Imaging del rene: dalla microscopia ottica alla super risoluzione
Mar 17, 2022
Contatto: ali.ma@wecistanche.com
Maria Lucia Angelotti1,2, Giulia Antonelli1,2 Carolina Conte1,2e Paola Romagnani1,2
ASTRATTO
Gli importanti risultati inrenemeccanismi fisiologici e fisiopatologici possono essere in gran parte attribuiti ai progressi nella tecnologia della microscopia. Molto di ciò che sappiamo sull'architettura delrenesi basa sulle descrizioni fondamentali dei microscopisti anatomici mediante microscopia ottica e successivamente mediante analisi ultrastrutturali fornite mediante microscopia elettronica. Queste due tecniche sono state utilizzate per i primi sistemi di classificazione delle malattie renali e per i loro continui aggiornamenti. Più recentemente, una serie di nuove tecniche di imaging ha aggiunto l'analisi in ulteriori dimensioni di tempo e spazio. La microscopia confocale ci ha permesso di visualizzare in sequenza sezioni ottiche lungo l'asse z e la disponibilità di software di analisi specifico ha fornito un rendering tridimensionale di campioni di tessuto più spessi. La microscopia multifotonica ci ha permesso di indagare simultaneamenterenefunzione e struttura in tempo reale. La microscopia di imaging a fluorescenza-vita ci ha permesso di studiare la distribuzione spaziale dei metaboliti. La microscopia a super risoluzione ha aumentato la sensibilità e la risoluzione fino a livelli su scala nanometrica. Con la microscopia crioelettronica, i ricercatori hanno potuto visualizzare le singole biomolecole a livelli atomici direttamente nei tessuti e comprendere la loro interazione a livello subcellulare. Infine, la spettrometria di massa per imaging di desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice ha consentito la misurazione di centinaia di molecole diverse contemporaneamente su sezioni di tessuto ad alta risoluzione. Questa recensione fornisce una panoramica di disponibilirenestrategie di imaging, con particolare attenzione al possibile impatto dei più recenti miglioramenti tecnologici.
Parole chiave:immunoistochimica,renebiopsia, podociti,prossimaletubulo, cellule staminali
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INTRODUZIONE
Ilreniè necessaria un'affascinante complessità strutturale per svolgere le sue diverse funzioni fisiologiche. All'inizio, studiando ilreneera limitato alle osservazioni macroscopiche e il loro contributo alla diagnosi delle malattie renali era innegabilmente limitato. Le manifestazioni cliniche sono state descritte ma i meccanismi patogenetici sottostanti erano sconosciuti. I risultati ottenuti nella comprensione della fisiologia e fisiopatologia renale possono essere in gran parte attribuiti ai continui progressi nel campo della microscopia. Tentativi direnel'imaging è iniziato molto tempo fa [1]. Nel 1666 l'anatomista Malpighi esaminòrenetessuto con un microscopio ottico che aveva una potenza stimata in 25-30 e descrisse per la prima volta il glomerulo come "una ghiandola in cui l'urina era separata dal sangue"[2]. Questo contributo fu ignorato fino al 1842, quando le strutture del nefrone furono svelate con un microscopio ottico 10 volte più potente da Sir William Bowman. Bowman scoprì che la capsula periglomerulare (in seguito denominata capsula di Bowman) era collegata anatomicamente alla prima parte del tubulo [3]. Nel 1862, Jacob Henle descrisse il segmento tubulo ad anello che prese il suo nome, collegando il tubulo corticale e la papilla renale.
Grazie all'introduzione della microscopia ottica, una classificazione istomorfologica direnemalattiediventato possibile [1]. La possibilità di osservare ciò che accadeva nei reni malati ha permesso di comprendere che i cambiamenti patologici variavano considerevolmente tra pazienti con manifestazioni cliniche simili. Tuttavia, i primi studi sulle alterazioni patologiche del tessuto renale sono stati condotti su campioni autoptici, portando principalmente alla descrizione di malattie croniche. La mancanza di informazioni sull'evoluzione delle patologie renali e il problema tecnico dei fenomeni autolitici, correlati all'uso dei tessuti post mortem, hanno limitato la conoscenza delle malattie umane. Nel 1951, l'introduzione delrenela biopsia ha consentito l'osservazione diretta e lo studio non solo delle malattie renali croniche ma anche acute. Nel frattempo, la microscopia è diventata gradualmente più sofisticata con una sensibilità e una risoluzione progressivamente aumentate fino a livelli su scala nanometrica. In questa recensione, forniremo una panoramica delle scoperte renali fondamentali rese possibili dai progressi nella tecnologia della microscopia, con un focus sulle possibilità che si evolvono dai più recenti sviluppi tecnici.
IMMUNOPATOLOGIA DELLA VISUALIZZAZIONE DEL RENE
Immunomarcatura e microscopia a fluorescenza
La possibilità di ottenere un frammento rappresentativo di tessuto vivente ha consentito l'applicazione di tecniche emergenti che richiedevano la massima conservazione dei tessuti, come i metodi immunoistochimici (fluorescenti prima, poi enzimatici). Infatti, nel 1950, Coons sviluppò il metodo per etichettare gli anticorpi con l'isocianato di fluoresceina, cioè l'immunofluorescenza, senza distruggere la capacità di reagire in modo specifico con i loro antigeni tissutali. Da allora l'immunofluorescenza è stata incorporata nella procedura diagnostica per la valutazione di campioni bioptici renali congelati. Per la prima volta, queste tecniche hanno consentito l'osservazione delle immunoglobuline intrarenali (Igs) e dei depositi del complemento in pazienti affetti da glomerulonefrite, contribuendo alla discriminazione di diverse fisiopatologie alla base di alcune lesioni tissutali aspecifiche, ad esempio nella glomerulonefrite a mezzaluna [4]. Inoltre, la possibilità di osservare un pattern di colorazione caratteristico e l'accoppiamento della fluoresceina con anticorpi diversi dall'immunoglobulina G (IgG) ha portato al riconoscimento di depositi di immunoglobuline A (IgA) nella nefropatia da IgA, nonché depositi di complemento nella glomerulonefrite post-infettiva e glomerulonefrite membranoproliferativa [4].
Microscopia confocale
La microscopia a fluorescenza ha subito notevoli miglioramenti tecnici con l'introduzione della microscopia confocale alla fine degli anni '80. Gli elementi chiave della microscopia confocale sono l'illuminazione puntiforme focalizzata e scansionata sul campione e un'apertura confocale variabile (pinhole) davanti al rivelatore che consente la raccolta della luce solo da una sezione sottile attorno al piano focale (chiamata sezione ottica). La microscopia confocale ha consentito i primi studi in vivo del rene in modelli sperimentali e l'osservazione dell'assorbimento e del trasporto di molecole fluorescenti attraverso i tubuli intattirenidopo la micropuntura. Ciò ha consentito studi sulla funzione tubulare in condizioni fisiologiche e patologiche [5].
The possibility to sequentially image optical sections along the z-axis and the availability of specific analysis software permitted a three-dimensional (3D) rendering of thicker tissue specimens, showing the frequent inconsistency and misrepresentations provided by 2D analyses [6, 7] (Figure 1A and a'). In addition, the introduction of genetically encoded fluorescent proteins in transgenic mice permitted the labeling of specific cells and tracing them directly within tissues without immunostaining (lineage tracing strategy) [6, 7, 8]. However, confocal microscopy still did not resolve details >200 nm, a causa del limite di diffrazione della luce visibile, del fotosbiancamento e della fototossicità.
COMPRENSIONE DELLA BARRIERA DI FILTRAZIONE GLOMERULAR: LA MICROSCOPIA ELETTRONICA
Il primo tentativo di superare il limite di risoluzione dei microscopi a luce e a fluorescenza risale al 1931 quando Ernst Ruska e Max Knoll inventarono il microscopio elettronico (EM), che utilizza un raggio di elettroni accelerati, invece di un raggio di luce, come fonte di eccitazione, e ha un potere risolutivo maggiore rispetto ai microscopi ottici (fino a 0,2 nm). Per questa innovazione, nel 1986 Ernst Ruska è stato insignito del Premio Nobel per la Fisica. Grazie all'accresciuto potere di risoluzione, divenne presto evidente che il glomerulo non era semplicemente un filtro meccanico, ma un organo estremamente complesso composto da tre strati: cellule endoteliali, membrana basale glomerulare (GBM) e podociti [9]. La trasmissione EM (TEM) ha consentito la visualizzazione delle cellule glomerulari dall'interno [10] e ha rivelato che le cellule endoteliali avevano corpi cellulari fenestrati sottili, mentre i podociti avevano corpi cellulari grandi e processi primari e secondari del "piede" ancorati al GBM e interconnessi attraverso giunzioni lineari (il leggero diaframma) (Figura 1B). Inoltre, la scansione EM (SEM), catturando elettroni retrodiffusi, ha consentito la visualizzazione delle cellule glomerulari dalla loro superficie esterna [10] e ha rivelato che i processi del piede dei podociti vicini interdigitavano e coprivano il GBM (Figura 1C). L'EM è rimasto un potente strumento non solo per la comprensione della normale ultrastruttura glomerulare, ma anche per la comprensionerenefisiologia e fisiopatologia [11]. Numerosi studi condotti su campioni umani o in modelli sperimentali hanno rivelato che diversi processi patologici sono associati a un insieme di pattern distintivi di alterazioni ultrastrutturali, il che implica ulteriori aggiornamenti su un sistema di classificazione in evoluzione direnemalattie. La capacità tecnica di visualizzare un'ulteriore complessità dell'ultrastruttura del rene ha approvato la specializzazione dei "nefropatologi".
Una recente tecnica SEM, basata su un rivelatore ad alta sensibilità, ha permesso di studiare la porzione più profonda del diaframma a fessura e ha rivelato che era caratterizzato da pori di dimensioni variabili [12]. Nei ratti, l'insorgenza della proteinuria era associata a pori dilatati, aumentando la possibilità che cambiamenti ultrastrutturali del diaframma a fessura potessero essere causa dei cambiamenti nella permselettività glomerulare [12]. Come ulteriore progresso tecnico, il SEM block-face ha consentito il passaggio da una vista 2D a una 3D della barriera di filtrazione glomerulare con una risoluzione sufficiente per seguire la nanostruttura dei processi cellulari più sottili in topi sani, topi malati e duranterenesviluppo [13, 14].
Infine, l'accoppiamento di EM a un sistema di microanalisi a raggi X (microscopia a raggi X) ha consentito un'analisi elementare di cellule o parti di cellule a livello ultrastrutturale. La microscopia a raggi X utilizza una scansione TEM con un fascio di elettroni stretto per eccitare il campione. L'impatto degli elettroni ad alta energia del fascio con gli atomi nei campioni produce energia sotto forma di fotoni di raggi X. Questo segnale a raggi X, raccolto con un rivelatore a semiconduttore a dispersione di energia, viene utilizzato per identificare gli elementi presenti nel campione, con una risoluzione al massimo di 30 nm. Nelrenecampo, la microanalisi a raggi X è stata utilizzata con successo da Beck e Thurau per studiare il trasporto ionico nel tubulo transepiteliale [15] e la concentrazione elementare intracellulare nelle cellule tubulari [16].
VISUALIZZARE LA FISIOLOGIA RENALE CON LA MICROSCOPIA MULTIFOTO
La microscopia multifotonica (MPM) ha fornito un ulteriore avanzamentorenericerca, ovvero la possibilità di indagare simultaneamente la funzione renale e le relazioni strutturali in tempo reale [17]. Diversamente dai microscopi ottici convenzionali, l'eccitazione a due fotoni dipende dall'assorbimento simultaneo di due fotoni con il doppio della lunghezza d'onda di eccitazione necessaria per eccitare il fluoroforo nella classica eccitazione di un fotone (Figura 1D). L'uso di laser a infrarossi pulsati a bassa energia disponibili in commercio ha aumentato la penetrazione dei tessuti profondi e ridotto al minimo la fototossicità (Figura 1D). Ciò ha consentito ai ricercatori di visualizzare i processi cellulari dinamici direttamente negli animali vivi, una caratteristica non ottenibile in precedenza con nessun'altra tecnica. L'MPM consente la quantificazione delle funzioni renali di base e delle alterazioni patologiche come la permeabilità glomerulare, il flusso sanguigno vascolare, la velocità di filtrazione glomerulare del singolo nefrone e il flusso tubulare [17] (Figura 1E e F). Inoltre, l'MPM consente lo studio dei processi intracellulari in risposta a lesioni, tra cui la morte cellulare e lo spargimento, il rotolamento dei leucociti e il reclutamento e le interruzioni del GBM [17]. Ulteriori miglioramenti tecnici hanno consentito l'imaging intravitale prolungato da giorni a settimane [18] che, in combinazione con topi transgenici che esprimono proteine fluorescenti, sono stati utilizzati per tracciare il destino di singole cellule direttamente in vivo nei reni sani e danneggiati [19] e per comprendere meglio i meccanismi di ricambio e rigenerazione delle cellule renali.
Tecniche di imaging senza etichetta erano possibili anche con MPM, sfruttando l'autofluorescenza naturale della nicotinamide adenina dinucleotide idrato (NADH) per studiare lo stato redox delle cellule tubulari dopo la lesione [20]. Inoltre, la generazione di seconda armonica dal collagene fibrillare è stata utilizzata per quantificare la deposizione di collagene, un marker di fibrosi renale [21]. La generazione della seconda armonica è un processo ottico non lineare in cui due fotoni di eccitazione con la stessa lunghezza d'onda interagiscono con strutture non centrosimmetriche nei tessuti biologici, come collagene o microtubuli, e generano un nuovo fotone con metà della lunghezza d'onda.
Una recente innovazione della microscopia intravitale è stata l'introduzione di un endoscopio multifotonico miniaturizzato utilizzato con successo per l'immagine dei reni in topi vivi anestetizzati [22]. Questo MPM minimamente invasivo può aprire la strada alla diagnosi in vivo in tempo reale, senza rimozione di tessuto e in un tempo molto breve.
IL RENE IN 3D: TECNICHE DI CHIARIMENTO DEI TESSUTI E MICROSCOPIA DI ESPANSIONE
Nonostante i miglioramenti tecnologici, uno dei limiti principali per l'imaging volumetrico più profondo è l'opacità del tessuto renale, che rende ilreneuno degli organi otticamente più impegnativi. Questo è il motivo per cui le tecniche di pulizia dei tessuti hanno suscitato molto interesse [23]. Lo scopo di questi approcci è convertire un tessuto opaco in uno trasparente, preservando proteine ed eventualmente marcatori fluorescenti, per visualizzare fette di tessuto spesse. La combinazione del clearing ottico con la microscopia all'avanguardia offre la possibilità di analisi morfometriche, come la quantificazione del volume e del numero glomerulare, in tessuti spessi o anche nel rene intatto [24]. Altre applicazioni includono l'analisi di segmenti di tubuli distinti [25], le loro funzioni [26] e la quantificazione della perdita di podociti [27].
Per visualizzare grandi volumi di tessuto e, allo stesso tempo, risolvere dettagli strutturali fini, è stato recentemente introdotto un nuovo approccio tecnico, ovvero la microscopia ad espansione (ExM). L'idea è di espandere fisicamente un intero organo 4- fino a 5-piegare preservando l'architettura generale e il contenuto del proteoma 3D. Utilizzando un polimero in espansione, sintetizzato direttamente all'interno del campione, le molecole più vicine al limite di diffrazione della luce vengono separate isotropicamente nello spazio a distanze maggiori e quindi possono essere risolte otticamente anche da un microscopio a fluorescenza convenzionale. Inoltre, l'ExM fornisce una maggiore trasparenza ottica e riduce la dispersione della luce, consentendo di visualizzare un volume maggiore di tessuto. Utilizzando questo approccio, la localizzazione di più proteine nel diaframma a fessura e nel GBM può essere sezionata anche con un normale microscopio confocale [28]. Ad esempio, può rivelare l'annullamento del processo del piede nei topi proteinurici, sia in 2D che in 3D, a una risoluzione nanometrica mai raggiunta prima [29]. Recentemente ExM è stato utilizzato per la valutazione clinica istopatologica di campioni inclusi in paraffina già colorati con ematossilina ed eosina [30]. Questa tecnica può visualizzare l'annullamento del processo del piede a un livello su scala nanometrica che in precedenza era possibile solo con EM. I progressi nell'imaging volumetrico consentono l'analisi 3D ad alta risoluzione dell'intero organo in modo tale che il principale limite all'imaging profondo è ora rappresentato dalla capacità degli anticorpi di penetrare nel tessuto.
STUDIO DEL PROFILO METABOLICO: FREQUENZA-DOMINIO FLUORESCENZA-MICROSCOPIA PER IMMAGINI A VITA
Ilreneè un organo metabolico ad alto contenuto di mitocondri. La forma ridotta di NADH e altri metaboliti sono naturalmente fluorescenti e questa autofluorescenza può essere utilizzata come indice dello stato redox [20]. Tuttavia, gli spettri di emissione di questi fluorofori endogeni si sovrappongono e identificarli separatamente era impossibile. Ma la durata della fluorescenza (cioè il decadimento temporale della fluorescenza) è risultata significativamente diversa. Quindi la microscopia di imaging a fluorescenza-vita (FLIM) consente lo studio dei profili metabolici [31]. Recentemente, utilizzando una combinazione di MPM e FLIM, è diventato possibile caratterizzare le firme metaboliche specifiche delle cellule e monitorare i cambiamenti metabolici in vivo duranterenemalattia [32]. FLIM dovrebbe fornire ulteriori approfondimentirenemetabolismo in vivo in salute e malattia.
SPINGERE LA RISOLUZIONE OLTRE I LIMITI: IMMAGINE A SUPER RISOLUZIONE DEL RENE
La microscopia ottica standard affronta un limite della risoluzione ottica oltre i 200 nm. Le nuove tecnologie, denominate imaging a super risoluzione, ora consentono alla microscopia fluorescente di visualizzare immagini oltre il suo limite di diffrazione come punto di partenza dell'era della nanoscopia [33]. Questi approcci combinano la risoluzione nanoscopica con i vantaggi dell'etichettatura a fluorescenza multicolore. In riconoscimento del potenziale impatto di queste innovazioni, il Premio Nobel per la Chimica 2014 è stato assegnato a Eric Betzig, Stefan Hell e William Moerner "per lo sviluppo della microscopia a fluorescenza super risolta. Diverse strategie di imaging a super risoluzione possono essere applicate per affrontare diverse domande biologiche. Questi approcci possono essere raggruppati in due categorie principali, a seconda che la super risoluzione sia sfruttata a livello di singole molecole o di insiemi [33].
Tecniche basate sull'ensemble
Le tecniche basate sull'ensemble rompono il limite di diffrazione modulando temporalmente e spazialmente il fascio di luce di eccitazione. Tra questi, l'imaging a esaurimento delle emissioni stimolate a super risoluzione (STED) utilizza due laser, un laser di eccitazione e un laser a esaurimento con spostamento verso il rosso sovrapposto (laser STED), a forma di ciambella, per sopprimere l'emissione di fluorescenza dai fluorofori situati al di fuori il centro dell'eccitazione. Questa soppressione si ottiene attraverso l'emissione stimolata e consente di raccogliere solo il segnale proveniente da una macchia focale con una dimensione inferiore al limite di diffrazione (Figura 2A). L'imaging STED è stato utilizzato per visualizzare il diaframma a fessura otticamente pulitorenetessuti (Figura 2B-c') e ha permesso di localizzare la distribuzione spaziale di podocina e nefrina su scala nanometrica fino ad almeno 30 lm di profondità [34]. Inoltre, la possibilità di osservare e quantificare l'annullamento del processo del piede in un modello sperimentale può rendere l'imaging STED utile per lo studio della barriera di filtrazione glomerulare [34].
La microscopia STED richiede protocolli specifici per la preparazione del campione, fluorofori speciali e formazione tecnica. Per questo motivo, negli ultimi anni è stata data maggiore attenzione ad un'altra tecnica di super risoluzione, la microscopia a illuminazione strutturata (SIM), che può estendere il limite di diffrazione di un fattore due sia lateralmente che assialmente. La SIM utilizza una configurazione del microscopio ad ampio campo con un pattern di illuminazione a strisce sottili, che consente l'acquisizione di informazioni ad alta frequenza (corrispondenti a dettagli fini nel campione) a frequenze spaziali inferiori. Acquisendo più immagini con schemi di illuminazione di diverse fasi e orientamenti, è possibile ricostruire un'immagine ad alta risoluzione (Figura 3A). La SIM è compatibile con i fluorofori standard, non richiede una preparazione specifica del campione e consente la visualizzazione 3D. Dati tutti questi vantaggi, sono stati condotti diversi studi per valutare la possibilità di utilizzare la SIM come strumento diagnostico rapido [35], ad esempio, con un potenziale tempo di risposta più breve rispetto all'EM. Recentemente una SIM 3D e l'elaborazione automatizzata delle immagini sono state utilizzate come strumento diagnostico rapido per la cancellazione del processo del piede utilizzando sezioni di paraffina di routine da biopsie di pazienti con malattia a cambiamento minimo [36] (Figura 3B e C). Questa capacità di identificare con successo alterazioni in malattie note per mostrare patologie su scala nanometrica ha confermato che la SIM è uno strumento promettente per la diagnostica di routine.
Metodi di imaging basati sulla localizzazione di singole molecole
Queste tecniche si basano sulla possibilità di accendere e spegnere ciclicamente singole molecole fluorescenti troppo vicine per essere risolte. In questi approcci, le molecole all'interno di una regione limitata dalla diffrazione possono essere attivate in diversi punti temporali in modo che possano essere individualmente immaginate e successivamente localizzate con precisione nanometrica trovando computazionalmente i loro centri (Figura 3D). Tra questi approcci, è stata introdotta per la prima volta la microscopia a ricostruzione ottica stocastica (STORM).renericerca nel 2013, con uno studio che ha rivelato l'intricata organizzazione molecolare del GBM con precisione nanometrica, incluso l'orientamento delle molecole all'interno [37]. In un modello murino di una rara sindrome nefrosica congenita, STORM ha rivelato l'integrazione e il corretto orientamento della laminina 521 all'interno del GBM dopo l'iniezione endovenosa, aprendo la strada a opzioni terapeutiche avanzate per i pazienti [38]. Un altro studio ha descritto l'organizzazione del citoscheletro di actina nei podociti con una risoluzione su scala molecolare [39] (Figura 3E-I). Come nuova scoperta, i podociti contengono fasci di actina contrattile collegati a fasci di actina non contrattile nei processi del piede. Nei modelli di lesione dei podociti, la struttura dell'actina nel piede si disassembla, portando al collasso della struttura contrattile nel corpo principale [39].
VISUALIZZARE STRUTTURE 3D DI BIOMOLECOLE FONDAMENTALI A LIVELLO ATOMICO: LA MICROSCOPIA CRYO-ELETTRONICA
Fino a tempi recenti, la possibilità di studiare la struttura delle biomolecole fondamentali era limitata alla microscopia elettronica, con una risoluzione di pochi nanometri. Ostacoli tecnici, come danni ai campioni causati da un intenso fascio di elettroni, basso contrasto dell'immagine e movimenti delle molecole dopo l'interazione con gli elettroni o difficoltà a preservare l'acqua nei campioni biologici nel vuoto applicati all'interno della camera EM, rendendo impossibile la risoluzione di molecole al di sotto di queste dimensioni . Il raffreddamento del campione può ridurre l'evaporazione dell'acqua e il danno indotto dagli elettroni [40]. Da questa idea, il cryo-EM è stato introdotto negli anni '50. Alcuni anni fa, l'introduzione di un nuovo rivelatore di conteggio a singolo elettrone ha finalmente spinto la risoluzione oltre i limiti precedenti. Nel 2017, il Premio Nobel per la chimica è stato assegnato a Jacques Dubochet, Joachim Frank e Richard Henderson per "lo sviluppo della microscopia crioelettronica per la determinazione della struttura ad alta risoluzione di biomolecole in soluzione". Questi progressi ora consentono la determinazione strutturale di biomolecole in soluzione [41].
Inrenericerca, le strutture delle proteine fondamentali sono state determinate a livello atomico [42, 43]. Tra questi, la struttura della policistina umana-2, le cui mutazioni sono responsabili del policistico autosomico dominanterenemalattia [44], e la struttura dei potenziali recettori transitori 6 canali ionici canonici, le cui mutazioni causano FSGS nell'uomo [43], sono state determinate con una risoluzione di pochi angstrom [44].
COMPRENDERE LE BASI MOLECOLARI DELLE MALATTIE RENALI: LA MICROSCOPIA RENALE INTEGRATIVA
Gli ultimi anni hanno visto un crescente interesse per gli approcci label-free in grado di mappare in modo specifico e simultaneo lo spettro totale delle molecole nei tessuti [45]. Tra questi, la spettrometria di massa per imaging di desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-IMS) consente la misurazione di centinaia di molecole diverse contemporaneamente direttamente su sezioni di tessuto ad alta risoluzione. In un esperimento MALDI-IMS, una sezione di tessuto sottile, congelata o inclusa in paraffina, è rivestita con una matrice che assorbe l'energia del laser e favorisce la ionizzazione degli analiti tissutali. L'analisi nello spettrometro di massa genera uno spettro per ciascuna coordinata x/y. Dopo la misurazione MALDI, la stessa sezione di tessuto può essere colorata con procedure istochimiche e immunoistochimiche tradizionali per integrare il pattern molecolare con i dettagli istologici. Nella ricerca renale, MALDI-IMS viene utilizzato per studiare farmaci, metaboliti, lipidi, peptidi e proteine nei tessuti normali e malati [45].
Una delle applicazioni più frequenti di MALDI-IMS è l'identificazione di marcatori molecolari per classificare il carcinoma a cellule renali [46] e per stabilire il vero margine tra tessuto canceroso e normale a livello molecolare e istologico [47]. MALDI-IMS è stato utilizzato con successo anche per studiare la tossicità renale dei farmaci per fornire una diagnosi precoce di sostanze tossicherenemeccanismi di danno mediati da candidati farmaceutici [48]. Inoltre, MALDI-IMS viene utilizzato per studiare i lipidi e il loro ruolo nelle patologie renali, come la nefropatia diabetica [49], il danno renale acuto [50] e ilrenemalattia [51], e anche per rivelare profili metabolici endogeni per una più profonda comprensione dei meccanismi correlati alla malattia [52]. L'identificazione dei profili molecolari è stata finalizzata anche per possibili biomarcatori che potrebbero essere nuovi potenziali biomarcatori diagnostici e prognostici [53, 54].
CONCLUSIONI E PROSPETTIVE FUTURE
I costanti miglioramenti nelle tecniche di imaging hanno progressivamente risolto molte barriere tecniche criticherenericerca e hanno permesso una rappresentazione dinamica della struttura e della funzione nei reni normali e malati. In effetti, l'avvento delle nuove tecnologie di microscopia ha consentito scoperte scientifiche fondamentali e successivamente ha cambiato la nostra visione della fisiologia e fisiopatologia renale che ora possono essere visualizzate in 3D e persino filmate in video, dove il tempo rappresenta la quarta dimensione. Con la recente innovazione tecnologica della microscopia a super risoluzione e il progresso delle tecniche di imaging molecolare, i ricercatori possono ora visualizzare le singole biomolecole direttamente nei tessuti e determinare come interagiscono a livello cellulare e subcellulare.
La possibilità di applicare questi strumenti a patologierenecampioni, concentrandosi sui dettagli molecolari e subcellulari nelle biopsie cliniche, dovrebbero aiutare con le riclassificazioni della malattia. Al momento non è chiaro se e quando ciò creerà un impatto sulla diagnosi di malattia renale o anche sulla gestione del paziente.
FINANZIAMENTI
Il finanziamento è stato fornito dal Consiglio europeo della ricerca nell'ambito del programma di ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell'Unione europea (accordo di sovvenzione 648274).
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