I coniugati di anticorpi immunostimolanti suscitano una robusta attivazione mieloide e un'immunità antitumorale duratura (parte 1)

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Astratto

I recettori innati di riconoscimento del pattern, inclusi i recettori toll-like (TLR), possono alterare il microambiente tumorale e l'immunità antitumorale adattativa primaria.Tuttavia, gli agonisti del TLR non sono stati ben tollerati a causa delle tossicità associate all'attivazione immunitaria diffusa in seguito alla somministrazione sistemica.Per progettare una terapia che sia adatta per la consegna sistemica ein grado di suscitare una risposta mirata al tumore, abbiamo sviluppato una nuova classe di coniugati di anticorpi immunostimolanti (ISAC) comprendente un agonista TLR7/8 coniugato ad anticorpi mirati al tumore.Gli ISAC anti-HER2 somministrati per via sistemica sono stati ben tollerati in vivo e hanno suscitato una robusta attivazione delle cellule mieloidi intratumorali, con conseguente clearance del tumore e successiva memoria immunologica.La potenza in vitro e l'efficacia in vivo hanno richiesto un'attività tandem guidata dalla funzionalità Fc intatta e dall'agonismo del TLR per consentire la fagocitosi e l'immunità antitumorale mediata dai linfociti T.La memoria immunologica mediata da ISAC non era limitata a HER2, poiché i topi trattati con ISAC erano protetti dal rechallange con un tumore HER2-negativo.Questi risultati forniscono una forte motivazione per lo sviluppo clinico degli ISAC e mostrano che la sinergia tra la segnalazione Fc R e TLR7/8 contribuisce al meccanismo dell'immunità antitumorale mediata dall'ISAC.

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introduzione

Prima della fine del 20° secolo, i malati di cancro avevano generalmente tre modalità di trattamento disponibili: resezione chirurgica, radioterapia e chemioterapia. L'emergere dell'immunoterapia del cancro ha aggiunto una potente quarta modalità che ha notevolmente ampliato il repertorio oncologico a partire dall'approvazione del rituximab per il linfoma non Hodgkin e estendendosi all'adozione diffusa di inibitori del checkpoint 1,2. Tuttavia, qualsiasi terapia, inclusa l'immunoterapia, è temporalmente limitata a meno che non generi risposte biologiche e immunologiche durature che superino l'eterogeneità del tumore e il carico mutazionale 3–5. Gli inibitori del checkpoint come gli anticorpi anti-PD-1 e PD-L1 migliorano notevolmente i risultati in diverse indicazioni, compresi i pazienti con elevato carico mutazionale tumorale o instabilità dei microsatelliti, e un determinante della suscettibilità del tumore all'immunoterapia del checkpoint è l'entità della pre -infiltrazione di cellule T esistente. I pazienti con tumori "freddi" che hanno un infiltrato di cellule T sparse sono meno reattivi al blocco del checkpoint e hanno prognosi più sfavorevoli rispetto ai pazienti con tumori "caldi" in cui sono presenti cellule T reattive al tumore immunosoppresse all'interno del microambiente tumorale (TME) 6,7 . La biopsia tumorale e l'immunoistochimica indicano che le cellule presentanti l'antigene (APC) professionali come le cellule dendritiche (DC) sono spesso più frequenti all'interno della TME rispetto alle cellule T, sebbene ancora suscettibili ai meccanismi immunosoppressivi 8,9. Data la presenza di cellule mieloidi nella TME e il loro ruolo nella promozione dell'attivazione dei linfociti T, c'è stato uno sforzo crescente per sviluppare terapie che attivino le APC associate al tumore per suscitare un'immunità diffusa dei linfociti T e un'efficace risposta immunitaria antitumorale.

Figure 1: ISAC Design and Characterization. (a) Chemical structure of T785 (b) HEK-Blue-TLR7 or TLR8 reporter cells were cultured for 18 hours in the presence of T785, R848, or Poly-ICLC before the assessment of NF-κB- induced SEAP activity. Data shown are from 8 experiments and EC50 values are calculated as mean with SEM. (c) Freshly isolated human myeloid APCs were stimulated with 1 μM of T785 or R848 for 18 hours before the assessment of myeloid activation by flow cytometry. Data are from 1 experiment with 3 donors and are representative of >9 donatori. (d) Rituximab è stato fatto reagire con SATA tramite residui di lisina per convertire le ammine libere in gruppi sulfidrilici protetti prima della deacetilazione con idrossilammina e successiva reazione con T785-MCC per produrre il rituximab-ISAC. (e) Analisi LC-MS del rituximab-ISAC dopo il trattamento con PNGasi F. Il DAR è stato calcolato sulla base dell'aggiunta di massa del linker-agonista di 606 g/mol. ( f ) Rituximab o rituximab-ISAC marcato in modo fluorescente è stato incubato con cellule tumorali CD20 più Toledo a 4 gradi per 2 ore prima dell'analisi tramite citometria a flusso. I dati provengono da 1 esperimento con campioni triplicati e sono rappresentativi di 2 esperimenti.(gh) Le APC mieloidi umane appena isolate sono state coltivate con rituximab, T785, rituximab e T785 o rituximab-ISAC in presenza di CD20 marcate con CFSE più cellule tumorali di Toledo con un rapporto effettore-bersaglio di 3:1. La concentrazione di rituximab è raffigurata sull'asse X con la concentrazione di T785 in questi test che è coerente con la quantità di T785

conjugated to the rituximab-ISAC. (g) Hoffman modulation contrast microscopy showed at 40X magnification after (g) 18 hours following stimulation with 80 nM of rituximab-ISAC. Data are representative of >10 donors. (h) Myeloid APCs were analyzed via flow cytometry 18 hours after stimulation. Data shown are from 3 donors and are representative of >10 donatori (media e SEM); *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

È ora ben documentato che la somministrazione locale di agenti immunostimolatori nei modelli preclinici può riprogrammare le APC residenti nel tumore soppresse in cellule attivate in grado di elaborare e presentare antigeni associati al tumore, inclusi i neoantigeni, ai linfociti T che successivamente mediano l'immunità antitumorale 10-13 . Una di queste strategie sperimentata da Carmi et al ha dimostrato che la somministrazione intratumorale di anticorpi allogenici mirati al tumore con un agonista del recettore Toll-like (TLR){7}} o con TNF e CD40L ha salvato funzionalmente le APC associate al tumore portando a un maggiore assorbimento dell'antigene e successiva induzione dell'immunità dei linfociti T antitumorali. Questa strategia di combinazione, che ha sfruttato la funzione dell'effettore dell'anticorpo con l'agonista del TLR, ha portato all'eradicazione dei tumori primari e delle lesioni metastatiche e ha protetto l'ospite dalla recidiva del tumore 11,14. Allo stesso modo, un anticorpo agonistico anti-OX40 in combinazione con un agonista TLR9, CpG, APC attivati ​​e cellule T all'interno del tumore, risultando in un'efficacia impressionante contro più tipi di tumore nei topi 13. L'efficace traduzione delle strategie di attivazione delle APC nella clinica è in corso studiato in molteplici indicazioni con dati clinici in pazienti con melanoma che suggeriscono che la somministrazione intratumorale di agonisti del TLR9 in combinazione con anticorpi anti-PD-1 può portare al restringimento del tumore e a risposte abscopali nelle lesioni non iniettate 15. Allo stesso modo, diversi i gruppi stanno perseguendo gli agonisti TLR7/8 per l'immunoterapia tumorale poiché il pattern di espressione di TLR7/8 negli APC umani rispecchia più da vicino il pattern di espressione di TLR7 e TLR9 negli APC murini16-18. In definitiva, l'adozione di strategie di somministrazione intratumorale, se efficaci, sarà limitata dall'accessibilità del tumore poiché la somministrazione sistemica di agonisti immunitari mirati alle APC è stata limitata da tossicità, emivite brevi e consegna non ottimale ai siti target.Il nostro obiettivo era progettare un anticorpo coniugato immunostimolante (ISAC) comprendente un anticorpo monoclonale mirato al tumore coniugato a un immunoagonista come un nuovo approccio terapeutico per suscitare un'immunità antitumorale duratura. La somministrazione sistemica dell'ISAC ha provocato l'attivazione localizzata di APC nel TME che dipendeva da Fcfunzione effettrice e attivazione del TLR aggirando le tipiche tossicità associate alla somministrazione sistemica di agonisti del TLR. Inoltre, la somministrazione sistemica di questi coniugati a topi portatori di tumore ha consentito l'elaborazione e la presentazione dell'antigene ai linfociti T portando a un'immunità antitumorale sostenuta in più modelli resistenti all'anticorpo non coniugato mirato al tumore.

Risultati

Progettazione e caratterizzazione ISAC Per consentire la coniugazione di un agonista TLR con un anticorpo, sono stati utilizzati strumenti di docking molecolare per progettare un nuovo agonista TLR7/8 (T785) con una butil-ammina che fungeva da punto di attacco accessibile al solvente per l'anticorpo ( Figura 1A, Figura supplementare 1A-C). T785 ha coinvolto il TLR7 umano con un EC50 di 0,643 μM e il TLR8 umano con un EC50 di 1,60 μM in linee cellulari HEK293 che co-esprimono un reporter di fosfatasi alcalina secreta inducibile da NF-κB e TLR7 o TLR8 (Figura 1B ). La specificità di T785 per TLR7/8 è stata confermata dall'incapacità di T785 di indurre l'attività NF-κB nelle cellule reporter HEK293 prive di espressione TLR7/8 (Figura 2A supplementare). Per confermare l'attività agonistica nelle cellule primarie, monociti e DC appena isolati, chiamati APC mieloidi (~ 96% di monociti, 4% DC; Figura 3A supplementare), che esprimono sia TLR7 che TLR8, sono stati stimolati durante la notte con 1 μM T785 o R848, un agonista TLR7/8 ben consolidato e caratterizzato 19. T785 e R848 hanno stimolato le APC mieloidi in misura simile (Figura 1C) 20,21. L'attività di T785 è stata confermata anche in DC plasmacitoidi umani appena isolati (pDC), che esprimono TLR7 ma non TLR8 (Figura 2B supplementare). Per studiare gli effetti degli ISAC nelle colture umane in vitro, è stato generato un ISAC con rituximab (Figura 1D), un anticorpo monoclonale anti-CD20 clinicamente validato utilizzato per il trattamento dei tumori maligni delle cellule B, mediante coniugazione a T785 in una reazione a più fasi con reticolanti eterobifunzionali compatibili 22. L'efficienza di coniugazione T785-ISAC è stata misurata mediante LC-MS dopo la deglicosilazione con PNGasi F, risultando in un rapporto farmaco-anticorpo (DAR) medio di 1,71 (Figura 1E). Abbiamo confermato che l'ISAC ha mantenuto un legame paragonabile al CD20 a seguito di esperimenti di citometria a flusso con il CD20- che esprime la linea cellulare tumorale di Toledo, una linea cellulare ben caratterizzata derivata da un paziente con linfoma diffuso a grandi cellule (Figura 1F) 23. T 785-Il legame dell'ISAC ai recettori Fc umani (FCGR3A, FCGR2A, FCGR2B, FCGR1) è stato valutato da Biacore ed era paragonabile a rituximab (tabella supplementare 1). Gli ISAC attivano le APC mieloidi umane Il potenziale immunostimolante del rituximab T{{77 }} L'ISAC è stato valutato dopo la cocoltura di APC mieloidi umane appena isolate con cellule tumorali CD20 marcate con CFSE più cellule tumorali di Toledo per 18 ore. Le APC mieloidi coltivate con rituximab T785-ISAC hanno subito rapidi cambiamenti morfologici coerenti con la morfologia delle DC, mentre la morfologia delle DC non era osservato in coculture incubate con rituximab, T785 o una miscela equimolare di rituximab e T785 (Figura 1G). Gli APC stimolati con rituximab T785- ISAC sono rimasti vitali e dendritici nella morfologia per un massimo di otto giorni, mentre gli APC stimolati con la miscela erano per lo più non vitali entro l'ottavo giorno (Figura 1H). Analisi di citometria a flusso multicoloredopo 18 ore ha indicato che le APC stimolate con rituximab T785-ISAC hanno sottoregolato CD14 e CD16 e contemporaneamente sovraregolato CD123, un marcatore della superficie cellulare mostratoessere sovraregolato sulle DC mieloidi attivate 24. Al contrario, le APC stimolate con rituximab,T785 o la miscela non hanno modulato l'espressione di questi marcatori (Figura 1I, Figura 4A supplementare, strategia di gating descritta nelle Figure 3BC supplementari).

Le APC umane stimolate con rituximab T785-ISAC hanno anche sovraregolato la molecola di costimolazione CD86 in modo dose-dipendente, con tendenze simili osservate con CD40 e sovraregolazione HLA-DR coerenti con il fenotipo delle APC attivate (Figura 1I & Figura supplementare 4B). I cambiamenti dose-dipendenti nell'espressione del marcatore di superficie erano coerenti se valutati come intensità di fluorescenza mediana (MFI, Figura 1) o come percentuale della popolazione totale di cellule positiva per il rispettivo marcatore (Figura 5 supplementare). La successiva analisi dei supernatanti privi di cellule ha dimostrato che gli APC stimolati da rituximab T785-ISAC hanno secreto quantità maggiori di TNF e IL-1 (Figura 2J e Figura 4C supplementare). Il potenziale immunostimolante degli ISAC T785- non era limitato al rituximab, poiché un ISAC T785- generato con trastuzumab ha anche suscitato un'attivazione mieloide potenziata (Figura 4D supplementare). La capacità delle APC stimolate dall'ISAC di suscitare la presentazione dell'antigene e il cross-priming delle cellule T CD8 più è stata valutata utilizzando il sistema di antigene modello di ovalbumina (OVA) 25,26. Le CD11c spleniche più le DC isolate da topi wildtype sono state coltivate durante la notte con immunocomplessi formati con OVA e l'anticorpo anti-OVA o ISAC. Le DC caricate con OVA sono state quantificate e incubate con OT-I CD8 più cellule T recanti specificità TCR per il peptide OVA, SIINFEKL, complessate con MHC-I. Presentazioni incrociate avanzate mediate da ISAC anti-OVA, misurate dalla quantità di MHC-I, peptide SIINFEKL legato e cross-priming potenziato misurato dalla proliferazione dei linfociti T CD8 più (Figure supplementari 6A e 6B). Gli ISAC suscitano TLR amplificati e segnalazione intracellulare associata a Fc R nelle APC mieloidi umane L'attivazione di Fc Rs e TLR induce una complessa cascata di fosfo-segnalazione e l'entità e le caratteristiche di queste risposte differiscono tra i vari sottoinsiemi di cellule immunitarie 27. Abbiamo studiato le vie di segnalazione intracellulare a valle impegnate in vari tipi cellulari all'interno di coculture di PBMC-tumorale stimolate con rituximab T785-ISAC rispetto ai controlli della miscela equimolare mediante citometria di massa (CyTOF) 28. I sottogruppi di leucociti (cioè monociti, CD4 più cellule T) sono stati identificati tramite raggruppamento SPADE utilizzando marcatori di lignaggio con cellule bersaglio che comprendono sia CD20 più cellule tumorali di Toledo che cellule B sane 29. Eventi di fosforilazione associati alla segnalazione di TLR (pIRF7) e Fc R (pERK1/2) sono stati aumentati 15 minuti dopo la stimolazione con T785-ISAC in monociti e cDC, rispetto alla miscela dei singoli componenti 30,31. La segnalazione intracellulare era in gran parte limitata alle cellule di origine mieloide (monociti e cDC) così come alle pDC, chetutti esprimono i requisiti Fc Rs e TLR7 e/o TLR8. Nei monociti e nei cDC, la stimolazione indotta dall'ISAC ha anche comportato una fosforilazione significativamente più elevata di MAPKAPK2, p38, CREB e proteina ribosomiale S6 (RPS6), un requisito per l'avvio della sintesi proteica a valle (Figura 2A-C e Figura 7A supplementare). CD141 più cDC e CD1c più cDC hanno mostrato livelli comparabili di pIRF7 in entrambi i sottogruppi di CDC, mentre i livelli di RPS6 e pERK1/2 hanno mostrato un andamento più alto nei CD141 più cDC, che eccellono nel priming dei linfociti T CD8 più e nella presentazione incrociata dell'antigene, rispetto a CD1c più CDC (Figura supplementare 7B).

La cinetica della stimolazione T785-ISAC era coerente con la dinamica di segnalazione prevista: la fosforilazione di ERK1/2 ha raggiunto il picco dopo 5 minuti, mentre il suo partner a valle RPS6 non ha raggiunto il picco di fosforilazione fino al punto temporale del 15-minuto (supplementare figura 7C). Questa cinetica supporta la dinamica prevista mentre la segnalazione si propaga nel tempo e suggerisce che esiste una risposta di segnalazione sostenuta e amplificata alla stimolazione ISAC degli APC. Data la risposta amplificata osservata in seguito alla stimolazione ISAC associata alle vie di segnalazione Fc R e TLR, abbiamo quindi utilizzato gli algoritmi DREMI (Conditional Density Resampled Estimate of Mutual Information) e DREVI (Conditional Density Rescaled Visualization) per quantificare la forza delle relazioni a coppie all'interno le vie di segnalazione Fc R e TLR 32. Questi algoritmi generano grafici DREVI per la visualizzazione, dove l'area sotto la curva (AUC) è un indicatore dell'intensità complessiva del segnale, il punto di flesso (IP) è una misura della soglia di attivazione e il Il punteggio DREMI quantifica la dipendenza a coppie delle due fosfoproteine ​​in questione. Questa analisi ha identificato un aumento dei punteggi DREMI indicativi di una maggiore dipendenza a coppie tra le proteine ​​associate alle vie di segnalazione Fc R e TLR dopo la stimolazione T785-ISAC rispetto ai controlli della miscela equimolare (Figura 2D). Una forte interdipendenza tra pERK1/2 e pIRF7 è stata osservata in modo univoco in seguito alla stimolazione con T785- ISAC, ma non miscela, come indicato da un punteggio DREMI aumentato, intensità del segnale amplificato e soglia di attivazione ridotta richiesta per la fosforilazione di IRF7 (Figura 2D ). Questa analisi ha anche indicato una soglia di attivazione ridotta necessaria per avviare la traduzione proteica (fosforilazione di RPS6) dopo la stimolazione ISAC, come quantificato dall'aumento dei punteggi DREMI e dalla riduzione degli IP per le combinazioni a coppie di pERK1/2-pRPS6 e pIRF7-pRPS6 . Inoltre, il livello di fosforilazione di RPS6 è stato amplificato come risultato della fosforilazione di ERK1/2 o IRF7 determinata dall'aumento delle AUC a coppie (Figura 2D). Questi risultati combinati non solo confermano la segnalazione dell'ISAC attraverso i percorsi Fc R e TLR previsti, ma supportano inoltre la sinergia tra i due percorsi con conseguente riduzione delle soglie di attivazione e intensità del segnale amplificata.

Figura 3: Gli ISAC richiedono la funzione effettrice Fc e l'agonista TLR per mediare l'attivazione mieloide. Le APC mieloidi umane appena isolate sono state coltivate per 18 ore in presenza di cellule tumorali CD20 più Toledo con un rapporto effettore-bersaglio di 3:1 e (a) 80 nM del rituximab-ISAC con o senza 1 μM di R406, (b) rituximab-ISAC sull'isotipo anticorpale indicato, (c) rituximab-ISAC o rituximab-ISAC deglicosilato (ISAC-deglicosilato). (ac) Le cellule sono state analizzate mediante citometria a flusso e i dati sono riportati come intensità di fluorescenza mediana. (d) Le cellule reporter HEK-Blue-TLR7 o TLR8 sono state coltivate per 18 ore in presenza di T785 o TLRnull prima della valutazione dell'attività SEAP indotta da NF-κB. I dati mostrati sonoda 1 esperimento e rappresentativo di almeno 3 esperimenti. (e) Le APC mieloidi umane appena isolate sono state coltivate per 18 ore in presenza di CD20 più cellule tumorali di Toledo e degli indicati rituximab-ISAC e analizzate mediante citometria a flusso (dati mostrati come medianaintensità di fluorescenza). (ae) I dati mostrati sono rappresentativi di 1-4 esperimenti aggiuntivi e maggiori o uguali a 3 donatori per ciascun esperimento (media e SEM). La significatività statistica è definita come *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

Gli ISAC richiedono la funzione effettrice Fc per mediare l'attivazione delle APC mieloidi Il contributo dell'attività Fc alla funzione ISAC è stato studiato in seguito all'ablazione della segnalazione di Fc R a valle con R406, un inibitore della chinasi di piccola molecola di Syk che impedisce la trasduzione del segnale a valle dell'attivazione di Fc Rs 33,34 . L'aggiunta di R406 ha abrogato l'attivazione mieloide mediata da T785- ISAC, come evidenziato dalla mancanza di sovraregolazione della molecola costimolatoria CD86, ma non ha alterato la risposta cellulare all'attivazione di TLR7/8 da parte di T785 (Figura 3A & Figura supplementare 8). L'inibizione di Syk con R406 ha anche annullato la segnalazione nei monociti dopo la stimolazione T785-ISAC, conlivelli significativamente ridotti di MAPKAPK{0}} fosforilato, ERK1/2 e IRF7 misurati (Figura supplementare 7D).Dati questi dati, rituximab T785-ISAC sono stati formulati con DAR comparabili su ciascuno dei quattro isotipi naturali per definire la misura in cui l'attività T785-ISAC varia con le affinità di legame Fc R note 35,36. Sono stati studiati anche gli ISAC del rituximab aglicosilato e fucosilato, poiché la glicosilazione annulla il legame Fc R mentre la fucosilazione aumenta l'affinità di legame per FCGR3A 37. La capacità immunostimolatoria del rituximab T785- ISAC era correlata all'affinità Fc R dell'isotipo dell'anticorpo (Figura 3B). Al contrario, gli ISAC fucosilati IgG1 (IgG1-AF), wildtype IgG1 e IgG3 T785-ISAC hanno suscitato l'attivazione mieloide, con l'ISAC IgG1-AF T785-più alto livelli di sovraregolazione CD86 (Figura 3B). La deglicosilazione del wildtype rituximab T785-ISAC con PNGase F, che riduce l'affinità di legame Fc-Fc R, ha comportato una diminuzione dell'attività immunostimolante ISAC in vitro, a sostegno dell'importanza di una regione Fc funzionalmente attiva (Figura 3C).

Gli ISAC richiedono l'agonismo del TLR per mediare l'attivazione mieloide Il contributo dell'attività del TLR sulla funzione ISAC è stato studiato in seguito all'ablazione dell'agonismo del TLR rimuovendo l'2-amino piridina dal T785 che si ritiene formi un ponte salino con residui critici di aspartato nel legame tasche di TLR7 e TLR8 38 (TLRnull, Figura 3D). Il composto TLRnull è stato coniugato a rituximab (TLRnull ISAC) e valutato per il potenziale di attivazione mieloide in presenza di cellule tumorali CD20 più in vitro. L'ISAC TLRnull non ha indotto la sovraregolazione della molecola costimolatoria CD86 né ha modulato l'espressione di CD14 o CD123, indicando che l'agonismo del TLR è necessario per il fenotipo di attivazione osservato con T785- ISAC (Figura 3E). Inoltre, l'ISAC TLRnull non ha indotto la fosforilazione di IRF-7 nei monociti, coerentemente con la sua incapacità di coinvolgere TLR7/8 (Figura 7E supplementare).Trastuzumab T785-ISAC somministrato per via sistemica elimina i tumori in assenza di Attività delle cellule B, T o NK nei modelli tumorali di xenotrapianto umano La capacità degli ISAC di indurre la distruzione mediata da mieloidi e neutrofili di tumori solidi in assenza di attività delle cellule B, T e NK è stata valutata utilizzando modelli di xenotrapianti umani 39,40. Trastuzumab, un anticorpo HER{20}}targeting clinicamente convalidato, è stato selezionato per l'indagine volta a determinare se trastuzumab T785-ISAC potesse superare la resistenza tumorale al trastuzumab nei modelli HER2 più tumori solidi (Figura 4 e Figura 9 supplementare ) 41,42. In primo luogo, la somministrazione sistemica di trastuzumab T785-ISAC è stata confrontata con la somministrazione intratumorale di una miscela di trastuzumab e T785. Il trastuzumab T785-ISAC ha provocato la regressione e la clearance del tumore, mentre la somministrazione di una miscela equimolare di componenti ha fornito un beneficio terapeutico minimo rispetto al solo trastuzumab (Figura 4A). Studi successivi che hanno confrontato gli ISAC mirati al tumore con i loro controlli isotipici appropriati hanno confermato che l'attività antitumorale richiedeva il targeting del tumore (Figura 4B e Figura 10 supplementare). È importante sottolineare che la somministrazione sistemica di trastuzumab T785- ISAC e il suo controllo isotipico sono stati ben tollerati, con un impatto minimo sul peso corporeo (Figura supplementare 11).Per determinare se il meccanismo d'azione che contribuisce all'efficacia dell'ISAC in vivo è simile a quello descritto in vitro, Fc-incompetent (trastuzumab N297A-ISAC) e trastuzumab TLRnull-ISAC sono stati testati nello stesso modello di xenotrapianto di tumore al seno inparallelamente a un trastuzumab di tipo selvatico T785-ISAC.Mentre l'ISAC trastuzumab T785- ha portato alla regressione e alla clearance del tumore, sia l'ISAC Fc-incompetent che quello TLRnull non sono riusciti a suscitare attività antitumorale (Figura 4C).Insieme, questi dati indicano un requisito per il targeting del tumore e il coinvolgimento di Fc R e TLR per l'attività antitumorale ISAC.

Il contributo differenziale dei neutrofili rispetto ad altre cellule mieloidi nella mediazione degli effetti antitumorali è stato valutato da deplezioni cellulari specifiche.I neutrofili sono stati esauriti utilizzando un anticorpo Ly6G, mentre l'esaurimento sia dei neutrofili che degli APC immaturi (monociti)è stato ottenuto con un anticorpo anti-Gr1.Le cellule fagocitiche sono state esaurite utilizzando liposomi caricati con clodronato.Abbiamo scoperto che le cellule fagocitiche, presumibilmente i macrofagi, hanno contribuito in modo significativo alla mediazione dell'attività antitumorale dopo il trattamento ISAC (Figura 4D).Tuttavia, l'esaurimento dei neutrofili con l'anti-Ly6G non ha avuto alcun impatto sull'efficacia dell'ISAC.L'esaurimento di Gr1 non ha avuto un impatto immediato sull'efficacia mediata dall'ISAC, ma ha ridotto la durata del controllo del tumore (Figura 4D).Per sondare la capacità degli ISAC T785-di controllare la crescita del tumore in modelli con livelli inferioriEspressione di HER2, abbiamo quindi modellato l'efficacia nel modello di tumore a espressione media di HER2-resistente al trastuzumab, JIMT-1.Si stima che la linea cellulare tumorale JIMT-1 abbia circa 6,5 ​​x105 copie di HER2 di superficie ed esprima un livello ridotto diHER2 rispetto alla linea cellulare tumorale HCC1954 mediante citometria a flusso 43.Mentre iltrastuzumab T785-ISAC ha rallentato significativamente la crescita del tumore rispetto all'isotipo ISAC o ai controlli trastuzumab, non è stata osservata alcuna regressione o clearance del tumore (Figura 4E).Abbiamo ipotizzato che pertuzumab, che lega un epitopo HER2 distinto dal sito di legame del trastuzumab, aumenterebbe il clustering di Fc e, di conseguenza, migliorerebbe l'ADCP e l'efficacia dell'ISAC nel modello JIMT-1.La combinazione di trastuzumab T785-ISAC con pertuzumab ha portato a un'efficacia significativamente migliorata e a una significativa regressione del tumore (Figura 4F).Senza la stimolazione immunitaria del trastuzumab T785-ISAC, la combinazione di pertuzumab con trastuzumab non ha prodotto alcun beneficio.

Successivamente abbiamo studiato gli eventi molecolari e cellulari innescati da trastuzumab T785-ISAC che alla fine si traducono in un'efficacia antitumorale.I primi cambiamenti dell'espressione genica nei tumorisono stati misurati con il pannello di profilazione immunitaria contro il cancro del topo NanoString, rivelando una significativa sovraregolazione del 13,7% dei geni entro 24 ore dal trattamento, inclusi i geni associati alla segnalazione e all'attivazione di TLR7 (IRF-7, geni associati a NF-kB)rispetto a 0-0,1 percento dopo trattamento ISAC con trastuzumab o isotipo T785- (Figura 4G) 44.L'analisi delle vie di espressione genica valutate da nSolver Advanced Analysis Pathway Score ha rivelato una significativa sovraregolazione delle principali firme geniche immuno-correlate (funzioni macrofagiche, funzioni DC, elaborazione e presentazione dell'antigene) che eranocoerente con i risultati in vitro e in vivo che le interazioni Fc-Fc R sono fondamentali per l'attività mediata da ISAC (Figura 4H e Figura 12 supplementare).I punteggi della firma genica associati a chemochine e citochine erano molto elevati dopo il trattamento ISAC con trastuzumab T785-, coerente con la quantificazione delle proteine ​​eseguita misurando la secrezione di citochine e chemochine all'interno del tumore 24 ore dopo la somministrazione (Figura 4He Figura supplementare 13).Questi risultati, in congruenza con i dati di efficacia in vitro e in vivo, indicano che una robusta risposta mediata da TLR e Fc R è indotta dall'ISAC.

La citometria a flusso e l'IHC sono state utilizzate per valutare se l'aumento dell'attivazione mediata da T785-ISAC e l'espressione di chemochine alla fine hanno portato al reclutamento di cellule effettrici immunitarie.Gli infiltrati immunitari mieloidi sono stati profilati mediante citometria a flusso 24 ore e 7 giorni dopo la somministrazione di una singola dose di trastuzumab T785-ISAC o trastuzumab e confrontati con i controlli non trattati.Rivelata l'analisi dei tumori 24 ore dopo il trattamentoinfiltrazione di CD11b più Ly6C più monociti e CD11b più Ly6G più granulociti nei tumori trattati con trastuzumab o trastuzumab T785- ISAC rispetto ai controlli non trattati (Figura 4I).Sette giorni dopo il trattamento, CD11b più CD11c più F4/80 più APC mieloidi positivi erano significativamente aumentati nel gruppo trattato con trastuzumab T785-ISAC rispetto atrastuzumab o controlli non trattati (Figura 4I) 45,46.Questo aumento delle APC mieloidi può essereattribuita al significativo aumento della produzione di chemochine mieloidi in seguito al trattamento ISAC con trastuzumab T785-.Sebbene non si sia verificato un aumento significativo della frequenza delle APC mieloidi all'{0}}ora, le cellule di questo fenotipo sono state attivate dopo il trattamento con trastuzumab T785-ISAC, misurato dalla sovraregolazione del CD40 sulla superficie cellulare , rispetto alla stessa popolazione di trastuzumab o controlli non trattati (Figura 4I).Questa scoperta, insieme ai dati di NanoString, dimostra ulteriormente la capacità del trastuzumab T{0}}ISAC di coinvolgere e attivare le cellule mieloidi nel microambiente tumorale.Data la positività CD11b delle APC mieloidi osservata una settimana dopo il trattamento, l'infiltrato precoce di monociti può essere precursore della popolazione di APC mieloidi che matura nei tumori trattati con ISAC ma non nei tumori trattati con trastuzumab.Tuttavia, resta da determinare in che modo gli eventi prossimali pro-infiammatori misurati 24 ore dopo la stimolazione ISAC da parte di NanoString e MSD abbiano infine influenzato eventi distali come la maturazione delle cellule mieloidi nel microambiente tumorale in trasformazione al momento del giorno 6- successivo e, in definitiva, ha influenzato la regressione e la clearance del tumore.
Infine, l'IHC è stata eseguita per valutare la presenza e la posizione di popolazioni di cellule immunitarie chiave nel tumore dopo il trattamento con trastuzumab T785-ISAC rispetto ai suoi controlli.Coerentemente con la citometria a flusso del giorno 7, le cellule che esprimono F4/80 inil tumore e la regione peritumorale erano elevati il ​​giorno 9 dopo un singolo trattamento con trastuzumab T785-ISAC (Figura 4J).Inoltre, il trattamento ISAC mirato ha comportato un drammatico aumento delle cellule CD11c plus nella regione peritumorale che non è stato osservato dopo il trattamento con anticorpi rHER2 o il trattamento con isotipo o isotipo-ISAC (Figura 4J).L'aumento delle cellule CD11c plus sia mediante citometria a flusso che IHC è stato evidenziato anche nei dati NanoString, in cui l'espressione dell'mRNA di ITGAX era significativamente elevata nei giorni 6 e 9 dopo la somministrazione di trastuzumab T785-ISAC (Figura supplementare 14).

Figura 5: I T785-ISAC suscitano forti effetti antitumorali nel modello di tumore singenico MMC. (ah) I topi FVB/N-TgN (MMTV-Erbb2) sono stati impiantati con la linea cellulare tumorale MMC. (a) I topi femmine sono stati randomizzati quando il volume del tumore ha raggiunto circa 500 mm3. I topi sono stati quindi trattati mediante iniezione intraperitoneale con 5 mg/kg q5d x 2 di anticorpo murino anti-HER2 anti-ratto, anticorpo murino HER2 T785-ISAC o isotipo T785-ISAC (TA99) (n =4-7 topi per braccio). (b, c) I topi maschi sono stati randomizzati quando il volume del tumore ha raggiunto circa 500 mm3 ed è stato pretrattato a partire da un giorno prima della data di trattamento iniziale con liposomi carichi di clodronato o di controllo per la deplezione dei fagociti (6 cicli, fino al giorno 15) o anti -CD8 depleting antibody (rIgG2b control) for CD8 T cell depletion (8 cycles, through Day 21). Animals were treated with 5 mg/kg rHER2 T785-ISAC q5d x 2 (n=6 mice per group) intraperitoneally. For phagocyte depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC treatment with clodronate or control liposomes, while for CD8 T cell depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC with T785-ISAC + CD8 Depletion or T785-ISAC + rat isotype IgG2b. (d) Anti-rHER2 T785-ISAC treated mice that experienced complete tumor regression for >60 giorni dopo il loro ultimo trattamento sono stati sfidati con la linea cellulare tumorale MMC. I topi naïve al tumore sono serviti come controlli dell'impianto (n=5 topi per gruppo). (ad) I dati sono rappresentativi di almeno 2 esperimenti. I topi sono stati sottoposti a eutanasia umana una volta che i tumoriraggiunto 2,{1}} mm3. I dati sono mostrati per quei gruppi in cui nessun tumore aveva raggiunto2,000 mm3. (ei) Coorti di topi sono state randomizzate quando i volumi tumorali dei tumori MMC hanno raggiunto circa 500 mm3 e trattati con 5 mg/kg di ISAC o anticorpi di controllo dosati al giorno 0 e al giorno 5. I tumori sono stati elaborati per la misurazione delle citochine mediante MSD , analisi di citometria a flusso, quantificazione dell'mRNA NanoString o fissata in formalina e inclusa in paraffina perimmunoistochimica nei tempi indicati. (e) I grafici del vulcano descrivono il cambiamento di log2 volte dell'espressione genica nei tumori trattati rispetto al controllo dell'isotipo misurati da NanoString a 24 ore (n=5 topi per gruppo). Le modifiche con un valore p aggiustato di < 0.05="" sono="" mostrate="" in="" rosso.="" (f)="" punteggi="" della="" firma="" genica="" quantificati="" da="" nsolver="" advanced="" analysis="" pathway="" score="" per="" i="" tumori="" analizzati="" 24="" ore="" dopo="" il="" trattamento="" (n="5" topi="" per="" gruppo).="" (g,="" h)="" analisi="" della="" citometria="" a="" flusso="" della="" composizione="" cellulare="" tumorale="" e="" dello="" stato="" di="" attivazione="" 24="" ore="" e="" 6="" giorni="" dopo="" l'inizio="" del="" trattamento="" (n="4" topi="" per="" gruppo).="" i="" dati="" sono="" rappresentativi="" di="" almeno="" 2="" esperimenti.="">Immagini rappresentative e quantificazione di F4/80, CD11c e CD8 IHC dei tumori raccolti 6 giorni dopo ogni trattamento indicato. Le barre della scala sono 50 μm. (ai) i dati sono riportati come media e SEM; *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

I T785-ISAC mirati al tumore provocano la regressione del tumore nel modello tumorale singenico MMC
Per valutare la capacità degli ISAC di mediare l'efficacia antitumorale in presenza di cellule B, T e NK, abbiamo utilizzato una linea cellulare singenica di carcinoma mammario del topo (MMC) che esprime HER2 (rHER2) di ratto che è stata derivata da una mammella spontanea carcinoma in topi FVB che esprimono rHER2-.Per ridurre al minimo l'immunogenicità tra specie associata all'espressione di rHER2 in MMC, topi transgenici che esprimono in modo endogeno Her2 di ratto sotto il controllodel promotore MMTV sono stati usati come host (Figura 15 supplementare) 47. Sfruttando la presenza di un sistema immunitario completamente intatto, abbiamo mirato a valutare la capacità dell'ISAC di combattere i tumori con un grande carico tumorale di 500 mm3, poiché i tumori più grandi sono generalmente più difficile da trattare nei modelli preclinici 48. La somministrazione sistemica di tutti i trattamenti, incluso rHER2 T785-ISAC, è stata ben tollerata, con un impatto minimo sul peso corporeo (Figura supplementare 16A). Solo l'ISAC rHER2 T785-, tuttavia, è stato in grado di curare topi portatori di tumori grandi e consolidati (Figura 5A). Come si è visto nel modello di xenotrapianto, gli studi sull'esaurimento cellulare hanno mostrato che una significativa attività antitumorale è stata persa quando le cellule fagocitiche sono state esaurite con liposomi carichi di clodronato (Figura 5B). Sebbene non si preveda che l'ISAC agisca direttamente sui linfociti T, i topi pretrattati con un anticorpo che esaurisce la CD8- hanno perso la capacità di eliminare i tumori dopo due somministrazioni di rHER2 T785-ISAC (Figura 5C). Ciò suggerisce che gli ISAC mirati al tumore possono agire indirettamente attraverso i linfociti T, in seguito alla presentazione di antigeni associati al tumore. Coerentemente con la presenza di memoria immunologica, topiguariti dai tumori MMC dopo il trattamento rHER2 T785-ISAC erano protetti contro il rechallenge del tumore (Figura 5D).

Per sondare ulteriormente il meccanismo alla base dell'efficacia dell'ISAC nel modello singenico, abbiamo quindi studiato i cambiamenti cellulari, trascrizionali e delle citochine nel microambiente tumorale dopo il dosaggio dell'ISAC. Due coorti di topi portatori di grandi tumori MMC sono state trattate con rHER2 T785-ISAC o controlli. I tumori della prima coorte sono stati raccolti 24 ore dopo la somministrazione (giorno 1) quando tutti i tumori erano di dimensioni simili (Figura supplementare 16B). All'altra coorte è stata somministrata una seconda dose 5 giorni dopo la prima, quindi raccolta 24 ore dopo (giorno 6), a quel punto i tumori in tutti i gruppi di trattamento erano cresciuti in modo misurabile tranne quelli trattati con T785-ISAC (Figura supplementare 16B ). I tumori sono stati analizzati mediante IHC, espressione di mRNA e secrezione di citochine nei lisati proteici. A ulteriore supporto delle nostre osservazioni nei modelli di xenotrapianto secondo cui il targeting del tumore è necessario per l'attività ISAC, l'analisi dell'mRNA dei tumori 24 ore dopo il trattamento con rHER2 T785-ISAC ha mostrato una drammatica sovraregolazione del 34,1% dei geni nel sistema immunitario del cancro del topo NanoString pannello di profilazione rispetto ai tumori trattati con isotipo. L'anticorpo anti-rHER2 da solo ha avuto solo un leggero impatto sull'espressione genica (3,5 percento dei geni analizzati) mentre l'isotipo T785- ISAC non mirato non ha influenzato l'espressione genica (Figura 5E). Come visto nel modello di xenotrapianto HCC1954, i geni associati alla segnalazione e all'attivazione mediata da TLR7- sono stati significativamente sovraregolati dall'ISAC rHER2 T785- mirato al tumore, indicativo di una robusta risposta mediata da TLR (Figura 5E). L'analisi del percorso di espressione genica ha nuovamente rivelato una significativa sovraregolazione delle principali firme geniche immuno-correlate, comprese le firme per l'analisi della via di espressione genica, ha rivelato una significativa sovraregolazione delle principali firme geniche immuno-correlate dopo il trattamento con rHER2 T785-ISAC, comprese quelle associate alle chemochine e citochine (Figura 5F). La quantificazione delle proteine ​​è stata eseguita sugli stessi tumori analizzati da NanoString e, coerentemente con i risultati della firma genica, sono stati misurati livelli significativamente aumentati di citochine e chemochine pro-infiammatorie a 24 ore dopo il trattamento con rHER2 T785-ISAC (Figura supplementare 17 ). I punteggi della firma genica erano inoltre significativamente elevati per l'elaborazione e la presentazione dell'antigene, la funzione delle cellule dendritiche e la funzione dei macrofagi, supportando ulteriormente la risposta mediata da anFc-Fc R e guidata dalla fagocitosi 24 ore dopo rHER2 T785-ISACtrattamento (Figura 5F e Figura 18 supplementare). Oltre a punteggi di firma genica significativamente elevati associati a una robusta risposta mediata da TLR e Fc R, anche il punteggio di firma genica per le funzioni delle cellule T è stato significativamente aumentato entro 24 ore dal trattamento con rHER2 T785-ISAC, supportando ulteriormente il scoprendo che le cellule T sono necessarie per l'efficacia mediata dall'ISAC (Figura 5F e Figura 18 supplementare).

Per caratterizzare le cellule immunitarie che possono contribuire all'aumento precoce della produzione di citochine proinfiammatorie e chemochine, i tumori sono stati analizzati mediante citometria a flusso 24 ore dopo la prima dose di rHER2 T785-ISAC o dei controlli e 6 giorni dopo l'inizio della trattamento, 24 ore dopo una seconda dose. L'analisi dei tumori al giorno 1 ha rivelato l'infiltrazione di CD11b più Ly6C più monociti nei tumori trattati con rHER2 T785-ISAC e CD11b più Ly6G più granulociti nei tumori trattati con rHER2 mAb o rHER2 T785-ISAC , ma non l'isotipo ISAC o i controlli dell'anticorpo dell'isotipo (Figura 5G). I livelli di monociti sono stati ulteriormente aumentati nei tumori trattati con rHER2 T785-ISAC dopo 6 giorni. Simile a quanto osservato nel modello di xenotrapianto HCC1954, le APC mieloidi (CD11b più CD11c più F4/80 più) erano significativamente elevate il giorno 6 dopo il trattamento con rHER2 T785- ISAC rispetto ai controlli (Figura 5G e Figura 19 supplementare). ). Inoltre, è stato riscontrato che le APC mieloidi sono attivate specificamente nel gruppo trattato con rHER2 T{30}} ISAC in entrambi i punti temporali, come misurato dalla sovraregolazione di CD40 sulla superficie cellulare (Figura 5H). È importante sottolineare che un aumento delle APC mieloidi tumorali non è stato misurato in seguito all'esaurimento dei fagociti utilizzando liposomi carichi di clodronato (Figura 20 supplementare). Infine, è stata eseguita l'IHC per valutare la presenza e la posizione delle popolazioni di cellule immunitarie chiave nel modello MMC dopo il trattamento con rHER2 T785-ISAC. Come è stato osservato nel modello di xenotrapianto HCC1954, il trattamento con rHER2 T785-ISAC ha determinato un drammatico aumento delle cellule CD11c plus e F4/80 plus nella regione peritumorale che non è stato osservato dopo il trattamento con anticorpi rHER2 o il trattamento con isotipo o isotipo T785-ISAC (Figura 5I). Coerentemente con l'espressione precoce delle chemochine delle cellule T e l'aumento del punteggio della firma genica per la funzione delle cellule T, l'infiltrazione significativa di cellule CD8 plus è stata osservata da IHC all'interno dei tumori di topi trattati con rHER2 T785-ISAC il giorno 6, mentre La colorazione CD8 nei topi trattati con anticorpi anti-rHER2 o controlli isotipici è rimasta bassa (Figura 5I). L'aumento della colorazione CD8 più IHC, insieme all'espressione genica amplificata dei geni associati alla funzione delle cellule T e alla clearance del tumore CD8-dipendente, supportano il potenziale dell'ISAC T785- di trasformare un tumore freddo in caldo.CL{ {58}}Gli ISAC provocano la regressione del tumore nel modello di tumore xenotrapianto ad espressione HER2-media Per dimostrare che gli ISAC sono una solida piattaforma su più carichi utili immunostimolanti, abbiamo sviluppato un ISAC utilizzando un noto agonista TLR7, CL264 con un DAR paragonabile al trastuzumab T785-ISAC (Figura 6A e Figura 21 supplementare). La capacità degli ISAC di trastuzumab prodotti con CL264 o T785 di mediare l'attivazione mieloide intratumorale è stata valutata nel modello di xenotrapianto HCC1954 24 ore dopo una singola somministrazione di trastuzumab, trastuzumab CL264-ISAC o trastuzumab T785-ISAC . È stata osservata una maggiore attivazione mieloide con trastuzumab CL264-ISAC, come evidenziato dall'aumentata espressione di CD40 su CD11b infiltrante il tumore più CD11c più F4/80 più APC mieloidi rispetto a trastuzumab o trastuzumab T785-ISAC (Figura 6B ).Per determinare se la maggiore capacità di attivazione mieloide del CL264-ISAC si è tradotta in una maggiore attività antitumorale in vivo, il trastuzumab CL264-ISAC è stato confrontato con ilT785-ISAC nei modelli tumorali HER2High HCC1954 e HER2Med JIMT-1. Mentre entrambigli ISAC trastuzumab hanno mediato la regressione completa del tumore nel modello HCC1954 HER2High, il CL264-ISAC ha dimostrato una maggiore attività antitumorale nel modello JIMT-1 HER2Med, suggerendo che la potenza ISAC e la capacità di colpire i tumori a densità antigenica inferiore possono essere collegati (Figura 6C–D).

Entrambi gli ISAC erano ben tollerati, ma abbiamo osservato una perdita transitoria di peso corporeo del 5-10 percento negli animali trattati con trastuzumab CL264-ISAC o rituximab CL264-ISAC, con il recupero del peso corporeo a o al di sopra del valore basale della terza dose (Figura supplementare 16A). La secrezione sistemica di citochine è stata misurata dopo il trattamento con T785-ISAC o CL264-ISAC. Bassi livelli di TNF sono stati misurati nel siero degli animali quattro ore dopo la somministrazione dell'ISAC T785-, mentre sia l'ISAC mirato che quello isotipo CL264- hanno suscitato livelli più elevati di secrezione di TNF a livello sistemico (Figura supplementare 11) . È improbabile che questi effetti tra gli ISAC T785 e CL264 fossero dovuti a un impatto diretto dell'ISAC sulla crescita delle cellule tumorali, poiché l'ISAC non ha inibito la proliferazione delle cellule tumorali in vitro (Figura 9 supplementare).

CL264-Gli ISAC stimolano la clearance del tumore e la memoria immunologica nei modelli tumorali singenici Data la maggiore potenza ed efficacia osservata con il CL264-ISAC nei modelli di xenotrapianto tumorale umano con varia densità dell'antigene HER2, abbiamo quindi caratterizzato l'attività del CL 264-ISAC nei modelli di tumori singenici. Simile all'ISAC T785- nel modello MMC, l'ISAC CL264- ha portato alla regressione e alla clearance del tumore in modo dipendente dalle cellule T, portando a una memoria immunologica duratura (Figura supplementare 22A). Per valutare l'efficacia dell'ISAC in un modello tumorale singenico con ridotta espressione dell'antigene, abbiamo sviluppato una linea cellulare CT26 che esprime stabilmente HER2 di ratto (CT26-rHER2). È importante sottolineare che circa l'8,5 percento delle cellule CT26 non esprimono rHER2 dopo l'impianto del tumore (Figura 6E). I topi Wildtype Balb/c trattati con rHER2 CL264-ISAC hanno mostrato una sostanziale immunità antitumorale in quanto il 75% (6 su 8) dei topi ha eliminato i propri tumori ed è rimasto libero da tumore per tutta la durata dell'esperimento, mentre nessuno dei topi trattati con l'anticorpo anti-rHER2 ha avuto una regressione completa (Figura 6F). È stata osservata una perdita di peso transitoria di circa il 10% del peso corporeo dopo il trattamento con rHER2 CL264-ISAC, con un recupero del peso corporeo entro otto giorni dall'inizio dello studio (Figura supplementare 22B). Abbiamo valutato se la memoria immunologica mediata da rHER2 CL264-ISAC contro un tumore privo di espressione dell'antigene mirato, rHER2, sfidando topi precedentemente curati da tumori CT26-rHER2 con la linea cellulare parentale CT26 priva di rHER2 espressione. I topi precedentemente curati dai tumori CT26-rHER2 con rHER2 ISAC erano completamente protetti dalla sfida con la linea cellulare parentale CT26 (Figura 6I). L'esaurimento delle cellule T CD4 e CD8 prima del rechallenge del tumore ha mostrato che le cellule T sono necessarie per la protezione. Infine, abbiamo testato se la memoria immunologica sviluppata nei topi precedentemente curati con l'ISAC fosse specifica per gli antigeni associati al tumore del tumore primario trattato. Durante il rechallenge del tumore CT26 parentale, i topi sono stati contemporaneamente sfidati con un tumore diverso, 4T1, impiantato nel fianco controlaterale. I dati mostrano che lo sviluppo della memoria immunologica è statospecifico per gli antigeni associati al tumore CT26 distinti da rHER2, poiché la crescita del tumore dei tumori 4T1 non è stata influenzata (Figura 6G).