemente descritti [66,67].

In breve, secondo il programma stabilito (30 minuti, 12 ore, 1 giorno, 2 giorni e 4 giorni dopo l'operazione fittizia o tFI), ai gerbilli (n=5 per ciascun gruppo) è stata somministrata l'anestesia per l'eutanasia mediante iniezione intraperitoneale con 200 mg/kg pentobarbital sodico (JW Pharm.Co., Ltd., Seoul, Corea).

Successivamente, i loro cervelli sono stati raccolti e omogeneizzati con soluzione salina tamponata con fosfato 50 mM (PBS, pH 7,4) contenente 0.1 mM glicole etilenico-bis (amminoetil etere)-N, N, N{{ 11}}, acido N0-tetraacetico (EGTA) (pH 8.0), acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) 10 mM (pH 8,0), 0,2% Nonidet P{{17 }}, pirofosfato di sodio 15 mM, -glicerofosfato 100 mM, ortovanadato di sodio 2 mM, NaF 50 mM, NaCl 150 mM, fluoruro di fenilmetilsulfonil 1 mM (PMSF) e ditiotreitolo 1 mM (DTT).

Successivamente, i campioni sono stati centrifugati e i surnatanti sono stati prelevati per determinare i livelli proteici utilizzando un kit di analisi Micro BCA della Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) con albumina di siero bovino della Pierce Chemical Co (Rockford, IL, USA).

Aliquote comprendenti 20 µg di proteine ​​totali sono state bollite in tampone di caricamento, Tris 150 mM (pH 6,8) contenente 6% sodio dodecil solfato (SDS), 3 mM DTT, 0,3% blu di bromofenolo e 30% glicerolo.

I campioni sono stati separati tramite elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS al 10% (PAGE). Successivamente, i gel sono stati trasferiti su membrane di nitrocellulosa di Pall Co (East Hills, NY, USA) a 350 mA e 4 ◦C per 90 minuti.

Per bloccare la colorazione aspecifica, le membrane sono state incubate in latte sgrassato al 5% per 60 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, sono stati immunoreagiti con ciascun anticorpo primario: anti-TRPV1 di coniglio (diluito 1:1000) (Abcam, Cambridge, UK), anti-TRPV4 di coniglio (diluito 1:1000) (Abcam) e anti-TRPV4 di coniglio (diluito 1:1000) (Abcam). actina (diluita 1:2000)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a 4 ◦C per 7 ore.

Successivamente, sono stati fatti reagire con IgG anti-coniglio di asino coniugati con perossidasi di rafano (HRP) (diluito 1:4500) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) a temperatura ambiente per 1 ora.

Infine, per migliorare la visualizzazione è stato utilizzato il kit di chemiluminescenza a base di alluminolo di Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA).

Come descritto in precedenza [68], gli immunoblot di TRPV1 e TRPV4 sono stati analizzati utilizzando il software Scion Image di Scion Crop (Frederick, MD, USA). Le bande sono state scansionate ed è stata eseguita l'analisi densitometrica. I livelli proteici erano normalizzati rispetto al corrispondente livello di -actina.

4.6. Preparazione di sezioni istologiche

Per gli esami immunoistochimici e istopatologici, i gerbilli (n=7 per ciascun gruppo) sono stati sacrificati secondo il programma designato (30 minuti, 12 ore, 1 giorno, 2 giorni e 4 giorni dopo l'operazione tFI o fittizia).

Come descritto in precedenza [34], i gerbilli sono stati anestetizzati profondamente con pentobarbital sodico (200 mg/kg) (JW Pharmaceutical, Seoul, Corea). Sotto anestesia, i gerbilli sono stati risciacquati per via transcardiaca con tampone fosfato salino 0,1 M (pH 7,4) e fissati con paraformaldeide al 4% (in tampone fosfato 0,1 M, pH 7,4).

Successivamente, i loro cervelli sono stati ottenuti e post-fissati utilizzando lo stesso fissativo per sei ore. Successivamente, i tessuti cerebrali sono stati tagliati (spessore 25 µm dei piani coronali) in acriostato (Leica, Wetzlar, Germania).

4.7. Colorazione istochimica mediante CV

Per esaminare il danno morfologico e neuronale nell'ippocampo di ciascun gruppo, è stata eseguita la colorazione con cresil viola (CV) come descritto in precedenza [69]. In breve, l'acetato di cresolo viola (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) è stato sciolto all'1,0% (p/v) in acqua distillata e acido acetico glaciale (0.28 %) è stato aggiunto a questa soluzione. Le sezioni sono state colorate e montate con balsamo canadese (Kanto, Tokyo, Giappone).

4.8. Colorazione FJ B

La colorazione FJ B è stata eseguita per esaminare la degenerazione neuronale (morte o perdita). Secondo la procedura pubblicata [34], le sezioni cerebrali preparate sono state immerse in idrossido di sodio all'1%, trasferite immediatamente in permanganato di potassio al 0.06% e prontamente fatte reagire con Fluoro-Jade B allo 0,0004% (Histochem , Jefferson, AR, USA).

Le sezioni sono state lavate brevemente e poste su un riscaldatore per vetrini (circa 50 ◦C) per la reazione con FJ B. Per valutare l'effetto terapeutico di OXC contro tFI, il numero di cellule FJ B+ è stato contato nella regione CA1 secondo un metodo pubblicato in [ 70].

In breve, le immagini digitali delle cellule FJ B+ sono state catturate da cinque sezioni per gerbillo utilizzando un microscopio epifluorescente (Carl Zeiss) (Oberkochen, Germania) a una lunghezza d'onda di 450–490 nm. Le cellule sono state contate in 250 µm2, che includeva l'SP, al centro della regione CA1 utilizzando un sistema di analisi delle immagini (Optimas 6.5) (CyberMetrics, Scottsdale, AZ, USA).

4.9. Immunoistochimica

Per studiare i cambiamenti nell'immunoreattività di NeuN, TRPV1 e TRPV4 nella regione CA1, è stata eseguita un'immunoistochimica generale. In breve, secondo un metodo pubblicato [34], le sezioni cerebrali preparate sono state incubate con anticorpi primari anti-NeuN di topo (diluito 1:1100) (Chemicon, Temecula, CA, USA), anti-TRPV1 di topo (diluito, 1:500) (Abcam, Cambridge, Regno Unito) e anti-TRPV4 di coniglio (diluito, 1:500) (Abcam, Cambridge, Regno Unito).

Successivamente, queste sezioni incubate sono state incubate nei corrispondenti anticorpi secondari (diluiti, 1:250) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) e sviluppate utilizzando Vectastain ABC (diluito, 1:250) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA , Stati Uniti). Infine, queste sezioni immunoreagite presentavano colore dopo la visualizzazione con 3,3'-diaminobenzidina.

Il numero di cellule NeuN+ è stato contato come segue. Immagini digitali di cellule NeuN+ sono state catturate da cinque sezioni per gerbillo utilizzando un microscopio ottico (AxioM1) (Carl Zeiss, Germania).

Le cellule sono state contate allo stesso modo del conteggio delle cellule FJ B+. Per valutare la densità delle strutture TRPV1+ e TRPV4+, le aree corrispondenti nella regione CA1 sono state utilizzate in cinque sezioni per animale. Le immagini delle strutture TRPV1+ e TRPV4+ sono state catturate utilizzando un microscopio ottico AxioM1 (Carl Zeiss) (Germania).

Le densità delle strutture TRPV{{0}} e TRPV4+ sono state valutate come densità ottica relativa (ROD). A tal fine, le immagini sono state trasformate al livello medio di grigio. Il ROD è stato presentato come percentuale utilizzando Adobe Photoshop (versione 8.0) e il software NIH Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

4.10. Analisi statistica

Abbiamo presentato i dati come media ± errore standard della media (SEM). Tutte le analisi statistiche sono state eseguite con l'ausilio di GraphPad Prism (versione 5.0) (GraphPadSoftware, La Jolla, CA, USA). Le differenze nelle medie tra i gruppi sperimentali sono state analizzate statisticamente mediante analisi della varianza a due vie (ANOVA) con un test di confronto multiplo di Bonferroni post hoc per chiarire le differenze correlate al tFI tra tutti i gruppi. La significatività statistica è stata considerata p < 0. 05.

Contributi dell'autore: Concettualizzazione: M.-HW e T.-KL; Metodologia, J.-CL e DWK; Software, H.-IK e MCS; Convalida, GAI, IJK e JHP; Investigazione, J.-CL, H.-IK e M.CS; Cura dei dati, JHC, IJK e JHP; Scrittura-Preparazione della bozza originale, H.-IK e J.-CL; Scrittura-revisione e editing, M.-HW; Supervisione, S.-SL; Amministrazione del progetto, M.-HW; Acquisizione di finanziamenti, S.-SL e T.-KL Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto.

Finanziamento: questo lavoro è stato sostenuto da Brain Korea 21 (BK21) Fostering Outstanding Universities for Research (FOUR, 4220200913807) finanziato dalla National Research Foundation (NRF) della Corea e dal Basic Science Research Program attraverso la National Research Foundation of Korea (NRF) finanziato dal Ministero dell'Istruzione (NRF-2020R1I1A1A01070897).

Dichiarazione del Comitato di Revisione Istituzionale: I gerbilli sono stati allevati nel Centro Sperimentale per Animali dell'Università Nazionale di Kangwon (Chuncheon, Corea). Per questo studio, il protocollo sperimentale è stato approvato (n. di approvazione, KW-200113-1; data di approvazione, 18 febbraio 2020) dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.

Il protocollo di ricerca ha aderito alle linee guida suggerite nelle "CurrentInternational Laws and Policies" della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicata da The National Academies Press (8th Ed., 2011).

Dichiarazione di consenso informato: non applicabile.

Dichiarazione sulla disponibilità dei dati: i dati presentati in questo studio sono disponibili su richiesta da parte dell'autore corrispondente.

Ringraziamenti: gli autori apprezzano Hyun Sook Kim e Seung Uk Lee per il loro aiuto tecnico in questo studio.

Conflitti di interessi: gli autori hanno dichiarato che non esiste alcun conflitto di interessi finanziario.

Abbreviazioni

CA1: sottocampo Cornu Ammonis 1; Sistema nervoso centrale, sistema nervoso centrale; CV, viola cresilo; DG, giro dentato;FJ B, Fluoro-Jade B; HyT, ipotermia; NeuN, nuclei neuronali; OXC, oxcarbazepina; PAT, test di evitamento passivo; ROD, densità ottica relativa; SMA, attività motoria spontanea; COSÌ, strato oriens;SP, strato piramidale; SR, strato radiato; tFI, ischemia transitoria del prosencefalo; TRPV1, potenziale vanilloide transitorio di tipo 1.

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