Identificazione di EST responsivi al perossido di idrogeno coinvolti nella biosintesi del glicoside feniletanoide nella coltura cellulare di salsa di Cistanche

Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

J. CHEN et al

Astratto
Il perossido di idrogeno è un efficace elicitore abiotico che può indurre la biosintesi dei metaboliti secondari nelle piante. Mostriamo che nella coltura di sospensione cellulare di una pianta medicinale tollerante al saleCistanchesalsa, la produzione di componenti bioattivifeniletanoideglicosidi(PeGs) è stato aumentato dopo il trattamento con H2O2. Identificare i geni correlati ai PeG(feniletanoideglicosidi)biosintesi influenzata da H2O2, abbiamo costruito una libreria di ibridazione sottrattiva di soppressione di geni responsivi all'H2O2 utilizzando unCistanchesalsalinea cellulare e identificato 105 tag di sequenza espressa (EST) e 85 geni. L'annotazione funzionale della libreria EST e le analisi dell'ontologia genica hanno mostrato geni correlati a varie risposte allo stress, biosintesi di metaboliti secondari e regolazione trascrizionale. Tra questi, abbiamo identificato due geni correlati ai PeG(feniletanoideglicosidi)via di biosintesi (4-coenzima cumarato A ligasi e cinnamato 4-idrossilasi) e due fattori di trascrizione di tipo WRKY. Le espressioni dei geni selezionati dopo il trattamento con H2O2 sono state analizzate mediante RT-qPCR. Aumento precoce della trascrizione di PeG(feniletanoideglicosidi)i geni del percorso di biosintesi dopo il trattamento hanno rivelato che l'H2O2 induceva i PeG(feniletanoideglicosidi)biosintesi attraverso la sovraregolazione dei suoi geni chiave.
Parole chiave aggiuntive: cinnamato-4-idrossilasi, 4-cumarato coenzima A ligasi, soppressione ibridazione sottrattiva.Cistanchesalsa. feniletanoideglicosidi.

introduzione

Cistanchesalsaè una pianta perenne parassita della radice di Haloxylos ammodendrun e cresce nell'area desertica della Cina occidentale. Per secoli,Cistanchespecie è stata utilizzata come medicina tradizionale a base di erbe (Wang et al. 2012). I componenti bioattivi sonofeniletanoideglicosidi(PeGs) che hanno un notevole effetto sulla clearance delle specie reattive dell'ossigeno (ROS), sulla radioprotezione, sul miglioramento dell'immunità e sull'anti-invecchiamento (Nan et al. 2013). PeG(feniletanoideglicosidi)biosintesi inCistancheè iniziato dalla fenilalanina (Fig. 1 Suppl.) e l'acido caffeico sintetizzato viene ulteriormente glicosilato per formare vari PeG(feniletanoideglicosidi)(Wang et al. 2012). Tre PeG principali(feniletanoideglicosidi), echinacoside, acteoside e 2'-acetylacteoside, sono considerati i componenti più attivi inCistanche(Kobayashi et al. 1984). Al fine di migliorare il loro contenuto inCistanchecoltura cellulare, sono stati testati vari elicitori tra cui chitosano, putrescina, Ag plus e stress osmotico (Ouyang et al. 2005a,b, Cheng et al. 2005, 2006, Liu et al. 2007, Liu e Cheng 2008). Tuttavia, i geni coinvolti nei PeG(feniletanoideglicosidi)biosintesi inCistanche, principalmente i geni della via del metabolismo della fenilalanina, sono stati raramente identificati. Solo un gene codificante per la fenilalanina ammoniaca-liasi (PAL) è stato recentemente identificato in Cistanche deserticola (Hu et al. 2011). Altri geni codificanti, ad esempio, la cinnamato-4-idrossilasi (C4H), che potrebbe catalizzare la conversione del cinnamato in acido cumarico, e il 4-coenzima cumarato A ligasi (4CL), un gene essenziale per la lignina e i flavanoidi biosintesi, non sono stati trovati inCistanche.
Abbiamo usato la coltura cellulare diCistanchesalsastudiare i PeG(feniletanoideglicosidi)biosintesi e relativa espressione genica. Abbiamo anche studiato l'effetto di un efficace elicitore H2O2 sui PeG(feniletanoideglicosidi)biosintesi. Inoltre, per trovare i primi geni responsivi coinvolti nei PeG(feniletanoideglicosidi)biosintesi, abbiamo effettuato l'ibridazione sottrattiva di soppressione (SSH) per costruire una libreria di cDNA di geni H2O2-reattivi.

Fig. 1. Espressione genica relativa determinata mediante RT-qPCR dopo trattamento con H2O2. Fattore di trascrizione CsWRKY1 - WRKY (Contig07), CsC4H1 - cinnamato 4-idrossilasi (Contig09), Cs4CL1 - 4-cumarato: ligasi (Contig03), proteina da shock termico CsHSP1 - 70 kDa (Contig 01) e CsSOD1 - superossido dismutasi (Contig16). Le cellule sono state trattate con 80 ug dm-3 H2O2 in un mezzo liquido per 2 ore e le espressioni sono state confrontate con un controllo trattato con acqua. Mezzi più - SD di tre ripetizioni biologiche; * - P < 0,05,="" **="" -="" p=""><>

Materiali e metodi

La linea cellulare CS2001 è stata costituita da petali diCistanchesalsa(CA Mey.) Beck raccolto nella provincia di Neimenggu e subcoltivato. Il metodo di coltura era simile a un protocollo pubblicato in precedenza (Liu et al. 2007). In generale, per la subcoltura è stato utilizzato un mezzo solido Murashige e Skoog (1962; MS) e un mezzo liquido per PeG(feniletanoideglicosidi)biosintesi (era il mezzo MS modificato integrato con 30 g dm-3 di glucosio e 2.0 mg dm-3 indolo-3- di acido acetico). Per il trattamento con H2O2, 5.0 ± 0,2 g di cellule in un periodo di crescita rapida, solitamente da 20 a 30 giorni dopo essere state sottocolture nel mezzo solido, sono state inoculate in un mezzo liquido da 50 cm3 in un matraccio Erlenmeyer da 250 cm3 e coltivato al buio con o senza diverse concentrazioni di H2O2. I PeG(feniletanoideglicosidi)il contenuto dopo 10 giorni di induzione da parte di H2O2 è stato analizzato secondo un metodo pubblicato in precedenza (Liu et al. 2007) basato sulla cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa con eluizione in gradiente di metanolo.

Le cellule 2 ore dopo il trattamento con H2O2 sono state raccolte dal mezzo mediante carta da filtro utilizzando un imbuto Büchner, quindi sono state congelate in azoto liquido e macinate in polvere. Ogni 2 g di polvere cellulare è stato lisato utilizzando una miscela di 1 cm3 di 2-mercaptoetanolo, 1 cm3 di 200 g dm{{10}} sarcosile, e 8 cm3 di un tampone GTC (isotiocianato di guanidinio 5 M, Tris-HCl 62,5 mM, pH 8,0, EDTA 6,25 mM, pH 8,0, tiourea 5 mM e ditiotreitolo 10 mM). Le cellule sono state quindi incubate in ghiaccio per 15 minuti, quindi è stato aggiunto 1/3 di volume di CH3COOK 8,5 M, pH 6,0 e le cellule sono state incubate in ghiaccio per 15 minuti e quindi centrifugate a 15 000 g per 15 minuti . Il supernatante è stato aggiunto ad un volume uguale di isopropanolo per precipitare l'RNA totale. L'RNA totale è stato ulteriormente purificato da un mini kit RNeasy (Qiagen, Hilden, USA) secondo le istruzioni del produttore. L'RNA messaggero è stato isolato dall'RNA totale utilizzando un kit midi Oligotex mRNA (Qiagen).

feniletanoideglicosidiinCistanchesalsa

Una libreria SSH è stata generata da campioni di cellule di controllo e 30 percento H2O2-elicitazione 2 ore dopo l'elicitazione utilizzando un kit di sottrazione del cDNA PCR-select (Clontech, Mountain View, USA). Per la costruzione di librerie, i prodotti sono stati purificati separatamente utilizzando un kit di purificazione del gel (Qiagen) e clonati in un vettore pGEM utilizzando un kit di clonazione TA (Tiangen, Pechino, Cina). I plasmidi di cloni indipendenti sono stati isolati e sequenziati utilizzando il primer T7. Tutte le sequenze di tag di sequenza espresse (EST) dalla libreria (con le sequenze vettoriali rimosse) sono state utilizzate per l'assemblaggio di contig con CAP3 (http://doua.prabi.fr/software/cap3). Gli EST sono stati raggruppati in contigs e singleton; sono stati utilizzati per la ricerca di omologia utilizzando il programma BLASTx su NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Le sequenze sono state quindi annotate, analizzate e classificate in base ai termini dell'ontologia genica (GO) utilizzando Blast2GO (//www.blast2go.com).
La reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RT-qPCR) è stata eseguita secondo Bustin et al. (2009). I campioni di cDNA sono stati sintetizzati utilizzando un kit di reagenti PrimeScript RT (Takara, Dalian, Cina) da 0,5 ug di RNA totale. La RT-qPCR è stata eseguita utilizzando i kit SYBR Premix Ex Taq II e ROX plus (Takara) su un sistema PCR in tempo reale ABI 7300 (Applied Biosystems, Foster City, USA) con tre replicati tecnici. I primer sono stati progettati utilizzando il software online Primer3 secondo le istruzioni fornite da Takara; i primer utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella 1 Suppl. Le espressioni geniche sono state normalizzate a 18S RNA, la cui espressione era stabile in tutti i campioni.

I risultati sono stati analizzati utilizzando la versione R 3.1.1, la significatività delle differenze è stata verificata dal t-test di Student.

Risultati

Il perossido di idrogeno ha indotto la biosintesi di tutti e tre i principali PeG(feniletanoideglicosidi)inCistanchesalsacellule in sospensione (Tabella 1) ma senza effetti evidenti sulla crescita cellulare (Fig. S2). Il contenuto di echinacoside è aumentato già dopo il trattamento con 10 ug dm-3 H2O2 (P < 0.05),="" un="" aumento="" maggiore="" è="" stato="" registrato="" dopo="" i="" 20="" ug="" dm="" -3="" trattamento="" con="" h2o2="" (p="">< 0,01)="" e="" l'aumento="" più="" alto="" è="" stato="" dopo="" i="" trattamenti="" con="" h2o2="" da="" 40,="" 80="" e="" 160="" ug="" dm-3.="" risultati="" simili="" sono="" stati="" mostrati="" per="" l'acteoside,="" ma="" il="" suo="" contenuto="" ha="" raggiunto="" il="" picco="" dopo="" il="" trattamento="" con="" 80="" ug="" dm-3="" h2o2.="" la="" biosintesi="" del="" 2'-acetilacteoside="" era="" meno="" sensibile="" al="" trattamento="" con="" h2o2;="" un="" aumento="" significativo="" del="" suo="" contenuto="" (p=""><0,05) era="" a="" concentrazioni="" di="" h2o2="" superiori="" a="" 40="" ug="" dm-3.="" dopo="" il="" trattamento="" con="" 80="" ug="" dm-3="" h2o2,="" la="" quantità="" di="" tutti="" e="" tre="" i="" peg="">(feniletanoideglicosidi)aumentato significativamente (P < 0.01)="" rispetto="" al="" controllo.="" pertanto,="" questa="" concentrazione="" è="" stata="" utilizzata="" in="" ulteriori="">
Per generare una libreria arricchita per i primi geni responsivi che sono sovraregolati da H2O2, abbiamo usato il cDNA diCistanchesalsacellule di sospensione trattate con 80 ug dm-3 H2O2 per 2 h. Il sequenziamento a passaggio singolo di 129 cloni ricombinanti nella libreria SSH ha prodotto 105 EST puliti dopo l'esclusione della sequenza vettoriale. Questi EST chiari sono stati utilizzati per l'assemblaggio da CAP3 e sono stati generati 18 contigs e 67 singleton (Tabella 2). Pertanto, 85 geni sono stati isolati in questa libreria. La lunghezza media dei 105 EST puliti era 527 bp, che è adeguata per una classificazione funzionale basata sulla somiglianza di sequenza.

feniletanoideglicosidiinCistanchesalsa

Tutti gli 85 geni ottenuti nella libreria sono stati recuperati da BLASTx rispetto al database di proteine ​​non ridondanti GenBank per la somiglianza di sequenza (valore E minore o uguale a 0.001). Ventuno geni non hanno mostrato risultati nel database, potrebbero essere specificiCistanchesalsa. I risultati con BLASThits sono stati importati nel software Blast2GO per ulteriori analisi di arricchimento del percorso GO e KEGG. Dei 64 geni con risultati BLAST, 50 sono stati annotati in base alla descrizione di geni omologhi di altre specie. I geni annotati sono stati nominati in base alla descrizione dei colpi BLAST. L'analisi GO (Fig. 3 Suppl.) mostra che tra questi 50 geni c'erano 14 geni coinvolti nelle risposte agli stimoli e oltre 30 geni correlati ai processi metabolici (Tabelle 1 e 2). Tra questi geni, sono stati isolati due omologhi del gene della via della biosintesi PeG come previsto: 4-coenzima cumarato A ligasi (denominato Cs4CL1: Contig03) e cinnamato 4-idrossilasi (denominato CsC4H1: Contig14). Inoltre, è stata eseguita la RT-qPCR per confermare le espressioni indotte dei geni dalla libreria dopo il trattamento con H2O2.

Per confermare che i geni essenziali identificati dalla libreria SSH rispondevano al trattamento con H2O2, le espressioni di due PeG(feniletanoideglicosidi)i geni correlati alla via della biosintesi (Cs4CL1, CsC4H1), due geni indotti da ROS (CsSOD1: Contig 16, CsHSP1: CISTH099) e un gene simile al fattore di trascrizione della famiglia WRKY (CsWRKY1: Contig 07) sono stati misurati mediante RT-qPCR dopo il trattamento con H2O2 (Fig. 1). Le espressioni CsC4H1, Cs4CL1, CsSOD1 e CsWRKY1 sono state regolate più di 15-fold, 3-fold, 45-fold e 4-fold, rispettivamente 2 h dopo l'H2O2 trattamento. L'espressione di CsHSP1 è stata alterata solo 1,8 volte dopo il trattamento con H2O2.
Il decorso temporale delle espressioni di CsWRKY1, CsC4H1 e Cs4CL1 dopo il trattamento con H2O2 è stato ulteriormente analizzato mediante RT-qPCR (Fig. 2). Le espressioni CsC4H1 e Cs4CL1 erano notevolmente aumentate (rispettivamente più di 80-fold e 50-fold) dopo il trattamento di 16-h e quindi sottoregolate dopo 32 h. L'espressione di CsWRKY1 è stata sovraregolata più di 20- volte a 4 ore e quindi è diminuita da 8 ore in poi (Fig. 2).

Fig. 2. L'espressione relativa di CsWRKY1 (A), CsC4H1 (B) e Cs4CL1 (C) in momenti diversi dopo il trattamento con 80 ug dm-3 H2O2. Le espressioni sono state normalizzate a un controllo; (trattato con acqua). Mezzi più - SD di tre ripetizioni biologiche; * - P < 0.05,="" **="" -="" p=""><>

Discussione

Il perossido di idrogeno è un noto elicitore vegetale che mostra vari effetti sulle piante. Come i ROS, può indurre il sistema di scavenging dei ROS composto da superossido dismutasi, catalasi, perossidasi, ecc., e funge da segnale a valle di sale, osmotico e disidratazione

sottolinea (Wi et al. 2006, Kar 2011, Furlan et al. 2013, Sathiyaraj et al. 2014). È stato suggerito che la generazione di H2O2 nelle piante sia accompagnata dalla biosintesi indotta del metabolita secondario nelCistanchesalsacoltura cellulare. Come previsto, i nostri risultati rivelano che i PeG(feniletanoideglicosidi)biosintesi nelCistanche salsala coltura cellulare è stata indotta dopo il trattamento con H2O2 (Tabella 1). Il contenuto di tre PeG principali(feniletanoideglicosidi)aumentato dopo il trattamento con H2O2 indicando il suo ruolo fondamentale nella biosintesi dei PeG. I geni arricchiti nella libreria SSH hanno ulteriormente suggerito il suo effetto sui PeG(feniletanoideglicosidi)induzione della biosintesi inCistanche salsa.

Molti noti geni reattivi all'H2O2-, come l'ascorbato perossidasi (CISTH069, Karyotou e Donaldson 2005), l'h-chinone ossidoreduttasi (CISTH125, Bello, et al. 2001), CsSOD1, CsHSP1 (Baruah et al. 2014), e i geni di risposta alla resistenza alla malattia (Contig10, Nanda, et al. 2010), sono stati arricchiti nella libreria SSH (Tabella 3, Tabella 2 Suppl.). Alcuni di questi tipici geni responsivi ai ROS con un'espressione indotta dopo il trattamento con H2O2 sono stati ulteriormente confermati da RT-qPCR (Figg. 1 e 2) indicando che qui è stata costruita una libreria SSH qualificata. In questa libreria sono stati trovati anche due geni della via della biosintesi PeG, CsC4H1 e Cs4CL1 e queste due espressioni geniche sono state indotte dal trattamento con H2O2 in modo dipendente dal tempo (Fig. 2). Suggerisce che il trattamento con H2O2 abbia indotto PeG(feniletanoideglicosidi)biosintesi a livello genetico attraverso la regolazione dei geni della via PAL. Tuttavia, PAL e altri geni di biosintesi dei PeG a valle (Wang et al. 2012) non sono stati identificati nella libreria SSH; potrebbe essere perché la libreria non è stata sufficientemente sequenziata. Una relazione tra le espressioni indotte da CsC4H1 e Cs4CL1 e un'aumentata biosintesi di PeG dopo il trattamento con H2O2 dovrebbe essere chiarita da ulteriori analisi.

Oltre ai geni della via PAL indotti dal trattamento con H2O2, nella libreria SSH sono stati trovati due fattori di trascrizione della famiglia WRKY (CsWRKY1, CsWRKY2) e un'espressione indotta da CsWRKY1 è stata confermata da RT-qPCR . La sua espressione rispondeva al trattamento con H2O2 prima dell'espressione di due geni della via PAL, Cs4CL1 e CsC4H1 (Fig. 2). Da studi precedenti, nel riso è stata osservata la coespressione di alcuni fattori di trascrizione WRKY e geni della via PAL (Gupta et al. 2012). Inoltre, l'espressione genica PAL è sovraregolata in un mutante con sovraespressione di OsWRKY03 (Liu et al. 2005). I suddetti due fattori di trascrizione della famiglia WRKY potrebbero essere coinvolti anche nei PeG(feniletanoideglicosidi)biosintesi inCistanchesalsa. È interessante notare che nella libreria SSH sono stati trovati EST correlati alla disidratazione (CISTH067, CISTH064), il che potrebbe suggerire che il trattamento con H2O2 fosse correlato all'espressione di geni responsivi alla disidratazione inCistanchesalsacome osservato in altre piante (Schmidt et al. 2013, Zhou et al. 2013). Nella libreria SSH è stato identificato un gene correlato alla segnalazione della gibberellina (GA), il recettore della gibberellina gid1b-like (CISTH092), che implica la connessione della segnalazione GA e del trattamento con H2O2 inCistanchesalsa, che è stato riportato anche nell'orzo (Bahin et al. 2011). Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per confermare se questi geni sono correlati ai PeG(feniletanoideglicosidi)biosintesi. Oltre ai geni sopra menzionati, la libreria SSH costruita qui presenta anche geni con o senza hit BLAST. Migliora la nostra comprensione dell'effetto H2O2 su C. salsa e fornisce in primo luogo le informazioni sui suoi geni coinvolti nella biosintesi dei PeG.

In conclusione, abbiamo valutato l'effetto di H2O2 sui PeG(feniletanoideglicosidi)induzione nelCistanchesalsacoltura cellulare. La libreria SSH è stata costruita dopo il trattamento con H2O2 e l'espressione dei geni selezionati è stata confermata da RT-qPCR. Sono stati identificati due geni correlati alla via della biosintesi PeG e altri geni reattivi all'H2O2-. Questi risultati estenderanno la nostra comprensione dei PeG indotti da H2O2-(feniletanoideglicosidi)biosintesi inCistanchesalsaa livello molecolare, fornendo le informazioni per la manipolazione genica diCistanchesalsacolture cellulari per migliorare i PeG(feniletanoideglicosidi)produzione.

Da: "Identificazione di EST sensibili al perossido di idrogeno coinvolti nella biosintesi del glicoside feniletanoide nella coltura cellulare di salsa Cistanche" diJ. CHEN et al.

--- BIOLOGIA PLANTARUM 59 (4): 695-700, 2015 J. CHEN et al. DOI: 10.1007/s10535-015-0541-a

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