I coniugati di anticorpi immunostimolanti suscitano una robusta attivazione mieloide e un'immunità antitumorale duratura (parte 2)

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Discussione:

I risultati qui presentati forniscono prove convincenti a sostegno degli ISAC come una nuova tecnologia per l'immunoterapia tumorale. La modellazione in vitro degli ISAC ha dimostrato la loro capacità di attivare le APC mieloidi umane primarie in modo Fc R e TLR-dipendente e di migliorare la presentazione incrociata dell'antigene utilizzando il sistema modello OVA murino. L'attivazione attraverso la sovraregolazione della molecola costimolatoria CD40 non è stata osservata solo in vitro, ma è stata anche osservata su APC mieloidi residenti nel tumore sia in modelli di xenotrapianti che di tumori singenici. Uno dei risultati sorprendenti di questo studio è stato che l'attaccamento covalente di un agonista TLR a un l'anticorpo monoclonale mirato al tumore sotto forma di ISAC ha alterato l'esito immunostimolante e l'efficacia complessiva che è tipicamente prevista con gli agonisti del TLR. Un confronto tra la somministrazione locale di trastuzumab in combinazione con T785 e la somministrazione sistemica dell'ISAC T785- ha dimostrato che solo l'ISAC ha avuto successo nel ridurre il carico tumorale. La somministrazione locale della miscela non ha fornito alcun beneficio nel modello di xenotrapianto tumorale HCC1954, con effetti paragonabili al solo trastuzumab. Questa scoperta supporta che non solo la somministrazione locale, ma anche la somministrazione simultanea dell'anticorpo e dell'agonista del TLR è essenziale per l'efficacia terapeutica osservata con l'ISAC. I dati meccanicistici generati nel modello di xenotrapianto tumorale HCC1954 hanno dimostrato il requisito in vivo per l'impegno di Fc R e il coinvolgimento di TLR per l'efficacia, poiché sia ​​​​TLRnull-ISAC che Fc-inattivo ISAC non sono riusciti a controllare la crescita del tumore. Inoltre, la somministrazione sistemica di ISAC ha portato a un'efficacia antitumorale prolungata nei modelli di tumore singenico di ratto HER2 più e negli xenotrapianti di cancro al seno HER2 più umano che erano resistenti al trattamento con l'anticorpo non coniugato. HER2 è stato selezionato come antigene bersaglio per studi preclinici in vivo perché la terapia neoadiuvante, adiuvante e di prima linea per pazienti con carcinoma mammario localmente avanzato o metastatico è dominata da anticorpi mirati a HER2-non progettati per stimolare il sistema immunitario sistema e gli anticorpi anti-blocco degli inibitori del checkpoint dei linfociti T approvati si sono rivelati minimamente efficaci in questi pazienti. Questi pazienti potrebbero trarre vantaggio dagli ISAC che mantengono la funzionalità degli anticorpi dei genitori e aggiungono un potenziale immunostimolante significativo. Come con qualsiasi immunoterapico, esiste la possibilità di generare o esacerbare anticorpi anti-farmaco e, nel caso dell'ISAC, può in definitiva dipendere dall'immunogenicità dell'anticorpo originario. Queste valutazioni sono eseguite al meglio dal punto di vista clinico e il trastuzumab può essere l'ideale per le indagini poiché il tasso di immunogenicità riportato di Herceptin™ nei pazienti è inferiore all'1% . I dati in vivo che dimostrano il requisito per la somministrazione simultanea dell'anticorpo e dell'adiuvante sono ulteriormente supportati dal lavoro che descrive in dettaglio la segnalazione intracellulare che governa l'attività ISAC attraverso la segnalazione simultanea di Fc R e TLR. Mentre ulteriori studi possono chiarire ulteriormente la dinamica di segnalazione ISAC intracellulare, gli studi qui descritti evidenziano i potenziali vantaggi di segnalazione della coniugazione di un agonista TLR a un anticorpo, come si osserva tipicamente quando gli anticorpi coinvolgono agenti patogeni durante l'immunità protettiva. Analisi basata su CyTOF della segnalazione intracellulare in PBMC umani sono stati impiegati per ulterioricomprendere e differenziare l'attività della miscela e dell'ISAC. I risultati hanno rivelato una firma amplificata dopo la stimolazione ISAC rispetto a quella suscitata dalla miscela dei singoli componenti, supportando ulteriormente il potenziale di potenziamento dell'attività attraverso la coniugazione chimica dell'anticorpo e dell'agonista del TLR. Sebbene la potenza specifica di TLR7 e TLR8-di ISAC non possa essere misurata utilizzando le celle reporter HEK293, la dimostrazionedella fosforilazione dell'IRF indotta dall'ISAC-7 suggerisce un agonismo attivo di TLR7/8, poiché è noto che l'IRF-7 è a valle della segnalazione guidata da TLR7 e TLR8 MyD88-30. I dati indicano che il ISAC non solo provoca un aumento della segnalazione delle vie canoniche associate alle vie TLR e Fc R, ma riduce anche la soglia di attivazione a coppie richiesta per innescare la fosforilazione delle proteine ​​di segnalazione a valle come la proteina ribosomiale S6, un regolatore chiave della traduzione proteica nella cellula. Punteggi DREMI elevati, particolarmente misuratinei monociti così come nelle DC, supportano la forte dipendenza condizionale indotta dalla stimolazione con l'ISAC che non si vede con la miscela. Questo fenomeno puòessere facilitato da cambiamenti intracellulari in abbondanza, localizzazione e/o reclutamento di recettori all'interno dell'endosoma, ma sono necessarie ulteriori indagini per confermare un meccanismo esatto. È importante sottolineare che l'analisi DREMI ha identificato relazioni coerenti con noti partner di segnalazione come risultato della stimolazione ISAC. Con il suo noto inibitorioruolo nella segnalazione canonica NF-κB 49, abbiamo osservato una dipendenza ridotta (es. punteggio DREMI)tra pIRF7 e inibitore di kappa B (IκB) quando le cellule mieloidi sono state stimolate con ISAC. Collettivamente, questi risultati supportano una risposta intracellulare amplificata e prolungata tramite rilevanti molecole della via di trasduzione del segnale a valle della stimolazione ISAC oltre alla sinergia tra le vie di segnalazione correlate a TLR e Fc R.

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I nostri risultati hanno rivelato che le interazioni funzionali Fc-Fc R sono essenziali per l'attivazione mediata da ISAC delle APC mieloidi. L'Fc IgG1 nativo, che ha la più alta affinità per l'attivazione di Fc Rs degli isotipi di IgG naturalmente esistenti, era superiore ad altri isotipi di IgG con affinità inferiori per l'attivazione di Fc Rs. L'ulteriore miglioramento dell'interazione Fc-Fc R attraverso la fucosilazione ha aumentato la potenza mentre la diminuzione dell'interazione Fc-Fc R attraverso la glicosilazione ha ridotto la potenza. Come previsto, la segnalazione di Syk a valle dell'impegno di Fc R oltre al successivo agonismo del TLR era necessaria affinché gli ISAC suscitassero la stimolazione massima. Questi risultati sono supportati da studi che dimostrano un notevole miglioramento della stimolazione mieloide dopo la co-stimolazione con IgG legate alla piastra e l'agonista TLR PAM3CSK 50. Suggeriscono inoltre che una reticolazione Fc più ampia, sulla superficie cellulare bersaglio o all'interno della piastra in vitro , possono verificarsi o sono impegnate reti di segnalazione differenziali, in seguito alla stimolazione ISAC anziché alla miscela di componenti. La traduzione della piattaforma ISAC in vivo è stata valutata per la prima volta con linee cellulari tumorali umane HER2 plus in topi privi di cellule B, T e NK completamente funzionali. Sorprendentemente, il trastuzumab ISAC è stato significativamente più efficace del trastuzumab su più tumori con livelli variabili di espressione di HER2. Inoltre, i dati hanno dimostrato la dipendenza dell'ISAC dal targeting tumorale per gli effetti antitumorali, poiché l'isotipo-ISAC non era in grado di indurre la regressione e la clearance del tumore. Sebbene la modellazione in vitro abbia dimostrato la necessità dell'attività di TLR e Fc R per abilitare la potenza ISAC, tali modelli non hanno avuto successo nel misurare la dipendenza dal targeting dell'antigene ISAC. Non sono state misurate differenze tra ISAC mirati e isotipo T785-in saggi su piastra con APC mieloidi umane sane co-coltivatecon cellule tumorali (dati non mostrati).La mancanza di dipendenza dall'obiettivo misurata in vitro può essere attribuita a molteplici fattori: si scopre che le APC mieloidi sovraregolano gli Fc R sulla superficie cellulare dopo la coltura in vitro, il che può aumentare la capacità delle IgG solubili di legarsi a Fc R, portando a un segnale amplificato dall'isotipo ISAC.Inoltre, il coltosistema manca di IgG endogene e di fattori sierici aggiuntivi presenti in vivo che possono competere per Fc R in vivo e smorzare gli effetti osservati con un isotipo ISAC.Tuttavia, i modelli in vivo hanno dimostrato la dipendenza dell'ISAC dal targeting per tumore per l'efficacia antitumorale.Non solo gli ISAC isotipici hanno mostrato uno scarso impatto sulla crescita del tumore negli studi di efficacia, ma è stato anche scoperto che non inducono alcun impatto a livello genetico nei tumori, come mostrato negli xenotrapianti e nei modelli di tumore singenico.Oltre a dimostrare l'efficacia target-dipendente in vivo, il T785-ISAC è stato tollerato dagli animali e ha indotto una perdita di peso minima, dimostrando pochi segni di effetti fuori bersaglio ed eventi avversi nel topo.Questi dati supportano ulteriormente la capacità di un ISAC mirato al tumore distribuito a livello sistemico di viaggiare verso il tumore e indurre una risposta antitumorale pro-infiammatoria localizzata.

L'importanza delle funzioni effettrici mediate dalle cellule mieloidi è stata dimostrata in studi sull'esaurimento delle cellule, in cui l'esaurimento del clodronato dei fagociti ha ablato la capacità dell'ISAC di indurre la clearance del tumore.È interessante notare che, sebbene i tumori inizialmente siano regrediti dopo l'esaurimento delle cellule positive Gr1, i tumori successivamente sono cresciuti.Questo fenomeno potrebbe essersi verificato a causa dell'esaurimento dei precursori dei fagociti come i monociti, che potrebbero essersi successivamente differenziati in cellule fagocitiche funzionali e mature 51.Ulteriori approfondimenti molecolari e cellulari sono stati ottenuti quantificando i livelli di mRNA e le modifiche dopo il trattamento ISAC.Questi dati sono stati ulteriormente corroborati dall'immunoistochimica e dalla quantificazione delle proteine, indicando un'infiltrazione di cellule mieloidi nel tumore lungocon la produzione di una citochina pro-infiammatoria TNF e di chemioattrattivi mieloidi CCL2 (MCP-1) e CCL4 (Mip1b).

Figura 2: ISACS suscita modelli di segnalazione distinti nelle APC mieloidi. (ad) PBMC umani appena isolati sono stati stimolati con 1 μM di rituximab-ISAC o un equivalente equimolare della miscela in presenza di CD20 più cellule tumorali di Toledo a 1:1 rapporto per 15 minuti. (a) Il rapporto mediano dell'arcosinh dell'ISAC rispetto alla segnalazione è stato misurato in seguito alla stimolazione della miscela per varie fosfoproteine ​​​​come rappresentato da una mappa di calore, con il giallo indicativo di aumento del segnale e il blu indicativo di segnale ridotto. ( b ) Grafici rappresentativi di citometria a flusso per pIRF7 e pRPS6 in monociti e cDC. (c) Il cambiamento di piega della segnalazione indotta è stato calcolato come rapporto di arcosinh rispetto al controllo non stimolato. La fosforilazione di IRF7 ed ERK1/2 è stata misurata in monociti e cDC dopo stimolazione ISAC o miscela. I dati provengono da un esperimento con sei donatori (media e SEM); *P<0.05,><0.01,><0.001,><0.0001. (d)="" representative="" drevi="" plots="" following="" dremi="" analysis="" with="" the="" area="" under="" the="" curve="" (auc)="" and="" inflection="" point="" (ip)="" denoted.="" drevi="" plots="" were="" visually="" inspected="" for="" curve="" fit="" and="" signal-to-noise,="" and="" inflection="" points="" were="" calculated="" for="" those="" with="" proper="" sigmoidal="" curve="" fits="" (n/a="" indicates="" no="" curve="">

I recettori per CCL2 e CCL4, CCR2 e CCR5 sono espressi rispettivamente su monociti e macrofagi, suggerendo che questi tipi cellulari potrebbero essere reclutati nei tumori trattati con ISAC.Inoltre, l'mRNA di Cxcl9 e Cxcl11, che codificano per chemochine specifiche delle cellule T ed essere espressi dalle DC nel TME, sono stati sovraregolati anche dal trattamento ISAC con trastuzumab (Figura 23 supplementare) 52,53.Un trastuzumab ISAC con potenza aumentata, utilizzando l'agonista CL264, ha mostrato una maggiore efficacia nei modelli tumorali che esprimono meno HER2.Questo è importante dato che i pazienti i cui tumori esprimono un basso HER2 hanno opzioni di trattamento più limitate e non sono eleggibili per trastuzumab o altre terapie contenenti trastuzumab.Negli animali trattati con gli ISAC mirati e con l'isotipo CL264- sono stati osservati una perdita di peso transitoria di circa il 5-10 percento e un aumento della secrezione sistemica di TNF, indicativi di possibili effetti fuori bersaglio oltre al robusto anti- attività tumorale osservata.I dati collettivi presentati nei modelli di xenotrapianto suggeriscono che la fagocitosi mediata dall'ISAC è un meccanismo efficace per eliminare i tumori, ma questo meccanismo potrebbe essere potenziato in seguito alla presentazione dell'antigene dei neoantigeni tumorali alle cellule T in ospiti immunocompetenti.A tal fine, la capacità degli ISAC di promuovere l'immunità antitumorale nei topi wild-type è stata studiata con ISAC anti-rHER2 in due differentirHER2-che esprime modelli singenici (MMC e CT26-rHER2). Sia T785 che CL264 contenenti ISAC sono stati valutati nel modello singenico MMC data l'elevata espressione antigenica di rHER2, poiché sia ​​​​gli ISAC a potenza inferiore che superiore sono stati postulati per essere efficaci con un'elevata densità di antigene sulla cellula tumorale. Entrambi gli ISAC rHER2 hanno portato alla completa clearance del tumore negli animali portatori di tumori di grandi dimensioni (350-950 mm3) nel modello MMC mentre l'anticorpo non coniugato non è riuscito a controllare la crescita del tumore. L'analisi dei livelli di trascrizione dell'mRNA nel modello MMC ha rivelato un drammatico cambiamento nella regolazione dimolti geni a 24 ore dopo il trattamento con l'ISAC mirato rHER2 T785- rispetto all'anticorpo rHER2 o all'isotipo ISAC, compresi i geni coinvolti nella biologia delle cellule mieloidi, nella biologia dei TLR e nelle risposte immunitarie adattative. L'immunoistochimica ha osservato un aumento degli infiltrati di cellule che esprimono CD11c e F4/{7}}, in modo simile alla tendenza osservata nel modello di tumore xenotrapianto HCC1954. Inoltre, è stata osservata l'infiltrazione di cellule T CD8 daimmunoistochimica, supportando la generazione di una risposta immunitaria adattativa dopo il trattamento ISAC.

Oltre all'importanza dimostrata dei fagociti nel modello di xenotrapianto, gli studi sull'esaurimento nel modello di tumore singenico MMC hanno rivelato una forte dipendenza dai fagociti, poiché l'esaurimento mediante liposomi caricati con clodronato ha fermato gli effetti antitumorali mediati dall'ISAC. Inoltre, gli studi singenici hanno dimostrato un ruolo critico per i linfociti T nell'efficacia dell'ISAC. La clearance del tumore guidata dall'ISAC era fortemente dipendente dall'attività delle cellule T CD8, poiché l'esaurimento delle cellule T CD8 inibiva l'efficacia antitumorale. I dati suggeriscono che l'attività delle cellule T è guidata dall'attivazione mediata da TLR di cellule mieloidi stimolate da ISAC. Tale requisito per le cellule T, presumibilmente correlato a una presentazione di antigeni associati al tumore da parte di cellule mieloidi stimolate dall'ISAC, supporta che gli ISAC probabilmente mediano la loro attività antitumorale attraverso almeno due meccanismi: fagocitosi e presentazione dell'antigene. Mentre i fagociti forniscono una risposta antitumorale precoce dopo il trattamento ISAC, il priming dell'antigene delle cellule T fornisce in definitiva la clearance del tumore e gli effetti durevoli misurati in modelli completamente immunocompetenti. Questa combinazione sarebbe altamente desiderabile per i pazienti oncologici poiché il trattamento ISAC potrebbe portare a un'immunità antitumorale robusta e duratura. Per esplorare ulteriormente l'importanza dell'attivazione dei linfociti T mediata da ISAC, i topi sono guariti dai tumori CT26- rHER2 dopo rHER2 CL 264-Il trattamento ISAC è stato ripetuto, dopo 30 giorni di assenza da tumore, con la linea cellulare parentale CT26 non esprimente rHER2. Gli animali curati con rHER2-CT26 sono stati protetti dalla sfida con CT26 mentre gli animali naïve al tumore non sono stati in grado di rifiutare la crescita del tumore. Inoltre, per dimostrare che la protezione era specifica per la linea cellulare tumorale CT26, 4T1 è stato contemporaneamente impiantato nel fianco controlaterale di topi sfidati CT26 parentali. Sebbene i tumori CT26 non siano cresciuti nei topi curati con lei-CT26, la crescita del tumore 4T1 non è stata ostacolata e quindi fornisce la prova che l'immunità è specifica dell'antigene e dipende dalla risposta immunitaria adattativa. Inoltre, questi studi suggeriscono che gli ISAC mirati al tumore mediano la memoria immunologica non solo sull'antigene tumorale inizialmente mirato, ma anche sugli antigeni non mirati. Questi dati suggeriscono anche che le cellule mieloidi possono presentare antigeni associati al tumore che guidano ulteriori risposte CTL. Le implicazioni di questi risultati dimostrano che, anche se l'antigene tumorale bersaglio è successivamente sottoregolato o incapace di legarsi all'ISAC, la memoria immunologica è già stata invocata ed è in grado di sostenere una risposta duratura. Questa risposta non lo èlimitato all'antigene preso di mira dall'ISAC ma anche ad antigeni aggiuntivi, non identificati, espressi dal tumore.Presi insieme, questi dati indicano che gli ISAC suscitano una biologia qualitativamente e quantitativamente distinta relativa all'attivazione cellulare e alla presentazione dell'antigene, alla proliferazione delle cellule T e all'immunità antitumorale duratura.

Methods and Materials: Antibody Conjugation & Characterization For conjugation of adjuvants to the antibody, adjuvants were first synthesized to include a linker flanked by a reactive group. Conjugates produced using two-step methods were first synthesized through the modification of mAb lysine residues with a heterobifunctional crosslinker SATA. Deprotection of the acetylated thiol exposed a reactive thiol which was then reacted at room temperature for 2-4 hours with an adjuvant-linker flanked by a thio-reactive maleimide. For constructs produced using a single-step conjugation method, TFP esters were then conjugated to an IgG1 antibody. The TFP esters were dissolved in anhydrous DMSO to make a 20 mM stock solution and 5-10 molar equivalents (relative to the antibody) were added to the IgG antibody at 10 mg/mL in PBS. The conjugation reaction was performed at 4-40°C for 2-12 hours. The resulting immunoconjugates were buffer exchanged into PBS (pH 7.4) through desalting (Zeba Columns, Thermo Fisher Scientific) or dialysis to remove excess small molecular weight impurities. The final protein concentration was determined by measuring the absorbance at 280 nm on a Nanodrop 1000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific). The yields were >75 per cento sulla base di proteine ​​recuperate. L'analisi SEC ha rilevato una presenza aggregata minima e il DAR è stato determinato mediante analisi LC/MS. Gli ISAC purificati sono stati filtrati attraverso un filtro sterile 0.2 μm e conservati a -20 gradi fino all'uso. Le cellule reporter HEK Reporter AssayHEK293 che esprimono TLR7 umano o TLR8 umano sono state acquistate da Invivogen (hub-htlr7 o hub-htlr8) e i protocolli dei fornitori sono stati seguiti per la propagazione e la sperimentazione cellulare. In breve, le cellule sono state fatte crescere fino al 80-85 percento di confluenza al 5 percento di CO2 in DMEM integrato con il 10 percento di FBS, zeocina e blasticidina. Le cellule sono state quindi seminate in 96-piastre piatte a 4x104 cellule/pozzetto con substrato contenente un mezzo di rilevamento HEK e molecole immunostimolanti. L'attività è stata misurata utilizzando un lettore di piastre a una lunghezza d'onda di 620-655 nm. Analisi Biacore Le proteine ​​​​del recettore gamma Fc con tag His (FCGR) sono state ottenute da sistemi di ricerca e sviluppo (FCGR1 (CD64, cat# 1257-FC{{23}) }), FCGR2A (CD32a, cat# 1257-FC-050), FCGR2B (CD32b, cat# 1875-FC-050), FCGR3A (CD16a, cat# {{34 }}FC-050). L'analisi del legame è stata eseguita su uno strumento Biacore T200 in HBS-EP plus buffer (GE BR100669) utilizzando un chip CM5 (GE BR100530) contenente anticorpi anti-HIS immobilizzati (HIS Capture kit, GE 28995056 ). Rituximab o Rituximab-ISAC sono stati iniettati su celle a flusso contenenti FCGR catturati o solo un anticorpo anti-His della superficie di riferimento. I dati sono stati referenziati due volte con ilsuperficie anti-His e un'iniezione di solo tampone. È stato utilizzato un metodo di titolazione cinetica e le superfici sono state rigenerate tra i cicli mediante iniezione di glicina 10 mM, pH 1,5. I dati sono stati adattati utilizzando il software di valutazione Biacore T200 (V3.1) utilizzando l'adattamento cinetico (1:1) per FCGR1 e FCGR3A (media di 6 esecuzioni) e l'affinità allo stato stazionario (1:1) per FCGR2A e FCGR2B (media di 3 esecuzioni) ).

Human Myeloid APC Isolation Myeloid APCs, which predominantly consisted of monocytes (>95%), were isolated from the whole blood of healthy donors (Stanford Blood Center) by density gradient centrifugation using a RosetteSep Human Monocyte Enrichment Cocktail (Stem Cell Technologies). Myeloid APCs were further isolated using a negative selection Human Monocyte Enrichment Kit without CD16 depletion (Stem Cell Technologies) to a final purity of >90 percento come determinato dalla citometria a flusso basata sull'espressione CD14, CD16, CD11c e HLA-DR.Preparazione delle cellule tumorali di ToledoLe cellule di Toledo (ATCC) sono state coltivate in terreni consigliati dal fornitore e mantenute a densità cellulari consigliate dal fornitore (ATCC). Le cellule sono state rimosse dalla coltura, lavate e risospese in PBS con FBS al 2% e EDTA 2 mM a 1-10x106 cellule/mL. In alcuni casi, le cellule sono state successivamente etichettate con 2 μM di CFSE per 2 minuti e quindi lavate una volta con RPMI-1640 (Lonza) integrato con FBS al 10% (Atlanta Biologicals) e 100 U/mL Pen/Strep (Lonza). Le cellule sono state quindi fissate in paraformaldeide al 2% e lavate tre volte con PBS prima di un ulteriore utilizzo. Saggi di attivazione cellulare PBMC o monociti isolati sono stati piastrati rispettivamente a 3x105 o 2x105 cellule per pozzetto, in piastre a fondo piatto, 96- in IMDM integrato con il 10% di FBS (Atlanta Biologicals), 1 mM di piruvato di sodio (Lonza), 100 μM di aminoacidi non essenziali (Lonza) e 100 U/mL Pen/Strep (Lonza). Per gli esperimenti di co-coltura di monociti e tumori, i monociti sono stati coltivati ​​con cellule tumorali allogeniche fisse con un rapporto di 3 a 1. Le cellule sono state successivamente incubate con agenti immunostimolatori o controlli per 18-36 ore a 37 gradi con il 10% di CO2. L'attivazione cellulare è stata misurata attraverso l'espressione sulla superficie cellulare dei marcatori di attivazione e la produzione di citochine. I livelli di espressione dei marcatori di superficie sono stati misurati mediante citometria a flusso con anticorpi contro CD40 (5C3, BD), CD86 (IT2.2, BD), HLA-DR (L243, BD) e CD16 (3G8, BD), CD14 (MΦP9, BD) e CD123 (7G3, BD). I PBMC sono stati analizzati mediante citometria a flusso con anticorpi contro i suddetti marcatori di attivazione e marcatori di lignaggio CD19 (HIB19, BD), CD56 (B159, BD), CD3 (SK7, BD), CD4 (OKT4, BioLegend), CD8 (SK1, BD) e CD69 (FN50, BD). In tutti i casi, il supernatante della coltura cellulare è stato raccolto dopo 18 o 36- ore di incubazione e la produzione di citochine è stata misurata utilizzando kit di array di microsfere di citochine (Kit di citochine infiammatorie umane, BD Biosciences) ed ELISA (kit TNF Human ELISA, eBiosciences) .Citometria di massa I PBMC sono stati isolati dal sangue di un donatore sano e stimolati con ISAC, una miscela di anticorpo e adiuvante, o nessuno stimolo per 5-15 minuti a 37 gradi. Dopo la stimolazione, le cellulesono stati fissati aggiungendo il 16% di PFA (scienze di microscopia elettronica) a una concentrazione finale dell'1,6% e incubati per 10 minuti a temperatura ambiente (RT). Le cellule fisse sono state lavate con mezzo di colorazione cellulare (CSM; PBS con 0,5 percento di BSA e 0,02 percento di sodio azide (tutti Sigma) e codificate a barre utilizzando un approccio a base di palladio come descritto in precedenza 54. I campioni con codice a barre sono stati combinati in uno solo campione composito per la colorazione della superficie.

La colorazione della superficie è stata eseguita aggiungendo anticorpi (tabella supplementare 2) in CSM e incubando per 3{{1{12}}}} minuti a temperatura ambiente. Gli anticorpi antiumani sono stati acquistati coniugati (Fluidigm) o coniugati con isotopi di metalli pesanti utilizzando il kit di etichettatura degli anticorpi MaxPar X8 (Fluidigm) secondo le raccomandazioni del produttore. Le cellule colorate in superficie sono state lavate una volta in CSM e permeabilizzate con MeOH per 10 minuti su ghiaccio. Le cellule permeabili sono state lavate due volte con CSM e sono stati aggiunti anticorpi contro antigeni intracellulari per 30 minuti a temperatura ambiente. Le cellule sono state lavate con CSM e infine risospese in soluzione di intercalazione (1,6% di PFA in PBS, 0,02% di saponina (Sigma) e 0,5 μM di intercalante di iridio (Fluidigm)) durante la notte a 4 gradi. Prima dell'acquisizione dei dati, i campioni sono stati lavati una volta in CSM e due volte in ddH2O. Tutti i campioni sono stati filtrati attraverso un colino cellulare (Falcon) e risospesi a 1x106 cellule/mL in ddH2O integrato con 1x EQ perline di calibrazione a quattro elementi (Fluidigm) e dati acquisiti su un citometro di massa CyTOF2 (Fluidigm). Le risposte di segnalazione sono state valutate utilizzando l'implementazione SPADE all'interno di Citibank 29. Le analisi sono state eseguite su tutte le cellule (nessun down-sampling), scegliendo il numero dichiarato di cluster e utilizzando tutti i marcatori di superficie rilevanti ma nessun marcatore intracellulare per il clustering. I lignaggi delle cellule immunitarie sono stati annotati in base ai loro modelli di espressione proteica di superficie ad alta dimensione. Le analisi statistiche sono state condotte in R, un ambiente software statistico open source. All'interno di ciascun sottogruppo di cellule, gruppo di trattamento e donatore, è stata calcolata la variazione media della piega per i seguenti venti marcatori di fosfoproteine: p-Src, p-STAT5, p-cMET, p-AKT, p-MAPKAPK2, p-SHP2, p -SLP76, p-IRF-7, p-ZAP70/SYK, p-CREB, p-NFKB, p-PI3K, IKB (totale), p-PLCG1, p-ERK1/2, p-p38, p -BTK/ITK, p-S6, p-STAT3 e p-JNK/SAPK. La variazione media della piega è stata ponderata in base al numero totale di celle in ciascun cluster, come definito in seguito al clustering SPADE. Sono stati condotti test t accoppiati per stimare la differenza nella variazione media della piega e per testare l'ipotesi nulla che non vi fosse alcuna differenza nella variazione media della piega di ciascun marker tra le condizioni di trattamento e di controllo.

Procedura sperimentale del modello di tumore xenotrapiantoLe linee cellulari tumorali sono state acquistate da ATCC (NCI-N87, HCC1954 e COLO205) o AddexBio (JIMT-1) e coltivate secondo le linee guida del produttore. Le cellule sono state raccolte quando hanno raggiunto la confluenza del 80-90 percento staccandole con Accutase (Stemcell), lavate con PBS, risospese a 40 x 106 cellule/mL in PBS e poste in ghiaccio per non più di due ore. Immediatamente prima dell'impianto, le cellule sospese sono state mescolate con un volume uguale di Cultrex PathClear BME, tipo 3 (sistemi di ricerca e sviluppo) e 100 μL della miscela (2 x 106 cellule) sono stati impiantati per via sottocutanea nel fianco destro di 6-8- settimana -vecchi topi femmina come segue: cellule NCI-N87 e COLO205 sono state impiantate in topi NSG (Jackson Laboratory), cellule HCC1954 e JIMT-1 sono state impiantate in Rag2/IL2rg double knockout (Taconic) e HCC1954 (per la valutazione con T785-ISAC) sono stati impiantati in NSG oTopi SCID/beige (Jackson Laboratory o Taconic ed Envigo). La dimensione del tumore è stata registrata due volte a settimana ed è stata stimata utilizzando la seguente formula: (lunghezza x larghezza2)/2. Una volta che i tumori hanno raggiunto 50-100 mm3, di solito entro una settimana dall'impianto del tumore, sono stati avviati i trattamenti. I topi sono stati randomizzati in base alle dimensioni del tumore in gruppi di trattamento prima del trattamento iniziale. Trastuzumab (EirGenix; EG12014), Trastuzumab ISAC o Isotype ISAC è stato preparato in PBS a 1 mg/mL e somministrato a 5 mg/kg per via intraperitoneale ogni cinque giorni (Q5D) per un totale di sei dosi. I topi i cui tumori superavano i 2000 mm3 sono stati sottoposti a eutanasia.

Procedura sperimentale di deplezione cellulare HCC1954 e MMC Per esaurire i macrofagi e altre cellule fagocitiche, i topi portatori di tumori HCC1954 o MMC sono stati trattati tramite iniezione intraperitoneale due giorni prima del trattamento ISAC iniziale con liposomi di clodronato o liposomi di controllo non contenenti clodronato come controllo negativo (Encapsula, Catalog # CLD-8901) e poi trattati due volte a settimana per un totale di tre settimane. Per esaurire i neutrofili, i topi sono stati trattati con anticorpi esaurienti 1A8 per esaurire solo Ly6G più neutrofili (BioXCell Catalog # BE0075-1) o RB6-8C5 per esaurire cellule Gr1 più, che include Ly6G più neutrofili e Ly6C più cellule (BioXCell Catalog # BE0075) o controlli isotipici 2A3 e LTF-2 (BioXCell Catalog # BE0089 e BE0090, rispettivamente) due giorni prima del trattamento ISAC iniziale, quindi trattati due volte a settimana per tre settimane. L'esaurimento delle cellule nel sangue è stato confermato dalla citometria a flusso (Figura 24 supplementare). Procedura di analisi di citochine tumorali e mRNA I tumori sono stati impiantati come descritto in precedenza e sono stati raccolti per l'analisi nei punti temporali indicati dopo il trattamento. Per l'analisi dell'immunoistochimica e dell'mRNA, i tumori sono stati divisi e l'mRNA è stato analizzato con il pannello di profilazione immunitaria contro il cancro del topo NanoString. L'analisi dei dati è stata eseguita con il software di analisi avanzata nSolver secondo le raccomandazioni del produttore. I grafici del vulcano sono stati disegnati con il pacchetto ggplot2 in R. Per ottenere lisati tumorali per l'analisi delle citochine, i frammenti tumorali sono stati conservati in un tampone prefabbricato (1 compresse di inibitore della proteasi Pierce (Thermo Fisher, catalogo n. A32965) disciolte in 20 ml di T- PER Tissue Protein Extraction Reagent, Thermo Fisher, n. di catalogo 78510) in provette GentleMACS M (Miltenyi, n. di catalogo 130-093-236) subito dopo l'autopsia. I campioni di tumore sono stati quindi dissociati utilizzando un GentleMACS Octo Dissociator. Tutti i campioni sono stati centrifugati per 5 minuti a 300 g dopo. I supernatanti sono stati quindi raccolti in provette per microcentrifuga e sono stati nuovamente centrifugati con una microcentrifuga. L'analisi delle citochine è stata eseguita sui supernatanti mediante MSD. L'immunoistochimica è stata eseguita utilizzando ematossilina ed eosina per identificare l'architettura dei tessuti, nonché per i seguenti marcatori dove indicato negli studi: CD11c (CST Catalog #87585) e CD8 (CST Catalog #98941).

Figura 4: I T785-ISAC suscitano una solida immunità antitumorale nei modelli di xenotrapianto tumorale resistenti al trastuzumab. (ad) I topi SCID/Beige o NSG sono stati impiantati con la linea cellulare tumorale HCC1954 e sono stati randomizzati quando il volume del tumore ha raggiunto 50 – 75 mm3. (a) I topi sono stati trattati una volta per via intraperitoneale (IP) con 5 mg/kg di trastuzumab T785-ISAC o trastuzumab, o con un dosaggio molare equivalente con una miscela di trastuzumab e T785 all'ISAC tramite iniezione intratumorale (IT). I dati provengono da un esperimento con n=3-5 topi per gruppo. (b) I topi sono stati trattati tramite iniezione intraperitoneale con 5 mg/kg di trastuzumab, trastuzumab-ISAC,rituximab o rituximab-ISAC Q5DX6 (n= 5 topi per gruppo). (c) I topi sono stati trattati tramite iniezione intraperitoneale con 5 mg/kg di trastuzumab, trastuzumab T785-ISAC, trastuzumab N297A-ISAC o trastuzumab TLRnull-ISAC (n=5 topi per gruppo). (d) Le cellule tumorali HCC1954 sono state impiantate in topi SCID/Beige e le cellule di interesse sono state esaurite prima e durante il trattamento con trastuzumab T785-ISAC (5 mg/kg, Q5DX3) utilizzando l'anticorpo anti-Ly6G (controllo IgG2a di ratto) , liposomi clodronato (liposomi di controllo come controllo) o anticorpi anti-Gr1 (controllo IgG2b di ratto). I dati provengono da un esperimento con n=4-6 topi per gruppo. (e, f) I topi a doppio knockout NSG o Rag2/IL2rg sono stati impiantati con la linea cellulare tumorale JIMT-1 e randomizzati quando il volume del tumore ha raggiunto 50-75 mm3. I topi sono stati successivamente trattati con i trattamenti indicati a 5 mg/kg per via intraperitoneale con una frequenza di (e) Q5DX6o (f) Q5DX5 (n=3-6 topi per gruppo). (bf) I dati mostrati sono rappresentativi di almeno due esperimenti. (gj) I tumori HCC-1954 sono stati raccolti da coorti di topi nei momenti indicati dopo il trattamento con una singola dose di 5 mg/kg ISAC o anticorpi di controllo. I tumori sono stati elaborati per l'analisi della citometria a flusso, la quantificazione dell'mRNA di NanoString o fissati in formalina e inclusi in paraffina per l'immunoistochimica. (g) I grafici del vulcano descrivono il cambiamento di log2 volte dell'espressione genica nei tumori trattati rispetto al controllo dell'isotipo misurati da NanoString a 24 ore (n=5 topi per gruppo). Le modifiche con un valore p aggiustato di < 0.05="" sono="" mostrate="" in="" rosso.="" (h)="" punteggi="" della="" firma="" genica="" quantificati="" da="" nsolver="" advanced="" analysis="" pathway="" score="" per="" i="" tumori="" analizzati="" 24="" ore="" dopo="" il="" trattamento="" (n="5" topi="" per="" gruppo).="" (i)="" analisi="" della="" citometria="" a="" flusso="" della="" composizione="" cellulare="" tumorale="" 24="" ore="" e="" 7="" giorni="" dopo="" il="" trattamento="" (n="2-4" topi="" per="" gruppo).="" i="" dati="" sono="" rappresentativi="" di="" almeno="" 2="" esperimenti.="" (j)="" immagini="" rappresentative="" e="" quantificazione="" di="" f4/80="" e="" cd11c="" ihc="" di="" tumori="" raccolti="" 9="" giorni="" dopo="" ogni="" trattamento="" indicato.="" le="" barre="" della="" scala="" sono="" 50="" μm.="" (aj)="" i="" dati="" sono="" mostrati="" come="" medi="" con="" sem="" e="" le="" statistiche="" sono="" mostrate="" con=""><0.05,><0.01,><0.001,><>

Procedura sperimentale del modello di tumore singenico Le cellule MMC sono state ottenute dal Dr. Disis (Università di Washington) e sono state coltivate in RPMI 1640 integrato con il 20 percento di FBS, l'1 percento di penicillina-streptomicina e L-glutamina a 37 gradi e il 5 percento di CO2 fino a {{8 }} percentuale confluente. Le cellule CT26 (ATCC) trasfettate per esprimere stabilmente la proteina HER2 di ratto sono state coltivate in RPMI 1640 integrato con il 10 percento di FBS e 600 ug/ml di antibiotico selettivo (Thermo) G418 a 37 gradi e 5 percento di CO2 fino al 80-90 percento confluente. Una volta sufficientemente confluenti, le cellule sono state raccolte staccando con Accutase (Stemcell) e lavando con PBS. Le cellule raccolte sono state risospese a 20 x 106 cellule/mL (MMC)o 5 x 106 cellule/mL (CT26-rHER2) in PBS e mantenute a 4 gradi/in ghiaccio fino all'uso. 100 mldi cellule sospese sono state impiantate per via sottocutanea in 6-8-topi FVB/N-TgN(MMTV-Erbb2)NK1Mul/Jmice di una settimana (modello MMC, The Jackson Laboratory) o topi BALB/c femmine (modello CT26, The Jackson Laboratory) . La dimensione del tumore è stata misurata e registrata due volteuna settimana per tutta la durata dello studio. Il volume del tumore è stato stimato utilizzando la seguente formula: (lunghezza x larghezza2)/2. Una volta che i tumori hanno raggiunto 200-500 mm3 (MMC) o 50-100 mm3 (CT26-rHER2), di solito entro una settimana dall'impianto del tumore, sono stati avviati i trattamenti. I topi sono stati randomizzati in base alle dimensioni del tumore in gruppi di trattamento prima dell'inizialetrattamento. Gli anti-rHER2 mAb (BioXCell; 7.16.4) o anti-rHER2-ISAC sono stati somministrati per via intraperitoneale (frequenza come indicato nelle legende delle figure) per la durata dello studio.I topi i cui tumori superavano i 2000 mm3 sono stati sottoposti a eutanasia. È stata valutata la deplezione dei linfociti Tnegli animali che utilizzano anticorpi che riducono le cellule CD4 (BioXCell; GK1.5) o CD8 (BioXCell; YTS 169.4). L'esaurimento è stato avviato prima dell'impianto del tumore e continuato con la somministrazione bisettimanale di 200 ug per anticorpo. Per il rechallenge del tumore, le linee cellulari CT26 e 4T1 sono state impiantate a 5 x 106 cellule per linea tumorale e i topi naïve al tumore sono stati sfidati con entrambe le linee cellulari come controlli.

Materiale supplementare Fare riferimento alla versione Web su PubMed Central per materiale supplementare. Ringraziamenti: gli autori desiderano ringraziare P. Basto, NE Reticker-Flynn, T. Prestwood e B. Mallet per la loro utile discussione. Ringraziamo anche lo Stanford Blood Center Flow Cytometry Core, in particolare L. Tolentino, O. Choi e N.Wu. Estendiamo inoltre il nostro apprezzamento alla dott.ssa Mary L. (Nora) Disis e Denise Cecil dell'Università di Washington che hanno fornito la linea cellulare tumorale MMC.

Finanziamento: SE Ackerman è stato sostenuto da una borsa di studio Stanford BioX Bowes.

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Figura 6: CL264-contenenti ISAC provocano la clearance del tumore in xenotrapianti che esprimono il mezzo HER2 e clearance del tumore mediata da cellule T, memoria immunologica e diffusione dell'epitopo in un modello tumorale singenico. (a) Strutture chimiche dei coadiuvanti T785 e CL264 utilizzati per la generazione ISAC. (b) I topi NSG impiantati con la linea cellulare tumorale HCC1954 sono stati randomizzati quando il volume del tumore ha raggiunto 50 – 75 mm3. I topi sono stati trattati una volta tramite iniezione intraperitoneale di 5 mg/kg di trastuzumab, trastuzumab T785-ISAC o trastuzumab CL264-ISAC. I tumori sono stati raccolti 20 ore dopo la somministrazione, trasformati in una sospensione cellulare singola e analizzati mediante citometria a flusso per valutare l'attivazione di APC mieloidi infiltranti il ​​tumore. (cd) I topi a doppio knockout NSG o Rag2/IL2rg sono stati impiantati con la linea cellulare tumorale umana indicata e randomizzati quando il volume del tumore ha raggiunto 50 – 75 mm3 (HCC1954) o 75 – 150 mm3 (JIMT-1). I topi sono stati trattati tramite iniezione intraperitoneale con 5 mg/kg di rituximab, trastuzumab, trastuzumab T785-ISAC, trastuzumab CL264-ISAC o il rispettivo isotipo-ISAC, ogni 5 giorni per un totale di 6 trattamenti. (e) l'espressione di rHER2 è stata misurata su cellule tumorali CT26-rHER2 in coltura prima dell'impianto (trama di flusso a sinistra) e nei tumori nove giorni dopo l'impianto (trama di flusso a destra) mediante citometria a flusso con anticorpo anti-rHER2 coniugato in modo fluorescente (rosso) o controllo isotipico (blu). (f) I topi Balb/c sono stati impiantati con la linea cellulare tumorale CT26-rHER2 e sono stati randomizzati quando il volume del tumore ha raggiunto 50mm3. I topi sono stati quindi trattati tramite iniezione intraperitoneale con 10 mg/kg di topo anti-rattoHER2 o topo anti-ratto HER2 CL264-ISAC ogni 5 giorni per un totale di 6 trattamenti. I dati mostrati provengono da 1 esperimento con 8 topi per braccio e sono rappresentativi di 3 esperimenti.

(g) Anti-rat HER2 CL264-ISAC treated mice that experienced complete tumor regression for >21 giorni dopo il loro ultimo trattamento sono stati sfidati con linee cellulari parentali CT26 (fianco sinistro) e 4T1 (fianco destro), con o senza deplezione delle cellule T CD4 e CD8 (n =3 ciascuna). Come controlli sono stati inclusi topi naïve al tumore (n=6) sfidati con le linee cellulari parentali CT26 e 4T1. (ai) I dati sono mostrati da singoli esperimenti con 3-6 topi per braccio e sono rappresentativi di 1-4 esperimenti con un minimo di 3 topi per braccio in ciascun esperimento. I dati sono mostrati come media con SEM e le statistiche sono mostrate con *P<><0.01,><0.001, and=""><>

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