Identificazione e analisi funzionale di un bifavone come nuovo inibitore di potenziali processi aterogenici vanilloidi 4-dipendenti del recettore transitorio

Si prega di contattareoscar.xiao@wecistanche.comper saperne di più

Mazen O.Alharbi, Bidisha Dutta, Rishov Goswami, Shweta Sharma, Kaye. Lei & Shaik O. Rahaman

L'aterosclerosi, una malattia infiammatoria progressiva delle grandi arterie, costituisce il principale fattore che contribuisce al crescente carico di mortalità e morbilità correlate a malattie cardiovascolari a livello globale1. L'evento fondamentale che porta all'aterosclerosi comporta la ritenzione di particelle di lipoproteine ​​a bassa densità modificate (oxLDL) negli spazi intimi dell'aorta subendoteliale, principalmente nei punti di diramazione arteriosa2. Durante l'aterogenesi precoce, a seguito di disfunzione endoteliale, i monociti circolanti nel sangue trasmigrano nelle aree intime e si differenziano in macrofagi tissutali3. Negli spazi intimi aortici, il legame e l'assorbimento di oxLDL da parte dei macrofagi aiutati da recettori scavenger come SRA e CD36 crea un circuito atero-infiammatorio feedforward con conseguente sviluppo di cellule schiumose cariche di lipidi, un processo critico nell'aterosclerosi2–8. Le cascate degli eventi infiammatori provocati dalle cellule schiumose portano alla formazione di una prima striatura adiposa ed eventualmente alla comparsa di lesioni aterosclerotiche avanzate caratterizzate dalla presenza di mantello fibroso, tessuto calcificato, cellule immunitarie, proteine ​​della matrice e lipidi2–10. Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) della sottofamiglia TRPV, un canale cationico polimodale non selettivo permeabile al Ca2 plus è espresso ubiquitariamente in vari tipi cellulari, inclusi i macrofagi11-24. Precedentemente noto come osmosensore, TRPV4 è ora noto per rispondere a molteplici stimoli biochimici e biomeccanici tra cui calore, rigidità della matrice, osmolarità, fattori di crescita, pH e 4 esteri del forbolo11–24. È stato riferito che il TRPV4 media diverse funzioni fisiologiche come la sensazione di dolore nell'infiammazione e nelle neuropatie18,22,23, la differenziazione e la migrazione dei miofibroblasti 17,25,26 e la differenziazione degli osteoclasti nell'osso27. Le mutazioni di TRPV4 sono state associate a diverse canalopatie28-31. Studi recenti del nostro gruppo e di altri hanno implicato un possibile ruolo di questo canale in una miriade di condizioni patologiche come lesioni polmonari22,32, formazione di cellule schiumose14,16, fbrosi tissutale17,33, risposta da corpo estraneo13 e cancro34,35. In precedenza, è stato dimostrato un ruolo ateroprotettivo del TRPV4, in cui è stato dimostrato che la funzione TRPV4 indotta da agonisti chimici nelle cellule endoteliali è associata all'attivazione di eNOS e all'inibizione dell'adesione dei monociti alle cellule endoteliali36. Al contrario, le carenze nelle funzioni del TRPV4 sono state collegate a numerose risposte ateroinfiammatorie tra cui la disfunzione endoteliale, la ridotta generazione di cellule schiumose dei macrofagi e le malattie vascolari14,16,37-39. Il nostro laboratorio ha recentemente identificato un ruolo proaterogeno di TRPV4 per cui regola la formazione di cellule di schiuma di macrofagi indotta da oxLDL. Meccanicamente, abbiamo dimostrato che TRPV4 influenza l'assorbimento ma non il legame di oxLDL nei macrofagi in modo indipendente dal CD36-14. In un altro studio, abbiamo riportato un'esacerbazione dipendente da TRPV4-della formazione di cellule schiumose indotta da oxLDL in presenza di lipopolisaccaride e aumento della rigidità della matrice, fornendo così un collegamento tra meccanosensing e rischio di aterosclerosi16. Considerati tutti insieme, questi risultati suggeriscono che il TRPV4 sia un bersaglio attraente nell'aterosclerosi e in altre malattie, incentivando così la scoperta di inibitori di piccole molecole di TRPV4 che possono essere tradotti in terapie clinicamente efficaci. Gli usi dei composti naturali in terapia hanno acquisito importanza, principalmente spinti dalla necessità di composti economici e biocompatibili rispetto alle droghe sintetiche attualmente esistenti. Composti naturali comeflavonoidi, alcaloidi,polifenolie curcuminoidi, colpiscono le malattie cardiovascolari attraverso diversi meccanismi come l'inibizione diproinfiammatoriosegnali, sensibilizzazione all'insulina e miglioramento dei profili lipidici nel sangue prendendo di mira le vie AMPK, COX1/2, eNOS e Nrf240-45. Studi recenti di più gruppi hanno identificato due flavonoidi, la berberina e l'apigenina, come potenziali modulatori dell'attività del TRPV446,47. Abbiamo sviluppato e utilizzato un metodo di screening semi-high-throughput per identificare potenziali antagonisti di TRPV4 da una libreria di composti naturali utilizzando un test di afflusso di Ca2 plus basato su Fluorometric Imaging Plate Reader (FLIPR). Qui riportiamo l'identificazione e l'analisi funzionale di Linkedin, un flavone, come un nuovo inibitore dei processi aterogenici dipendenti da TRPV4- nei macrofagi, ponendo così le basi per ulteriori studi su questo composto naturale come un piccolo antiaterosclerotico naturale composto molecolare. Linkedin è stato segnalato per mostrare neuroprotettivo,anticancerogeno, eantinfiammatorioruoli48,49. Riportiamo il meccanismo d'azione di Linkedin contro TRPV4 nell'impostazione della formazione di cellule di schiuma di macrofagi utilizzando numerosi saggi biochimici e cellulari.

Per favore clicca qui per saperne di più

Materiali e metodi Colture animali e cellulari

Abbiamo acquistato topi congeniti C57BL/6 wild type (WT) da Charles River Laboratories (Wilmington, Massachusetts, USA). Le linee guida del Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Maryland sono state seguite per tutti gli esperimenti sugli animali e gli autori hanno rispettato le linee guida ARRIVE. Per l'isolamento dei macrofagi residenti murini (MRM) indotti da tioglicolato, il lavaggio peritoneale è stato raccolto dopo 4 giorni di iniezione intraperitoneale di tioglicolato e le cellule sono state mantenute nel 10% di siero bovino fetale (FBS) contenente DMEM7,14,16. Una linea cellulare di macrofagi murini (RAW264.7) e fibroblasti dermici umani (HDF) sono stati acquistati da ATCC (Manassas, VA) e sono stati coltivati, rispettivamente, con DMEM o MEM (Gibco, Waltham, MA). I macrofagi murini derivati ​​dal midollo osseo (BMDM) sono stati raccolti da 6- a 7- topi di una settimana, come descritto in precedenza14,50,51. In breve, sono stati raccolti femori da topi WT e TRPV4 KO e il midollo osseo dei femori è stato lavato via con un supporto DMEM completo con FBS al 10%. Le cellule del midollo osseo in sospensione sono state filtrate attraverso un colino da 70 µm (BD bioscience), centrifugate e mantenute in mezzo DMEM integrato con M-CSF (25 ng/mL) per 7-8 giorni a 37 gradi per consentire la differenziazione in macrofagi.

Reagenti

Linkedin e GSK1016790A (GSK101) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) e il kit di analisi FLIPR Calcium 6 è stato ottenuto da Molecular Device (Sunnyvale, CA). LDL nativo umano (VLDL) è stato acquistato da Stemcell Technologies (Vancouver, Canada). Abbiamo incubato LDL con 5 µM CuSO4 per 12 ore a 37 gradi per preparare LDL rame ossidato (oxLDL)7,14,16. Colorante fluorescente etichettato, DiI-oxLDL, è stato acquistato da Invitrogen (Carlsbad, CA) e MCSF da R&D (Minneapolis, MN). Gli anticorpi per l'analisi FACS erano: TRPV4 (Millipore; Burlington, MA), CD36 (R&S; Minneapolis, MN), TLR4 e TLR6 (Novus Biologicals; Centennial, CO). Gli anticorpi secondari coniugati con PE provenivano da ricerca e sviluppo (Minneapolis, MN) e i controlli isotipici coniugati con PE provenivano da BD (Franklin Lake, NJ). Per la reazione a catena della polimerasi quantitativa (qRT-PCR), abbiamo utilizzato il kit RNeasy di QIAGEN (Redwood City, CA). Tutti i primer sono stati acquistati da Bio-Rad (Hercules, CA). I terreni di coltura cellulare, i prodotti correlati alla coltura cellulare e i reagenti per western blot sono stati ottenuti da Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA).

Cistanche per l'anti-fatica

Screening ad alto rendimento

Abbiamo intrapreso uno screening semi-high-throughput per gli antagonisti di Trpv4 da una libreria di 2000 composti naturali (MSSP-2000, Johns Hopkins Chemcore) utilizzando un test di afflusso di calcio basato su un lettore di lastre per imaging fluorometrico (FLIPR)14,17. Abbiamo identificato il ginkgetin (GGT), come un nuovo antagonista del TRPV4. Lo screening primario e secondario è stato eseguito con RAW264.7, HDF e BMDM per valutare la capacità di Linkedin e di altri candidati di inibire il Ca2 più infux14,17 generato da TRPV4-. Come controlli, abbiamo utilizzato A23187, uno ionoforo di calcio, BMDM nulli TRPV4 e GSK219, un antagonista selettivo di TRPV417. Dopo lo screening secondario, abbiamo identificato sei composti che mostravano un'inibizione più che tripla del Ca2 mediato da TRPV4-più afflusso di Ca2 rispetto al controllo del veicolo. Linkedin è stato identificato come il più potente inibitore dell'attività del TRPV4. I BMDM (5 × 104 cellule/pozzetto) sono stati seminati in piastre nere ben trasparenti rivestite di collagene (10 µg/ml) 96- e incubate a 37 gradi, 5% di CO2. Il giorno dell'esperimento, le cellule sono state caricate con colorante di calcio 6 in HBSS, HEPES 20 mM, probenecid 2,5 mM e incubate per 45 minuti a 37 gradi. Dopo l'incubazione, i composti della libreria sono stati aggiunti a ciascun pozzetto fino a una concentrazione finale di 2 µM. Le piastre sono state incubate per altri 45 minuti a 37 gradi. L'afflusso di Ca2 più è stato indotto dall'aggiunta di 10 nM di agonista TRPV4 GSK1016790A in cellule pretrattate con veicolo o composto e registrato misurando ΔF/F (Max-Min), come precedentemente descritto17. I dati sono mostrati come unità di fluorescenza relativa (RFU).

Immunoblot

I macrofagi peritoneali provocati dal tioglicolato sono stati seminati in FBS al 10% contenente DMEM e incubati durante la notte. Le cellule non aderite sono state lavate e l'1% di albumina di siero bovino (BSA) contenente DMEM è stato aggiunto alla piastra e incubato per 3 ore prima del trattamento con Linkedin. Per determinare l'espressione delle proteine ​​CD36, TRPV4, TLR2, TLR4, TLR6 e GAPDH, sono stati preparati lisati di cellule intere da cellule trattate durante la notte con Linkedin (1 e 5 µM) o veicolo in presenza o assenza di oxLDL (25 µg/ml ). Per determinare i livelli di espressione di p-JNK e JNK attivati ​​da LPS, le cellule sono state pretrattate con Linkedin (5 e 10 µM) per 3 ore e quindi stimolate con E. coli LPS per 30 minuti. I lisati a cellule intere sono stati preparati da cellule lavate due volte (PBS ghiacciato) utilizzando il tampone RIPA con aggiunta di cocktail di inibitori della proteasi (Thermo Scientific, MA). Le macchie sono state analizzate con coniglio anti-TRPV4 (Alomone Lab, Gerusalemme, Israele), anti-topo CD36 (R&S, Minneapolis, MN), coniglio anti-TLR4, coniglio anti-TLR6, coniglio anti-JNK e coniglio anti-p- Anticorpi primari JNK (Cell Signaling, Danvers, MA) seguiti da anticorpi secondari coniugati con HRP anti-coniglio e anti-topo (R&S, Minneapolis, MN). Le macchie sono state rimosse e ri-sondate con IgG anti-GAPDH (1:2000; Santa Cruz, Dallas, TX) per il controllo del carico.

Formazione di cellule schiumose.L'MRM innescato da tioglicolato è stato seminato su vetrini coprioggetto in una piastra da 12 pozzetti con DMEM, 10 percento di FBS e incubato a 37 gradi, 5 percento di CO2 per 2 ore. GGT (1 o 10 µM) è stato aggiunto alle cellule e, dopo 3 ore di incubazione, è stato aggiunto oxLDL (50 µg/ml) e le colture sono state incubate per una notte a 37 gradi. LDL nativo (50 ug/ml) è stato aggiunto ai pozzetti del gruppo di controllo e incubato per una notte. Le cellule sono state fissate in paraformaldeide al 4% seguita da colorazione Oil Red O per quantificare la generazione di cellule di schiuma.

Trasduzione del vettore di adenovirus.Abbiamo raccolto costrutti di adenovirus per esprimere Ad(RGD)-mouse TRPV4 (Ade-TRPV4; ~ 1010 pfu/ml) e vettore bianco di adenovirus, Ad(RGD)-CMV-null (Ade-Vec; 1011 pfu/ml), da Vector Biolabs, Malvern, Pennsylvania. Abbiamo usato 1 × 108 pfu/ml per tutti gli esperimenti. Per gli studi sulla generazione di cellule di schiuma, i macrofagi peritoneali di topo sono stati incubati con Ade-TRPV4 o Ade-Vec in supporti DMEM per 72 ore prima dell'aggiunta di oxLDL per generare cellule di schiuma di macrofagi.

Legame e assorbimento di ox-LDL.Per valutare il legame, i macrofagi peritoneali sono stati trattati con due dosi (1 o 10 µM) di Linkedin o veicolo per 3 ore e incubati con DiI-oxLDL a 4 gradi per un'ora. Dopo il pretrattamento con Linkedin o veicolo, le cellule sono state incubate con DiI-oxLDL a 37 gradi per 30 minuti per valutare l'assorbimento. Le immagini sono state catturate mediante microscopia a fluorescenza (63x) e l'immagine J è stata utilizzata per quantificare i risultati.

Analisi di citometria a flusso.I macrofagi peritoneali provocati dal tioglicolato sono stati coltivati ​​in DMEM, FBS al 10% per 24 ore. Le cellule non aderite sono state lavate via, è stato aggiunto un mezzo privo di siero e le cellule sono state incubate per 2 ore seguite dall'aggiunta di 5 µM di GGT o veicolo e l'incubazione è stata continuata per 3 ore. Le cellule trattate sono state raschiate via dalla piastra e risospese in PBS, BSA al 2%. Le cellule sono state incubate con anticorpi primari per 45 minuti seguiti da 30 minuti di incubazione con anticorpi secondari coniugati con PE. Per acquisire i dati è stato utilizzato un citometro a flusso FACSCantoII (BD Bioscience, Ontario, Canada). Tutti i dati sono stati elaborati utilizzando il software FlowJo.

qRT‑PCR.I macrofagi indotti da tioglicolato sono stati trattati con 5 µM di Linkedin o veicolo per 3 ore; 25 µg/ml di oxLDL sono stati aggiunti al veicolo o alle cellule trattate con Linkedin e l'incubazione è stata continuata per una notte. RNeasy Micro Kit (n. 74.004) di QIAGEN è stato utilizzato per estrarre l'RNA totale e un kit universale SYBR Green One-Step di Bio-Rad è stato utilizzato per la trascrizione inversa dell'RNA. Per acquisire i dati è stato utilizzato un termociclatore touch C1000 (Bio-Rad). L'espressione di un gene è stata determinata come la quantità di mRNA gene-specifico rispetto all'mRNA di GAPDH utilizzando il metodo CT comparativo descritto nel bollettino utente del sistema Bio-Rad qRT-PCR.

Analisi statistica.I dati sono presentati come media ± SEM di triplicati biologici. È stato utilizzato il software GraphPad Prism 7.{1}} e i calcoli sono stati condotti utilizzando il test t di Student per due gruppi o l'ANOVA unidirezionale per più gruppi.

Approvazione etica.Tutti gli esperimenti sui topi sono stati condotti in conformità con le linee guida dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) e sono stati approvati dal Comitato di revisione del College Park dell'Università del Maryland.

Risultati in Semi high‑throughput screening for antagonists of TRPV4 from a library of natural compounds using a FLIPR‑based Ca2+ influx assay. A library containing a collection of structurally and functionally known natural compounds was screened using a semi high-throughput FLIPR-based Ca2+ influx assay (Fig. 1A) to investigate the modulatory effect of these compounds on TRPV4-elicited Ca2+ influx. Initial screening performed with 2000 compounds on primary human dermal fibroblasts and RAW264.7 cells identified 76 lead compounds that significantly (≥threefold) inhibited GSK101-induced (a TRPV4 specific agonist) Ca2+ influx. We performed a secondary screening of the lead compounds using the same assay on RAW 264.7 cells. We further verified and selected 6 compounds that produced reproducible and significant (>triplice; p<0.001) inhibition="" of="" trpv4-elicited="" ca2+="" influx="" in="" bmdms="" as="" compared="" to="" the="" vehicle="" control="" (fig.="" 1b).="" our="" screening="" assay="" proved="" to="" be="" a="" high="" confidence="" assay="" for="" detecting="" small="" molecule="" compounds="" with="" trpv4="" inhibitory="" effects="" as="" reflected="" by="" a="" good="" z="" factor="" value="" (0.703).="" we="" have="" used="" a23187="" (a23),="" a="" calcium="" ionophore,="" as="" the="" positive="" control,="" and="" gsk2193874="" (gsk219),="" a="" selective="" small-molecule="" chemical="" inhibitor="" of="" trpv4,="" as="" the="" negative="" control14–17.="" linkedin="" (ggt)="" was="" identified="" as="" one="" of="" the="" most="" potent="" inhibitors="" of="" trpv4="" in="" the="" screening.="" since="" previously="" published="" reports="" showed="" that="" ggt="" has="" an="" anti-inflammatory="" and="" anti-adipogenic="" effect,="" we="" selected="" ggt="" for="" further="" functional="" analysis="" on="" trpv4-dependent="" macrophage="" proatherogenic="">

Figura 1. Identificazione basata su screening semi high-throughput di Linkedin come un nuovo inibitore del TRPV4 da una libreria di composti naturali. (A) Diagramma di flusso che mostra il flusso di lavoro risultante nell'identificazione della ginkgetin come potenziale inibitore del TRPV4 da una libreria di 2000 composti naturali. (B) Registrazione rappresentante FlexStation 3 che mostra l'effetto inibitorio di 6 composti naturali sul Ca2 indotto dall'agonista TRPV4 (GSK1016790A) più afflusso nei BMDM caricati con colorante di calcio 6 durante lo screening secondario. Il pretrattamento con tutti e 6 i composti ha mostrato effetti inibitori sull'afflusso di Ca2 più dipendente da TRPV4- rispetto alle cellule pretrattate con veicolo (controllo negativo; veicolo più GSK1016790A (10 nM)) o ionoforo di calcio (A23187, 2 μM). Abbiamo usato l'antagonista TRPV4 selettivo, GSK2193874 (10 nM), come controllo negativo. Tutti gli esperimenti sono stati ripetuti tre volte in quadruplicato. RFU: unità di fluorescenza relativa.

L'inibizione di TRPV4 da parte di GGT abroga la formazione di cellule schiumose macrofagiche indotta da oxLDL.I nostri studi precedenti hanno dimostrato che l'afflusso di Ca2 più provocato da TRPV4- è coinvolto nella formazione di cellule di schiuma mediata da oxLDL 14,16. Pertanto, abbiamo valutato la possibilità che la formazione di cellule di schiuma fosse inibita dall'antagonizzazione mediata da GGT dell'attività di TRPV4. I macrofagi peritoneali murini di tipo selvaggio sono stati incubati con oxLDL per indurre la formazione di cellule schiumose in presenza o assenza di GGT e analizzati mediante colorazione Oil Red O. Come previsto, abbiamo scoperto che la generazione di cellule di schiuma è aumentata di cinque volte nei macrofagi trattati con oxLDL rispetto alle LDL native (Fig. 2A, B). Tuttavia, il trattamento dei macrofagi con GGT (1 o 10 µM) prima della stimolazione con oxLDL ha ridotto significativamente la percentuale di cellule schiumose (Fig. 2A, B). Collettivamente, questi risultati suggeriscono un effetto inibitorio della GGT sulla formazione di cellule schiumose dei macrofagi, possibilmente mirando all'afflusso di Ca2 più Ca2 provocato da TRPV4-. Inoltre, abbiamo sovraespresso TRPV4 nei macrofagi nulli TRPV4 utilizzando il costrutto di adenovirus e quindi abbiamo indotto la formazione di cellule di schiuma utilizzando oxLDL in presenza di GGT. Abbiamo scoperto che la sovraespressione di TRPV4 ha aumentato la formazione di cellule di schiuma che è stata bloccata quando abbiamo pretrattato la cellula con GGT, suggerendo che l'inibizione della formazione di cellule di schiuma proaterogeniche da parte di GGT è dipendente da TRPV4 (Fig. 2C, D).

GGT non blocca il livello basale di espressione di TRPV4 e dei recettori infiammatori.Il recettore scavenger CD36 svolge un ruolo importante nell'assorbimento e nel legame di oxLDL e nella formazione di cellule schiumose, processi critici nell'aterosclerosi4–7,54,55. Recentemente, un numero crescente di prove suggerisce il coinvolgimento dei recettori toll-like nell'aterosclerosi2,4,56. Per indagare se GGT ha bloccato la formazione di cellule di schiuma influenzando l'espressione di CD36, TLR4, TLR6 e TRPV4, abbiamo eseguito l'analisi immunoblot a due concentrazioni di GGT (1 o 5 µM). Abbiamo trovato livelli di espressione simili di CD36, TRPV4, TLR6 e TLR4 rispetto al controllo non trattato (Fig. 3A-D). Anche l'analisi citometrica a flusso non ha rivelato differenze significative nell'espressione della superficie cellulare delle proteine ​​con o senza trattamento con GGT (Fig. 3E–H, I–L). Considerando tutti insieme, questi risultati suggeriscono che GGT blocca la formazione di cellule di schiuma dei macrofagi senza inibire i livelli basali di espressione superficiale di TRPV4, CD36, TLR4 e TLR6.

Figura 2. L'inibizione di TRPV4 da parte di Linkedin abroga la formazione di cellule di schiuma di macrofagi indotta da oxLDL. (A) I macrofagi peritoneali murini indotti da tioglicolato sono stati trattati durante la notte con 50 µ g/ml di oxLDL, seguiti da una preincubazione di 3 ore con veicolo o 1 o 10 µM di Linkedin. Le cellule sono state trattate con 50 µg/mL di LDL nativo (VLDL) come controllo. Ingrandimento originale: 40x. (B) La quantificazione dei risultati è mostrata in (A). n{10}} celle/condizione. Test t dello studente; ***p<0.001. data="" represent±sem.="" (c)="" trpv4="" ko="" rpms="" were="" transduced="" with="" either="" ade-vec="" or="" ade-trpv4="" and="" were="" untreated="" or="" treated="" with="" ggt="" in="" the="" presence="" of="" oxldl="" for="" 16="" h="" on="" day="" 5="" of="" transduction="" for="" macrophage="" foam="" cell="" formation.="" (d)="" quantification="" of="" the="" results="" shown="" in="" c.="" n="100" cells/condition.="" student's="" t-test;=""><>

Assorbimento di oxLDL, ma non il legame con i macrofagi è soppresso dal GGT. Poiché è stato precedentemente dimostrato che TRPV4 ha un ruolo nell'assorbimento dell'oxLDL e nella formazione di cellule schiumose14,16, abbiamo valutato se il trattamento con GGT ha causato una compromissione del legame dell'oxLDL sulla superficie dei macrofagi. I macrofagi peritoneali WT sono stati trattati con GGT prima dell'incubazione con DiI-oxLDL a 4 gradi ed è stato valutato il legame. I risultati indicano che il legame di oxLDL sulla superficie dei macrofagi non è stato significativamente impedito dal trattamento con GGT (1 o 10 µM) rispetto al controllo del veicolo (Fig. 5A-C). Avendo stabilito che la GGT non inibisce il legame di oxLDL, abbiamo quindi mirato a determinare se l'assorbimento di oxLDL nei macrofagi fosse compromesso dal trattamento con GGT. È interessante notare che i nostri risultati hanno indicato che c'era un'inibizione significativa nell'assorbimento di oxLDL nei macrofagi nelle cellule pretrattate con GGT rispetto al gruppo trattato con veicolo (Fig. 6A, B). Considerando tutti insieme, questi risultati suggeriscono che GGT blocca l'assorbimento di oxLDL, ma non lega, nei macrofagi.

GGT blocca l'espressione indotta da oxLDL di TRPV4 nei macrofagi.

Poiché i nostri studi precedentemente pubblicati hanno dimostrato che il Ca2 plus indotto da TRPV4-svolge un ruolo nella formazione di cellule di schiuma macrofagiche mediata da oxLDL14,16, abbiamo cercato di determinare se la GGT bloccasse la formazione di cellule di schiuma attraverso la soppressione dell'espressione di CD36 indotta da oxLDL, TLR2, TLR4, TLR6 o TRPV4. Abbiamo scoperto che la stimolazione notturna dei macrofagi con oxLDL ha comportato una significativa sovraregolazione dell'espressione delle proteine ​​​​TRPV4 rispetto alle LDL, mentre l'espressione di altri recettori (CD36, TLR2, TLR4 e TLR6) è rimasta invariata (Figg. 4A-F). Il pretrattamento delle cellule con GGT prima della stimolazione con oxLDL ha ridotto selettivamente il livello di espressione delle proteine ​​​​TRPV4 rispetto al trattamento del veicolo (Fig. 4A-F). Collettivamente, questi risultati suggeriscono un effetto inibitorio della GGT sull'espressione della proteina TRPV4, che può essere in parte coinvolta nella soppressione della formazione di cellule schiumose da parte del GGT.

Figura 3. Il trattamento con Linkedin non altera la proteina totale o l'espressione superficiale di TRPV4, CD36 e TLR nei macrofagi. (A-D) Immunoblot di lisati di cellule intere di macrofagi dopo il trattamento notturno con 1 o 5 µM di Linkedin o veicolo. Gli immunoblot rappresentativi mostrano l'espressione proteica totale di CD36 (A), TRPV4 (B), TLR6 (C) e TLR4 (D) in cellule trattate con Linkedin e non trattate. Sono state eseguite tre repliche biologiche indipendenti e 3 ripetizioni sperimentali per ciascuna serie di esperimenti. (E-H) Analisi citometrica a flusso di macrofagi trattati durante la notte con 5 µM di Linkedin o non trattati che mostrano l'espressione superficiale di TRPV4 (E), CD36 (F), TLR4 (G) e TLR6 (G) in cellule non trattate e trattate con Linkedin. Sono stati analizzati tre replicati biologici indipendenti e 30,{18}} cellule per condizione. (I–L) Analisi quantitativa dei risultati di (E–H). Analizzato dal test t a due code con intervallo di confidenza del 99%. Celle contate per esperimento, 30,000; due ripetizioni sperimentali.

GGT blocca l'attivazione e l'infiammazione proaterogena di JNK2 nei macrofagi. Rapporti pubblicati dal nostro laboratorio e da altri hanno dimostrato che l'attivazione di JNK2 svolge un ruolo fondamentale nella formazione di cellule schiumose e nell'aterosclerosi7,57. Per determinare se la GGT potesse inibire l'attivazione di JNK1/2, i macrofagi sono stati trattati con GGT seguita da stimolazione con LPS o oxLDL. I risultati dell'analisi immunoblot hanno mostrato che il trattamento con GGT sopprimeva significativamente la fosforilazione indotta da oxLDL o LPS di JNK1/2 rispetto al controllo non trattato o trattato con LDL nativo (Fig. 7A-D). È stato dimostrato che l'attivazione di JNK nei macrofagi induce la trascrizione di mediatori proinfiammatori associati all'aterosclerosi58-60. Per determinare se la GGT potesse potenzialmente bloccare l'espressione di questi regolatori proinfiammatori nei macrofagi, le cellule pretrattate con GGT sono state stimolate con oxLDL e i livelli di espressione di mRNA di TNF, IL 6, IL12, IL1 e MCP1 sono stati quantificati mediante analisi qRT-PCR. Abbiamo rilevato una significativa downregulation nei livelli di espressione indotti da oxLDL di mRNA di TNF, IL12, IL1 e MCP1 nelle cellule trattate con GGT rispetto ai controlli trattati con veicolo (Fig. 7E-I). Presi insieme, questi risultati suggeriscono che GGT blocca l'attivazione proaterogena di JNK2 e l'espressione genica infiammatoria in risposta alla stimolazione oxLDL nei macrofagi. Discussione È noto che i composti naturali come i flavonoidi ei polifenoli modulano le risposte cardiovascolari attraverso diversi meccanismi, come l'inibizione dei segnali proinfiammatori, la sensibilizzazione all'insulina, lo stato ossidativo e il miglioramento dei profili lipidici nel sangue40-45. Qui, riportiamo l'identificazione e la caratterizzazione funzionale basate su screening semi-high-throughput di Linkedin, un flavone, come un nuovo inibitore dei processi proterogenici/infiammatori TRPV4-dipendenti nei macrofagi. Abbiamo specificamente dimostrato che i) la ginkgetina blocca il TRPV4- mediato dal Ca2 più l'afflusso nei macrofagi, ii) il blocco della ginkgetina della funzione del TRPV4 ha ridotto notevolmente la formazione di cellule schiumose indotta da oxLDL sopprimendo l'assorbimento di oxLDL nei macrofagi e iii) i blocchi di ginkgetin Fosforilazione indotta da LPS e oxLDL di JNK1/2, espressione delle proteine ​​TRPV4 ed espressione genica infiammatoria. Nel complesso, i risultati del nostro studio hanno mostrato che la ginkgetin inibisce la funzione proaterogena/infiammatoria dei macrofagi in modo TRPV4-dipendente. L'aterosclerosi, una malattia aortica, è inizialmente alimentata dall'infiammazione e dall'ingorgo dei macrofagi con oxLDL, inducendo la formazione di cellule schiumose dei macrofagi, che successivamente progrediscono fino a formare l'ateroma2–10. Poiché la formazione di cellule di schiuma è un processo critico nell'aterogenesi, la comprensione e la manipolazione della formazione di cellule di schiuma può avere un potenziale terapeutico. È noto che i macrofagi esprimono una serie di canali ionici e pompe che penetrano nella membrana, incluso TRPV4, un canale ionico meccanosensibile polimodale Ca2 più un canale ionico permeabile, che viene attivato da stimoli sia fisici che biochimici11-24. Studi pubblicati dal nostro laboratorio e da altri hanno identificato il ruolo del TRPV4 nell'infiammazione dei macrofagi e nella formazione di cellule schiumose indotta da oxLDL14–16,26. TRPV4 può quindi fungere da bersaglio praticabile per l'attenuazione dei processi proaterogeni.

Figura 5. Linkedin non sopprime il legame DiI-oxLDL ai macrofagi. I macrofagi sono stati pretrattati con veicolo o Linkedin (1 o 10 µM) per 3 ore seguiti da incubazione con oxLDL marcato con DiI (2,5 µg/mL) per 1 ora a 4 gradi. (A) Immagini microscopiche rappresentative a fluorescenza (ingrandimento originale, 63 ×) del legame DiI-oxLDL sulla superficie della membrana dei macrofagi (n=20 cellule/condizione). (B) Risultati dell'esperimento A mostrati come profilo di trama utilizzando il software NIH ImageJ. (C) Analisi quantitativa dei risultati di A. n=20 celle/condizione. nel migliorare l'aterosclerosi riducendo MMP-2 e MMP-9 e aumentando i livelli di NO e NOS nell'aorta toracica del ratto52. Nel presente studio, abbiamo dimostrato che la ginkgetin blocca il TRPV4-elicitava l'afflusso di Ca2 più nei macrofagi. Meccanicamente, abbiamo dimostrato che la ginkgetin blocca l'assorbimento di oxLDL, ma non si lega, nei macrofagi. Studi condotti in vivo e in vitro hanno suggerito un ruolo critico del CD36 come principale recettore scavenger nell'assorbimento dell'oxLDL e nella formazione di cellule schiumose dei macrofagi2–7. È stato dimostrato che i topi null CD36 privi di ApoE o LDLR sono meno inclini a sviluppare lesioni aterosclerotiche5,6. Precedenti studi del nostro gruppo hanno identificato un ruolo essenziale della cascata di segnalazione CD36-JNK nella formazione delle cellule schiumose dei macrofagi7. I recettori Toll-like TLR2, TLR4 e TLR6 agiscono come corecettori interagendo con CD36 e hanno dimostrato di essere coinvolti nell'aterogenesi2,56,63. Abbiamo esaminato la possibilità che la mancanza di formazione di cellule schiumose osservata nei macrofagi trattati con Linkedin fosse dovuta alla ridotta espressione delle proteine ​​​​CD36, TRPV4, TLR2, TLR4 o TLR6. È interessante notare che il trattamento con Linkedin non ha ridotto significativamente l'espressione delle proteine ​​​​CD36, TLR2, TLR4 o TLR6 a livelli basali o in condizioni stimolate da oxLDL. Tuttavia, Linkedin ha bloccato specificamente la sovraregolazione indotta da oxLDL dell'espressione delle proteine ​​​​TRPV4, mentre la sua espressione a livelli basali è rimasta invariata. Considerando tutti insieme, questi risultati suggeriscono che la ginkgetin blocca la formazione di cellule di schiuma indotta da oxLDL tramite un meccanismo indipendente dall'espressione di CD36 e TLR, ma dipendente da TRPV4. Precedenti studi del nostro gruppo e di altri hanno mostrato che l'attivazione di JNK2 è coinvolta nella formazione di cellule schiumose e nello sviluppo di lesioni aterosclerotiche7,57. È stato inoltre riportato che JNK è coinvolto nella modulazione di MMP-9 e MMP-13, che sono sovraespresse nelle lesioni aterosclerotiche64-68. Dato il legame riconosciuto di JNK nei processi aterogenici, volevamo determinare se la ginkgetin potesse inibire l'attivazione di JNK. In accordo con i rapporti precedenti, i nostri risultati hanno anche mostrato che la ginkgetin blocca la fosforilazione di JNK2 indotta da stimoli infiammatori nei macrofagi. Questo risultato suggerisce un possibile meccanismo mediante il quale Linkedin blocca la formazione delle cellule della schiuma. Inoltre, abbiamo riscontrato una significativa downregulation nell'espressione indotta da oxLDL di mRNA di TNF, IL12, IL1 e MCP1 nelle cellule trattate con ginkgetin rispetto al controllo del veicolo, evidenziando i potenziali ruoli antinfiammatori della ginkgetin in risposta a oxLDL. In sintesi, i nostri risultati hanno mostrato che la ginkgetin inibisce la funzione proaterogena e infiammatoria dei macrofagi in modo TRPV4-dipendente. Questi risultati rafforzano così il razionale per l'uso di composti naturali nello sviluppo di potenziali reagenti terapeutici e/o chemiopreventivi.

Riferimenti
1. Barquera, S. et al. Panoramica globale dell'epidemiologia della malattia cardiovascolare aterosclerotica. Arco. Med. ris. 46, 328–338 (2015).
2. Moore, KJ & Tabas, I. Te biologia cellulare dei macrofagi nell'aterosclerosi. Cella 145, 341–355 (2011).
3. Libby, P. Infiammazione nell'aterosclerosi. Natura 407, 233–241 (2002).
4. McLaren, JE, Michae, DR, Ashlin, TG e Ramji, DP Citochine, metabolismo lipidico dei macrofagi e cellule schiumose: implicazioni per la terapia delle malattie cardiovascolari. prog. Ris. lipidi 50, 331–347 (2011).
5. Febbraio, M. et al. L'interruzione mirata del recettore scavenger di classe B CD36 protegge dallo sviluppo di lesioni aterosclerotiche nei topi. J.Clin. Investire. 105, 1049–1056 (2000).
6. Kunjathoor, VV et al. I recettori scavenger di classe AI/II e CD36 sono i principali recettori responsabili dell'assorbimento della lipoproteina a bassa densità modificata che porta al carico lipidico nei macrofagi. J. Biol. Chimica. 277, 49982–49988 (2002).
7. Rahaman, SO et al. Per la formazione delle cellule schiumose dei macrofagi è necessaria una cascata di segnalazione CD36-dipendente. Metabolismo cellulare 4, 211–221 (2006).
8. Ross, R. Aterosclerosi, una malattia infiammatoria. N inglese J Med. 340(2), 115–126 (1999).
9. Libby P. Te meccanismi molecolari delle complicanze trombotiche dell'aterosclerosi. J. Stagista. Med. 517–527, 2008.
10. Lusis, AJ Aterosclerosi. Natura 407, 233–241 (2000).
11. Matthews, BD et al. Attivazione ultrarapida dei canali ionici TRPV4 mediante forze meccaniche applicate alle integrine beta1 della superficie cellulare. Numero intero. Biol. (Cambo). 2(9), 435–442 (2010).
12. Sharma, S., Goswami, R. & Rahaman, SO Te TRPV4-Asse di segnalazione della meccanotrasduzione TAZ nella rigidità della matrice e transizione epiteliale-mesenchimale indotta da TGF 1-. Cella Mol. Bioing.12, 139–152 (2019).
13. Goswami, R., Arya, RK, Biswas, D., Zhu, X. & Rahaman, SO Il potenziale recettore transitorio vanilloide 4 è richiesto per la risposta da corpo estraneo e la formazione di cellule giganti. Sono. J. Pathol. 189(8), 1505–1512 (2019).
14. Goswami, R. et al. Il canale permeabile al calcio TRPV4 è un nuovo regolatore della formazione di cellule di schiuma di macrofagi ossidate indotte da LDL. Radicale libero. Biol. Med. 110, 142–150 (2017).