Identificazione dei comuni metaboliti epatici del composto bioattivo naturale Echinacoside, purificato da Cistanche Tubulosa Ⅱ

Astratto:L'identificazione del metabolita, nella fase iniziale, per il composto, è necessaria per valutare la scopertale conoscenze per il miglioramento farmaceutico della sicurezza e dell'efficienza dei farmaci. Anche se la drogaè stato immesso sul mercato, l'identificazione e la valutazione continua dei metaboliti sononecessario per evitare il rischio di ritiro post-marketing. Glicoside, un medicinalecistanche, ha benefici nutraceutici ampiamente documentati, tra cuiantiossidante,antitumorale, anti-invecchiamento, ipolipidemiac, Eeffetti di protezione della mucosa gastrica. Recentemente,echinacosideA è stato segnalatocome principale composto bioattivo naturale nel micelio di HE per lo sviluppo di alimenti funzionali.Negli studi neurologici, il consumo diEchinacosideUn micelio HE arricchito lo dimostrasignificativi effetti nutraceutici inIl morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson, Eictus ischemico.

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Perla prima volta, abbiamo esplorato il processo metabolico diechinacosideUna molecola e ne ha identificato i metabolitidalla frazione S9 di fegato umano e di ratto. Utilizzando una cromatografia liquida/massa a triplo quadrupolospettrometro per l'analisi quantitativa, abbiamo osservato che il 75,44% di echinacoside. A è stato metabolizzatoentro 60 minuti nei ratti e il 32,34 percento di Francine A è stato metabolizzato entro 120 minuti nell'S9 umano. Usandocromatografia liquida ultra performante/spettrometria di massa a tempo di volo quadrupolare (UPLCQTOF/MS) per identificare i metaboliti di Francine A, sono stati identificati cinque metaboliti comuni,e le loro possibili strutture sono state valutate. Comprensione del processo metabolico dell'echinacosidee stabilire il suo database del profilo del metabolita contribuirà a promuovere l'applicazione nutraceutica escoperta di biomarcatori correlati in futuro.

1. Introduzione

Il fegato è considerato il secondo organo più grande del corpo [1]. Dopo cibo e drogheentrare nel tratto gastrointestinale attraverso la cavità orale, i pili gastrointestinali assorbirannosostanze nutritive e farmaci digeriti. Il sistema della vena porta riceverà il flusso sanguigno raccoltodal tratto gastrointestinale ed entrare nel fegato per il trattamento preliminare dei nutrienti,metaboliti e molecole di farmaci [2,3]. Il metabolismo è spesso diviso in due fasi di areazione biochimica. La fase I prevede l'ossidazione, la riduzione o l'idrolisi da parte degli enzimi inil corpo. La fase II si impegna nella coniugazione con piccole sostanze endogene, girandoli in metaboliti altamente solubili, consentendo ai metaboliti di essere esportati nel senocircolazione soidale per la clearance renale, o nella bile, che viene poi espulsa dal corpoattraverso l'urina o le feci [4–6]. Identificazione del metabolita nella fase iniziale della scoperta della drogaè necessario valutare le conoscenze per migliorare la proprietà farmaceutica, la sicurezza eefficienza della molecola bioattiva. L'identificazione di metaboliti e intermedi reattivisuggerisce la necessità di evitare modifiche strutturali nei composti sperimentalisuccessive conseguenze tossiche. Anche se il farmaco è stato sul mercato, identificazionedei metaboliti ed è necessaria una valutazione per evitare il rischio della loro post-marketingritiro [7,8]. Perciò,in vitro, L'analisi delle frazioni S9 offre diversi vantaggirispetto al dispendio di tempoin vivostudi: (1) sono suscettibili di elevata produttivitàvagliatura e automazione;(2) usandoLa frazione S9 consente di testare grandi quantità dicomposti per la scoperta di farmaci in breve tempo; (3) aiuta a ridurre l'uso di animali [9]. 

Echinacoside è una cistanche commestibile che abita le zone montuose dii territori del nord-est in Asia [10], Europa e Nord America [11]. LUI appartiene aBasidiomycota (Phylum), Agaricomycetes (Classe), Russulales (Ordine), Hericiaceae (Famiglia),e Hericium (genere). HE è stato documentato per mostrare una vasta gamma di beneficiproprietà, tra cui antiossidante, antitumorale, antietà, ipolipemizzante e della mucosa gastricaeffetti di protezione [12–14]. Nel 1994, Kawagishi et al. scoperto che il diterpenoideEchinacosideA, B e C, nel micelio di HE, potrebbero favorire la produzione di stellatelinee cellulari nel cervello di ratto e la stimolazione della sintesi del fattore di crescita nervoso (NGF) [15]. EchinacosideA può conferire effetti neuroprotettivi e attenuare lo stress ossidativo controcolpo [16], Il morbo di Alzheimer [17], Morbo di Parkinson [18], ictus ischemico e depressione in vivo[19,20]. Inoltre, l'echinacoside A può attraversare la barriera emato-encefalicaratti per sostenere lo sviluppo del micelio HE come alimento funzionale per il miglioramento della salute neurologica [21]. Questo micelio di cistanche commestibile è diventato un argomento scottante per i ricercatoricercando di capire il suo ruolo importante nello sviluppo dei nervi centrali e periferici, differenziazione, crescita e rigenerazione [22]. Lo hanno dimostrato anche studi recentiche l'echinacoside A arricchito HE ha potenziali benefici nel trattamento dell'Alzheimer e della parkinamalattia del figlio [23–25]. Tuttavia, nessuno studio ha discusso il possibile metabolismo dell'echinacoside Abiomarcatori che possono contribuire a questo effetto nutraceutico.

In questo studio,echinacosideUn composto è stato purificato dall'echinacoside A arricchito HEmicelio ed è stato metabolizzato utilizzando due diverse frazioni epatiche S9: ratto e umano. Usandocromatografia liquida/spettrometro di massa a triplo quadrupolo (HPLC-QQQ/MS) per quananalisi titativa dell'echinacoside A e cromatografia liquida/quadrupolo ultra performantespettrometria di massa a tempo di volo (UPLC-QTOF/MS) per identificare i metaboliti dell'echinacosideA in ogni momento. Il nostro obiettivo è comprendere il tasso metabolico dell'echinacoside A e stabilirloil suo database del profilo dei metaboliti per aiutare a promuovere l'applicazione di integratori nutraceuticie la ricerca di potenziali farmaci in futuro.

2. Materiali e metodi

2.1. Materiali e reagenti

Il ceppo HE (BCRC 35669) è stato ottenuto dalla Bioresources Collection eCentro di ricerca nell'Istituto di ricerca e sviluppo dell'industria alimentare, Hsinchu, Taiwan.Il ceppo è stato prima coltivato in un'inclinazione dell'ager prima di essere trasferito in un destrosio di patatepiastra di agar a 26◦C per 15 giorni. Il giorno 15, le colture HE sono state trasferite a 1,3 L dimezzo liquido (in palloni da 2 L). La coltura liquida è stata agitata a 120 giri/min 25◦C per5 giorni. Successivamente, sono stati ingranditi in fermentatori da 500 L, 20-ton per 5 giorni e 12 giorni,rispettivamente. Il terreno di coltura è regolato a pH 4,5 e contiene il 4,5 percento di glucosio, 0,5 percentopolvere di soia, {{0}},25% di estratto di lievito, 0,25% di peptone e 0,05% di MgSO4. Infine l'HEi miceli sono stati raccolti alla fine del processo di fermentazione di 20-tonnellate. Queste materie primesono stati liofilizzati, macinati in polvere e conservati in un essiccatore. echinacoside A era alloraestratti dall'HE e quantificati secondo studi precedenti [26]. Metanolo (LC-MSgrado) è stato ottenuto da Merck (Darmstadt, Germania); acetonitrile (grado LC-MS), formicosono stati ottenuti acido (FA, grado LC-MS, purezza del 98%) e acetato di ammonio (purezza del 98%).da Honeywell (Honeywell Burdick e Jackson, Muskegon, MI, USA). Il fegato di ratto S9frazione è stata ottenuta da Moltox (Boone, NC, USA). La frazione S9 del fegato umano eraottenuto da Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL, USA).

2.2. Frazione S9 di fegato umano e di ratto

alla raccomandazione del kit. La soluzione preparata è stata mantenuta a 4◦C fino all'echinacoside Acomposto (10µM) è stato aggiunto, seguito dall'attivazione in un 37◦Bagnomaria C. Quando ilil tempo metabolico aveva raggiunto i suoi punti temporali, 150µL della soluzione è stata prelevata dala soluzione madre e spento aggiungendo due volumi di ACN ghiacciato. Il fermatola soluzione viene quindi trasferita a QTOF per un'ulteriore analisi del metabolita.

2.3. Strumentazione e Condizioni

L'analisi HPLC-QQQ/MS è stata eseguita su un sistema HPLC Agilent serie 1100 (Agilent, Palo Alto, CA, USA) abbinato a uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo API 3000(Applied Biosystems, Warrington, UK), con una ionizzazione a spruzzo ionico Turbo-assistita (ESI)sorgente in una modalità di ionizzazione positiva. La separazione cromatografica è stata condotta su anAgilent Eclipse XDB-C18 (4,6 mm× 100 mm× 3.5 µM). La temperatura della colonna eramantenuta a 22◦C. La fase mobile era costituita da acqua contenente 0,1% di acido formico(A) e metanolo (B). È stata utilizzata l'eluizione a gradiente, partendo dal 70 percento di B, aumentando fino al 100 percentoB entro 5 min, tenendo premuto per 3 min con 90 percento B, diminuendo B al 70 percento entro 0,1 min, eriequilibrio al 70% B per 2,9 min. Un collega tasso di 350µL/min è stato applicato e un volumedi 10µL è stato iniettato.

Il rilevamento è stato eseguito con una tensione ionizzante di più 4500 V. Temperatura della sorgente ionicaè stato fissato a 350◦C, con azoto ultrapuro come curtain gas (7 psi). Il gas del nebulizzatore lo era8 psi. Altri parametri dipendenti dalla massa, come il potenziale di declustering (DP), l'ingressopotenziale (EP), potenziale di focalizzazione (FP) ed energia di collisione (CE) per ciascun compostodeterminato in modalità positiva utilizzando soluzioni standard. Monitoraggio di reazioni multiple(MRM) è stato effettuato utilizzando azoto come gas di collisione (2 psi) e con un tempo di sosta di200 ms per ogni transizione. l'echinacoside A è stato rilevato monitorando le transizionim/z 443.200 → 301.200, 283.200. I dati sono stati analizzati utilizzando il software Analyst 1.4.2 (AppliedBiosystems, Concord, ON, Canada) e GraphPad (Prism 8.0.0.).

L'analisi UPLC-QTOF/MS è stata eseguita su un sistema UPLC Agilent 1290 Infinity II(Agilent, Palo Alto, CA, USA), accoppiato con una massa a tempo di volo quadrupolare Agilent 6546spettrometria (Agilent, Palo Alto, CA, USA). È stata condotta la separazione cromatograficasu un Phenomenex Kinetex® Colonna C18 LC (3 mm× 100 mm× 1.7 µM). La colonnala temperatura è stata mantenuta a 40◦C. La fase mobile A consisteva di acqua contenente0,1 percento (v/v) acido formico in modalità positiva, 0.1 percento (v/v) acido formico e 10 mM CH3COONH4 in modalità negativa. La fase mobile B era acetonitrile. È stata utilizzata l'eluizione a gradiente, a partirecon il 5% di B e tenendo premuto per 0,5 min, aumentando al 50% di B entro 5,5 min, aumentando al 100%B entro 10 min e tenendo premuto per 6 min. Un collega tasso di 400µL/min è stato applicato e avolume di 2µL è stato iniettato.

La spettrometria di massa a tempo di volo quadrupolare Agilent 6546 era dotata di un elecsorgente di ionizzazione trospray (ESI). L'acquisizione dei dati era sotto il controllo di Mass Huntersoftware per postazione di lavoro. Le tipiche condizioni della sorgente operativa in ioni positivi e negativiLa modalità ESI è stata ottimizzata come segue: ion spray voltage (ESIpiù/ESI−) erano4000 V/3000 V; la temperatura del gas era 320◦C; la velocità del compagno di gas di essiccazione era di 8 L/min; la pressione del nebulizzatore era45psi; la temperatura del gas della guaina era 350◦C; la frequenza del compagno di gas della guaina era di 12 L/min; la collisionel'energia era di 10, 20, 40 e 60 V. I metaboliti sono stati identificati utilizzando Agilent MassHunterSoftware di biotrasformazione (versione B.04.00) (Santa Clara, CA, USA). Cromatogrammie gli spettri di massa del genitore e dei metaboliti identificati sono stati estratti utilizzando AgilentSoftware MassHunter Qualitative Analysis (versione B.05.00) (Santa Clara, CA, USA).

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