Le vescicole extracellulari derivate da cellule staminali mesenchimali ipossiche migliorano la fibrosi renale dopo danno da ischemia-riperfusione ripristinando l'ossidazione degli acidi grassi mediata da CPT1A

Astratto

1. Contesto

La fibrosi renale è un processo patologico comune delle malattie renali croniche indotte da molteplici fattori. Il pretrattamento ipossico delle cellule staminali mesenchimali può migliorare l'efficacia delle vescicole extracellulari secrete (MSC-EV) in varie malattie, ma non è chiaro se possano migliorare meglio la fibrosi renale. L'ultima ricerca ha dimostrato che il recupero dell'ossidazione degli acidi grassi (FAO) può ridurre la fibrosi renale. In questo studio, abbiamo mirato a esaminare se il pretrattamento ipossico con vescicole extracellulari di MSC (Hypo-EV) può migliorare la FAO per ripristinare la fibrosi renale e indagare il meccanismo sottostante.

2. Metodi

Gli ipo-EV sono stati isolati da MSC derivata dalla placenta umana pretrattata con ipossia (hP-MSC) e i Norm-EV sono stati isolati da hP-MSC coltivati ​​in condizioni normali. Abbiamo utilizzato il modello di fibrosi renale indotta da ischemia-riperfusione (I/R) in vivo. I topi sono stati iniettati con PBS, Hypo-EV o Norm-EV immediatamente dopo l'intervento e il giorno 1 dopo l'intervento. La funzione renale, la patologia renale e la fibrosi renale sono state valutate per la valutazione del danno renale. Per l'esplorazione meccanicistica, l'ossidazione degli acidi grassi (FAO), le alterazioni morfologiche mitocondriali, la produzione di ATP e le proteine ​​di massa mitocondriale sono state rilevate in vivo. Il potenziale di membrana mitocondriale e la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono stati studiati in vitro.

3. Risultati

Abbiamo scoperto che gli Hypo-EV conferiscono un effetto terapeutico superiore sul recupero del danno alla struttura renale, sul ripristino della funzione renale e sulla riduzione della fibrosi renale. Nel frattempo, gli Hypo-EV hanno potenziato la FAO mitocondriale nel rene ripristinando l'espressione di un enzima limitante la velocità della carnitina palmitoil-transferasi 1A (CPT1A) della FAO. Dal punto di vista meccanicistico, il miglioramento dell'omeostasi mitocondriale, caratterizzato dalla riparazione della struttura mitocondriale, dal ripristino della massa mitocondriale e dalla produzione di ATP, dall'inibizione dello stress ossidativo e dall'aumento del potenziale di membrana mitocondriale, spiega in parte l'effetto degli Hypo-EV sul miglioramento della FAO mitocondriale e quindi sull'attenuazione dell'I/ Danno R.

4. Conclusioni

Gli ipo-EV sopprimono la fibrosi renale ripristinando la FAO mitocondriale mediata da CPT1A, i cui effetti possono essere raggiunti attraverso la regolazione dell'omeostasi mitocondriale. I nostri risultati forniscono un ulteriore supporto del meccanismo per lo sviluppo della terapia senza cellule per la fibrosi renale.

5. Parole chiave

Cellule staminali mesenchimali, ipossiche, vescicole extracellulari, mitocondriali, ossidazione degli acidi grassi, fibrosi renale.

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introduzione

La malattia renale cronica (CKD) è una grave malattia che minaccia la salute umana ed è anche un'importante questione pubblica globale. L'incidenza globale, la prevalenza e la morte di CKD sono significative e in aumento e la prevalenza è di circa il 10% tra gli adulti in tutto il mondo [1, 2]. Il danno da ischemia-riperfusione renale (I/R) è associato a fibrosi renale e CKD progressiva [3, 4]. La fibrosi renale è considerata un processo patologico comune che porta alla malattia renale cronica e alla malattia renale allo stadio terminale. Tuttavia, attualmente non esistono terapie efficaci che prevengano o invertano con successo la fibrosi [5].

È stato riportato che le vescicole extracellulari derivate da cellule staminali mesenchimali (MSC-EV) svolgono un ruolo rigenerativo e antifibrotico in diversi modelli preclinici di CKD [6-9]. Tuttavia, la bassa resa di MSC-EV è un fattore limitante per la produzione su larga scala di terapie cell-free [10]. Il precondizionamento dell'ipossia stimola le attività paracrine delle MSC e aumenta la funzione e la produzione di EV ed è considerato un approccio ingegneristico per migliorare il potenziale terapeutico delle EV [11, 12]. Uno studio recente ha indicato che le MSC precondizionate dall'ipossia sono più significative delle MSC non trattate nella prevenzione della fibrosi renale e dell'infiammazione [13]. Tuttavia, il ruolo degli EV derivati ​​da MSC precondizionati dall'ipossia nella fibrosi renale non è stato ancora stabilito.

Il meccanismo patologico della fibrosi renale è stato rivisto in molti studi recenti [14-16], in particolare nel campo della regolazione metabolica [17]. È ben noto che le cellule tubulari prossimali (PTC) sono le cellule che richiedono più energia nel rene e svolgono un ruolo centrale nella progressione della fibrosi tubulointerstiziale [18, 19]. L'ossidazione degli acidi grassi (FAO) è la principale fonte di energia delle PTC [19, 20]. I risultati degli studi sul trascrittoma dell'intero genoma hanno mostrato che l'espressione degli enzimi metabolici chiave correlati alla FAO e dei regolatori della trascrizione era marcatamente ridotta nei modelli umani e murini con fibrosi tubulointerstiziale [20]. Inoltre, il ripristino del metabolismo degli acidi grassi può proteggere i topi dalla fibrosi tubulointerstiziale [17, 20]. Uno studio recente ha confermato che la sovraespressione dell'enzima chiave limitante la velocità carnitina palmitoil-transferasi 1A (CPT1A) può migliorare la FAO nelle cellule epiteliali tubulari renali, ridurre l'espressione dei mediatori dell'infiammazione e portare a un significativo alleviamento della fibrosi in tre modelli sperimentali [21 ]. Pertanto, le terapie mirate alla FAO possono essere una strategia terapeutica potenzialmente efficace per la riduzione della fibrosi.

I mitocondri svolgono un ruolo indispensabile nella regolazione della FAO. Uno studio precedente ha indicato che l'astragaloside IV può migliorare la FAO regolando l'attività mitocondriale durante l'invecchiamento [22]. La distruzione dell'omeostasi mitocondriale gioca un ruolo importante nella lesione precoce della malattia renale, nella riparazione anormale dopo la lesione e nella patogenesi della malattia renale cronica [23, 24]. In condizioni fisiologiche e patologiche, vari meccanismi si coordinano per mantenere l'omeostasi mitocondriale, tra cui difesa antiossidante, riparazione del DNA mitocondriale, fusione e fissione mitocondriale, autofagia mitocondriale e biogenesi mitocondriale [25]. Diversi studi hanno dimostrato che le MSC-EV possono attenuare il danno mitocondriale stabilizzando il DNA mitocondriale [26], inibendo la fissione mitocondriale e stimolando la difesa antiossidante mitocondriale e la produzione di adenosina trifosfato (ATP) nei modelli di danno renale acuto (AKI) [27, 28] . Precedenti studi hanno indicato che il trattamento con Hypo-EV ha avuto effetti migliori sulla promozione dell'angiogenesi, della proliferazione e della migrazione e sull'inibizione dell'infiammazione e dell'apoptosi rispetto al trattamento con Norm-EV [29-31]. Tuttavia, i ricercatori non hanno determinato in modo definitivo se i risultati terapeutici degli Hypo-EV nella fibrosi dipendano dall'omeostasi mitocondriale.

Gli obiettivi di questo studio erano (1) esplorare se il pretrattamento ipossico delle vescicole extracellulari derivate da MSC (Hypo-EV) ha un migliore effetto anti-fibrosi; (2) determinare se gli Hypo-EV alleviano la fibrosi indotta da ischemia riperfusione potenziando la FAO mediata da CPT1A; (3) esaminare se l'effetto protettivo degli Hypo-EV sulla FAO è correlato alla regolazione dell'omeostasi mitocondriale.

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Metodi

1. Precondizionamento della coltura cellulare e dell'ipossia

Le MSC derivate dalla placenta umana (hP-MSC) sono state fornite dall'Institute of Foundation, Chinese Academy of Medical Sciences e coltivate nel terreno Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12, Gibco) con il 10% siero bovino fetale (FBS, Corning) integrato con 100 U/mL di penicillina-streptomicina (Gibco) e mantenuto a 37 gradi in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2. Dopo che l'hP-MSC ha raggiunto una confluenza del 60% -70%, i terreni di coltura sono stati sostituiti con FBS impoverito di esosomi (SBI, 50A-1) e sono stati coltivati ​​a 37 gradi, 5% di CO2, 21% di O2 o a 1 percento di O2, 94 percento di N2 e 5 percento di CO2 per ulteriori 48 ore. Il mezzo è stato quindi raccolto per l'isolamento degli EV e gli EV raccolti dal pretrattamento ipossico di MSC (1% di O2) sono stati chiamati Hypo-EV e il normale MSC (21% di O2) è stato chiamato Norm-EV. Solo hP-MSC dei passaggi 6-10 sono stati utilizzati per ulteriori esperimenti.

2. Coltura cellulare e trattamento

Cellule epiteliali tubulari prossimali renali umane (HK-2, ATCC, USA) sono state coltivate in DMEM/F12 con FBS al 10% e integrate con 100 U/mL di penicillina-streptomicina. Le celle sono state mantenute a 37 gradi in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2. Abbiamo utilizzato due approcci per imitare la CKD in vitro. Il modello di ipossia/riossigenazione cellulare (H/R) è stato eseguito come riportato in precedenza [32]. In breve, le cellule HK -2 sono state esposte a una condizione ipossica (37 gradi, 1 percento O2, 94 percento N2 e 5 percento CO2) per 12 ore in glucosio e mezzo privo di siero per indurre danno ipossico. Successivamente, il mezzo è stato sostituito e le cellule sono state poste in condizioni normali (21 percento di O2) per la riossigenazione per 24 ore. Il gruppo di controllo è stato coltivato in condizioni normali (21% di O2) secondo il disegno sperimentale. Un altro metodo consisteva nell'incubare le cellule HK-2 con il fattore di crescita trasformante beta-1 (TGF- 1) a una concentrazione finale di 10 ng/mL per 48 ore, come riportato in precedenza [13]. Durante la riossigenazione o il tempo stimolato dal TGF- 1-, alle cellule sono stati aggiunti Norm-EV o Hypo-EV (100 ug/mL di mezzo nutritivo).

3. Isolamento e identificazione di MSC‑EV

Gli EV derivati ​​da MSC sono stati isolati utilizzando un metodo di ultracentrifugazione differenziale. In breve, il mezzo di coltura è stato centrifugato a 4 gradi come segue: 500×g per 10 min, a 2,000×g per 20 min, e 10,000×g per 30 min. Il terreno è stato filtrato attraverso un filtro da 0.22-μm prima dell'ultracentrifugazione a 100,000×g per 2 ore. Infine, i pellet EV sono stati risospesi in PBS e ultracentrifugati per altre 2 ore per scartare le proteine ​​​​contaminanti, quindi gli EV purificati sono stati raccolti in PBS e conservati a -80 gradi per un ulteriore utilizzo. Le concentrazioni proteiche di Norm-EV e Hypo-EV sono state esaminate utilizzando un test proteico dell'acido bicinconinico (BCA, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). La tipica struttura a membrana a doppio strato a forma di sfera degli EV è stata osservata mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Il western blotting è stato utilizzato per esaminare la qualità dei veicoli elettrici e la distribuzione delle dimensioni dei veicoli elettrici è stata esaminata mediante diffusione dinamica della luce (DLS).

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4. Esperimenti sugli animali

I topi maschi C57BL/6 SPF (7-9 settimane di età) sono stati forniti dalla Sibeifu Experimental Animal Science and Technology (Pechino, Cina) e sono stati alimentati in modo adattivo per 4 giorni nel centro per animali del Chinese PLA General Hospital prima dell'esperimento. I topi sono stati divisi casualmente in quattro gruppi: i gruppi di controllo, soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), Norm-EV e Hypo-EV. I topi dei gruppi PBS, Norm-EVs e Hypo-EVs sono stati sottoposti a ischemia-riperfusione renale come descritto in precedenza [33, 34]. In breve, i topi sono stati anestetizzati con pentobarbital (50 mg/kg) mediante iniezione intraperitoneale. I peli dorsali sopra il rene di topo sono stati puliti e quindi sono stati esposti i vasi bilaterali del peduncolo renale. Per indurre l'ischemia renale, l'arteria renale sinistra è stata bloccata con un morsetto vascolare non traumatico per 30 minuti e il rene destro è stato rimosso contemporaneamente. Successivamente, è stata avviata la riperfusione rilasciando il morsetto. I reni sono stati osservati per 5 minuti per garantire la riperfusione dopo la rimozione del morsetto. Il tavolo operatorio e la temperatura ambiente sono stati mantenuti a 37 gradi durante l'intervento chirurgico. Nei modelli di trattamento, 100 ug di Norm-EV o Hypo-EV in 0,15 mL di solvente PBS sono stati somministrati mediante iniezione nella vena della coda immediatamente dopo l'intervento chirurgico e il giorno (D) 1 postoperatorio rispettivamente nei gruppi Norm-EV e Hypo-EV. Lo stesso volume di PBS è stato somministrato mediante iniezione nella vena della coda nel gruppo PBS. I topi sono stati uccisi a D 2, D 7 e D 14 dopo l'intervento chirurgico (Fig. 1a).

5. internalizzazione MSC‑EV

Per verificare se i veicoli elettrici potrebbero essere interiorizzati dai reni danneggiati. La colorazione fluorescente Dil (Yeasen) è stata eseguita per etichettare gli EV. I Norm-EV o Hypo-EV (200 ug) che sono stati sciolti in 100 μL di PBS sono stati incubati con 4 μM di Dil a 37 gradi per 1 ora. I coloranti non legati sono stati quindi rimossi utilizzando una colonna spin esosomica (Invitrogen). I Di/Norm-EV e Dil/Hypo-EV sono stati sospesi in PBS per un uso successivo. Dil/Norm-EVs o Dil/HypoEVs (100 ug) sono stati iniettati per via endovenosa in un topo modello di lesione da ischemia-riperfusione (I/R) attraverso la vena della coda immediatamente dopo l'intervento chirurgico e dopo l'intervento D 1 come menzionato sopra. Nei giorni 1, 3, 5 e 7, i topi sono stati immediatamente sottoposti a imaging utilizzando Living Image Software 4.4 (PerkinElmer). Inoltre, i reni sono stati raccolti e osservati su un sistema di imaging ottico su D 7. Tutti i segnali di imaging di bioluminescenza (BLI) sono stati misurati dalla radianza media dalle regioni di interesse (ROI).

6. Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)

Un totale di 1 mm3 di tessuto renale è stato fissato in glutaraldeide al 2,5% (pH 7,4) a 4 gradi per 24 ore. Quindi, il tessuto è stato fissato con acido di osmio all'1% per 2-3 ore, disidratato con acetone ed etanolo e incorporato con resina epossidica. Successivamente, è stato utilizzato un ultramicrotomo per preparare sezioni ultrasottili con uno spessore di 60 nm, che sono state poi colorate con acetato di uranile al 3% e citrato di piombo. Infine, la sezione è stata osservata sotto un TEM (Giappone).

7. Analisi della funzionalità renale

Un campione di sangue è stato prelevato dalla vena della coda su D 3 e i livelli di azoto ureico nel sangue (BUN) nei topi sono stati testati utilizzando un kit appropriato (Bioassay).

8. Valutazione istopatologica renale

I tessuti renali sono stati fissati in formalina al 10% per 48 ore, incorporati in paraffina, sezionati a 3 μm di spessore, colorati con reagenti di colorazione Masson secondo un protocollo standard e osservati utilizzando un microscopio (Olympus, Tokyo, Giappone). La percentuale dell'area di deposizione del collagene è stata calcolata utilizzando il software ImageJ. C'erano almeno 10 campi casuali non sovrapposti per animale per il punteggio.

9. Immunoistochimica

Le sezioni renali incluse in paraffina sono state pretrattate utilizzando il recupero dell'antigene mediato dal calore con tampone di citrato di sodio (pH 6, soluzione di recupero dell'epitopo 1) per 20 minuti, seguito da incubazione con anticorpi primari durante la notte a 4 gradi . Le sezioni sono state quindi incubate con un anticorpo secondario biotinilato e la 3,3'-diaminobenzidina (DAB) è stata utilizzata come cromogeno. Le sezioni sono state quindi controcolorate con ematossilina e osservate con un microscopio ottico. Gli anticorpi primari utilizzati erano i seguenti: CPT1A (ab128568, Abcam) e Vimentin (ab92547, Abcam).

10. Immunofluorescenza

Le cellule o il tessuto sono stati permeabilizzati con 0,2% di Triton X-100 per 5 minuti, bloccati con siero di pecora per 30 minuti e incubati con -actina del muscolo liscio (-SMA, 1:200, 55135, Proteintech) o anticorpo collagene I (1:100, ab270993, Abcam) per 16-18 ore a 4 gradi, seguito da incubazione con anticorpo secondario coniugato con Cy3 (rosso) a temperatura ambiente per 1 ora. I nuclei sono stati controcolorati con DAPI. La colorazione fluorescente delle sezioni di tessuto è stata ripresa mediante microscopia a fluorescenza confocale.

11. Analisi Western blotting

I pellet di reni, cellule o EV sono stati lisati nel tampone di lisi del saggio di precipitazione radioimmune (RIPA) contenente fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) e la sospensione surnatante ottenuta dopo la centrifugazione è stata misurata utilizzando un kit di analisi delle proteine ​​BCA (Thermo Fisher Scientific). Campioni di proteine ​​della stessa qualità (20 ug/corsia) sono stati aggiunti a un gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide al 10% o 12% (SDS-PAGE) e quindi trasferiti dai gel SDS-PAGE alle membrane. La membrana è stata bloccata per 2 ore a temperatura ambiente con una soluzione di caseina 1X e quindi incubata con anticorpi primari a 4 gradi contro le seguenti proteine: -SMA (ab7817, Abcam), vimentina (ab92547, Abcam), gliceraldeide 3- fosfato deidrogenasi (GAPDH, 60004-1- Ig, Proteintech), actina (20536-1-AP, Proteintech), PGC1 (ab191838, Abcam), CPT1A (ab128568, Abcam), succinato deidrogenasi complesso ferro-zolfo subunità B (SDHB , 10620-1-AP, Proteintech), subunità IV del citocromo c ossidasi (COXIV, ab202554, Abcam) e ATPB (17247-1-AP, Proteintech). La membrana è stata quindi incubata con il corrispondente anticorpo secondario per 1,5 ore a temperatura ambiente e lavata tre volte. Le immagini sono state analizzate utilizzando il software ImageJ.

12. Reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale (RT‑qPCR)

In primo luogo, l'RNA è stato estratto dalle cellule lisate o dal tessuto renale utilizzando il reagente Trizol (Invitrogen), quindi l'RNA è stato sintetizzato in cDNA secondo le istruzioni del produttore utilizzando il kit ReverTra Ace qPCR RT (Toyobo). La reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale è stata eseguita utilizzando SYBR Select Master Mix (Life Technologies) e un sistema di rilevamento RT-qPCR (ABI). Sono stati sintetizzati i primer per i seguenti geni: PPAR forward TTTGCCAAGGCTATCCCAGG, reverse GTCACAGAACGGCTTCCTCA,

PGC1 forward AATGCAGCGGTCTTAGCACT, reverse CTGAGCAGGGACGTCTTTGT, ACOX2 TCATCCAACGTGACCCAGTG, reverse CAG CAAGGACTCTGTCAGCA, CPT2 forward CATCGT ACCCACCATGCACT, reverse CTCCTTCCCAATGCC GTTCT, 18S AGCTATCAATCTGTCAATCCT GTC, reverse GCTTAATTTGACTCAACACGGGA, e l'espressione di ciascun gene bersaglio era normale ized dal gene 18S e calcolato dal 2−ΔΔCT metodo.

13. Misurazione del potenziale di membrana mitocondriale

Il potenziale di membrana mitocondriale (MMP) è stato rilevato utilizzando JC-1 (Beyotime). In primo luogo, la soluzione di lavoro per la colorazione JC-1 è stata ottenuta aggiungendo 8 mL di acqua ultrapura per ogni 50 μL di JC-1 (200X), agitata violentemente su vortex per dissolversi completamente, e quindi 2 mL di JC{{ 7}} tampone di colorazione (5X) è stato aggiunto. In secondo luogo, le cellule in una piastra a sei pori sono state lavate due volte in PBS, quindi è stato aggiunto 1 mL di soluzione di lavoro colorante JC-1 e lasciato per 20 minuti a 37 gradi C. Infine, le cellule sono state nuovamente lavate con PBS e sono stati aggiunti 2 mL della soluzione di coltura cellulare. Le immagini visualizzate sono state acquisite mediante microscopia a fluorescenza.

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14. Rilevamento di specie reattive dell'ossigeno mitocondriale (ROS).

La generazione di ROS mitocondriale è stata misurata mediante microscopia a fluorescenza utilizzando Mito-SOX Red (Thermo Fisher Scientific). La soluzione di lavoro del reagente MitoSOX (2.0 mL, 5 μM) è stata aggiunta per coprire le cellule nelle piastre a sei pori, seguita dalla colorazione con MitoSOX Red per 10 minuti a 37 gradi . Quindi, le cellule sono state lavate con PBS tre volte e le immagini visualizzate sono state acquisite mediante microscopia a fluorescenza.

15. Rilevamento dell'ATP

La produzione di ATP è stata determinata attraverso l'Enhanced ATP Assay Kit (Beyotime, China, Cat. No: S0027) secondo il protocollo del produttore.

16. Analisi statistica

La quantificazione e i grafici sono stati analizzati utilizzando GraphPad Prism 7 (La Jolla, CA, USA) e presentati come media ± errore standard della media. Le differenze tra più gruppi sono state analizzate utilizzando l'analisi della varianza (ANOVA) e la significatività statistica è stata fissata a P <0.05.

Discussione

In questo studio, ci siamo concentrati sulla FAO nella fibrosi renale e abbiamo identificato gli enzimi metabolici (CPT1A) e i regolatori della trascrizione (PGC1, PPAR) della FAO, che hanno indicato che gli ipo-EV possono invertire il disturbo del metabolismo degli acidi grassi nel rene fibrotico causato da I /R. Inoltre, abbiamo scoperto che gli Hypo-EV esercitano un profondo effetto sulla FAO mediata da CPT1A, che è in parte attribuita alla regolazione dell'omeostasi mitocondriale.

Negli ultimi anni, un numero crescente di studi ha riportato l'effetto protettivo renale delle MSC-EV nei modelli in vivo di CKD e una piccola quantità di dati disponibili ha dimostrato che le EV erano superiori o ugualmente efficaci nella protezione del rene rispetto alle loro MSC progenitrici [43]. . Il trattamento delle MSC-EV nella malattia renale cronica è agli inizi e il complesso meccanismo non è stato completamente dimostrato. AKI è uno dei principali fattori di CKD, che porta alla malattia renale allo stadio terminale [44], e la lesione renale I/R è un fattore importante per AKI, quindi selezioniamo il modello di fibrosi indotta da I/R per scoprire il potenziale meccanismo molecolare che come le MSC-EV prevengono la fibrosi renale.

La bassa resa di MSC-EV è un fattore limitante per la produzione su larga scala di terapie senza cellule. Pertanto, sono stati studiati vari potenziali approcci per aumentare la resa degli EV, tra cui l'ottimizzazione delle condizioni di coltura delle MSC, gli scaffold tridimensionali basati su matrice extracellulare e la regolazione della biogenesi degli EV [10]. Tra questi, il condizionamento ipossico delle MSC è un metodo valido per aumentare l'effetto del trattamento EV in varie malattie, come la guarigione delle fratture ossee [30], la guarigione delle ferite diabetiche [29] e la riparazione del miocardio [45]. Il nostro studio fornisce prove dell'azione potenziata dall'ipossia degli EV secreti dalle MSC. Inoltre, dimostriamo anche che gli EV derivati ​​da MSC precondizionati ipossici hanno un maggiore effetto antifibrosi e di protezione renale rispetto agli EV Norm nella CKD indotta da I/R. I dati sui miRNA negli Hypo-EV rispetto ai Norm-EV sono stati ben riportati. Numerosi studi hanno riportato che il contenuto di miRNA era responsabile degli effetti benefici degli Hypo-EV in molte malattie [30, 46]. Rispetto ai Norm-EV, 215 miRNA erano sovraregolati e 369 miRNA sottoregolati negli Hypo-EV di origine adiposa, che regolano principalmente il metabolismo cellulare, la differenziazione e la funzione del TGF [29]. Tuttavia, il meccanismo con cui gli Hypo-EV regolano la funzione del metabolismo rimane poco compreso nella malattia renale cronica. Un ampio corpus di letteratura indica che la FAO è ridotta nella fibrosi renale e contribuisce alla sua patogenesi [47]. Coerentemente con i rapporti, il nostro studio ha mostrato che l'espressione genica degli enzimi metabolici chiave correlati alla FAO (CPT1A, CPT2 e ACOX2) e dei fattori regolatori della trascrizione della FAO (PPAR e PGC1) erano marcatamente diminuiti nella fibrosi renale indotta da I/R.

Inoltre, il ripristino del metabolismo lipidico è una potenziale strategia per il trattamento della fibrosi renale [48]. La sovraespressione di CPT1A nei tubuli renali contribuisce in modo significativo al guadagno di funzione nella FAO e si traduce nella protezione della funzione renale e della fibrosi prevenendo la disfunzione mitocondriale, la differenziazione TEC e l'infiammazione nei modelli animali di CKD [21]. I nostri dati hanno mostrato che gli Hypo-EV potrebbero benissimo invertire la FAO danneggiata nella fibrosi indotta da I/R, il che suggerisce che gli effetti terapeutici degli Hypo-EV nella fibrosi renale sono in parte il risultato del ripristino della FAO.

La compromissione della segnalazione PPAR renale ha ridotto l'attività della via FAO e ha aggravato lo sviluppo della fibrosi renale [49]. La somministrazione di fenofibrato, un agonista PPAR, ha ripristinato il difetto di ossidazione dei grassi e la fibrosi tubulointerstiziale nella malattia renale cronica [50, 51]. PGC-1 è un coattivatore di PPAR nel controllo trascrizionale della capacità FAO mitocondriale [39]. Abbiamo studiato se gli HypoEV possono aumentare la segnalazione PPAR e ripristinare la FAO nella lesione I/R. I nostri risultati hanno mostrato che non c'erano differenze evidenti nell'espressione di PGC-1 e PPARa tra Norm-EV e Hypo-EV. Pertanto, devono esserci altri fattori che promuovono il verificarsi di questo processo. I mitocondri sono la centrale elettrica della FAO per generare energia per la cellula [52]. La disfunzione mitocondriale è fondamentale nella patogenesi della fibrosi renale [53]. Il ripristino dell'omeostasi mitocondriale è emerso come una promettente strategia terapeutica per prevenire il danno renale e accelerare la riparazione renale [25]. Studi recenti hanno indicato che gli MSC-EV hanno un effetto protettivo sul danno mitocondriale causato da AKI, che protegge i TEC dall'insulto riducendo la frammentazione mitocondriale, normalizzando il potenziale di membrana mitocondriale e invertendo la delezione del mtDNA e i difetti mitocondriali di OXPHOS [26, 27]. I nostri risultati hanno mostrato che il trattamento con Hypo-EV ha recuperato uno spostamento anormale della morfologia mitocondriale, un aumento della massa mitocondriale e una migliore funzione mitocondriale nei reni fibrotici. I nostri risultati indicano che gli effetti degli Hypo-EV sulla FAO possono essere raggiunti regolando l'omeostasi mitocondriale.

Ci sono alcune limitazioni nel nostro studio. Ad esempio, i nostri dati dimostrano che gli Hypo-EV hanno migliori effetti antifibrotici nei topi con lesioni I/R rispetto ai Norm-EV. Tuttavia, non abbiamo determinato l'espressione differenziale dei contenuti tra Norm-EV e Hypo-EV e inoltre non abbiamo valutato il modo specifico con cui gli Hypo-EV influenzano l'omeostasi mitocondriale in questo studio.

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Conclusioni

In sintesi, i nostri dati indicano che gli Hypo-EV inibiscono significativamente la fibrosi renale ripristinando la FAO mediata da CPT1A e questi effetti possono essere raggiunti regolando l'omeostasi mitocondriale. I nostri risultati forniscono un ulteriore supporto meccanico per lo sviluppo della terapia senza cellule per la fibrosi renale.

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Zhumei Gao1,2, Chuyue Zhang1,3, Fei Peng1, Qianqian Chen1, Yinghua Zhao4, Liangmei Chen5, Xu Wang1 e Xiangmei Chen1,2

1 Dipartimento di Nefrologia, Primo Centro Medico dell'Ospedale Generale dell'EPL Cinese, Istituto di Nefrologia dell'Esercito Popolare di Liberazione Cinese, Laboratorio Statale di Malattie Renali, Centro Nazionale di Ricerca Clinica per le Malattie Renali, Laboratorio di Pechino per la Ricerca sulle Malattie Renali, Pechino, Cina.

2 Dipartimento di Nefropatia, Secondo Ospedale dell'Università di Jilin, Changchun, Cina.

3 Kidney Research Institute, National Clinical Research Center for Geriatria e Divisione di Nefrologia, West China Hospital dell'Università di Sichuan, Chengdu, Cina.

4 Scuola di Medicina Clinica, Università Tsinghua, Pechino, Cina.

5 Dipartimento di Nefrologia, Il primo ospedale affiliato dell'Università di Jinan, Guangzhou, Cina.