Valutazione in vitro delle interazioni farmaco-farmaco mediate da P‑gp utilizzando il modello di cellule renali umane RPTEC/TERT1
Mar 01, 2022
introduzione La valutazione in vitro del potenziale inibitorio della glicoproteina P (P-gp) è una questione importante durante il processo di sviluppo del farmaco, in quanto consente di prevedere le interazioni farmaco-farmaco (DDI) clinicamente rilevanti [1–3]. La P-gp appartiene alla superfamiglia dei trasportatori ATP-binding cassette (ABC) ed è codificata dal gene della resistenza multifarmaco MDR1 (noto anche come ABCB1). Questo trasportatore di membrana è noto per essere sovraespresso nelle cellule tumorali e per causare resistenza a molti farmaci antitumorali [4]. Situato all'interno di tutte le barriere fisiologiche, inclusi intestino, fegato ereni, la P-gp protegge dagli xenobiotici limitando l'assorbimento di questi substrati dal tubo digerente e facilitando il loro efflusso nella bile e nelle urine. Pertanto, la P-gp gioca un ruolo notevole nella farmacocinetica di varie classi terapeutiche [5-7]. Una pletora di farmaci come agenti antitumorali, antimicotici e cardiovascolari sono noti per essere substrati e/o inibitori della P-gp e molti di essi sono coinvolti in interazioni clinicamente rilevanti [8-10]. Pertanto, la Food and Drug Administration (FDA) statunitense impone che il potenziale inibitorio della P-gp debba essere valutato durante le prime fasi dello sviluppo del farmaco. I test in vitro effettuati a questo scopo sono comunemente basati su studi sul trasporto di farmaci che utilizzano linee cellulari che esprimono la P-gp. Più precisamente, le linee guida della FDA raccomandano la determinazione dei valori di concentrazione inibitoria semimassima in vitro (IC50) per valutare il rischio di DDI clinici derivanti dall'inibizione della P-gp. A tal fine, sono stati condotti molti saggi sperimentali e la maggior parte di essi si è concentrata sulle interazioni farmacologiche relative all'assorbimento intestinale utilizzando i modelli Caco-2 o MDCK-MDR1 [11–13]
CISTANCHE MIGLIORA LA MALATTIA RENALE/RENALE
Darenalel'eliminazione è anche una via di eliminazione comune per varie classi di farmaci, anche la secrezione tubulare attiva tramite trasportatori ABC può svolgere un ruolo chiave in queste interazioni [14]. Tuttavia, i dati in vitro surenaleI DDI mediati da P-gp sono limitati. Ciò è in parte dovuto alla mancanza di sviluppo e caratterizzazione di modelli in vitro per la previsione direnaletrasporto di droga. Tra le varie linee cellulari umane, il modello RPTEC/TERT1 sembra essere promettente per la valutazione direnaleinterazioni farmacologiche. Questa linea cellulare è derivata da un donatore umano sano ed è stata generata da cellule del tubulo prossimale immortalate. Inoltre, l'espressione e la funzionalità della P-gp sono state dimostrate utilizzando questo modello, confermando così la sua capacità di predirerenaleeffluenti di droga [15, 16]. In questo contesto, il presente studio è stato progettato per studiare il potenziale inibitorio della P-gp utilizzando il modello RPTEC/TERT1. In primo luogo, è stato eseguito un test di screening dell'accumulo di rodamina 123 (R123) per ottenere un profilo di inibizione per ciascun farmaco testato. Sulla base di questo screening, sono stati quindi selezionati quattro farmaci per la valutazione dei loro effetti dipendenti dalla concentrazione sull'accumulo intracellulare di due farmaci substrato della P-gp: apixaban e rivaroxaban
Parole chiave:cellula renale, modello renale, farmaco renale, eliminazione renale, reni.
Materiali e metodi
ReagentiApixaban, [2H71 3C ] - api xa ban , ri va r oxa ban ,[13C6]-rivaroxaban, nilotinib, crizotinib, erlotinib, axitinib, idelalisib, warfarin e dabigatran etexilate sono stati acquistati da Alsachim (Illkirch, Francia). Verapamil, ketoconazolo, simvastatina, amiodarone, rodamina 123, soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) e soluzione HEPES sono stati acquistati da Sigma–Aldrich (Saint-Quentin-Fallavier, Francia).
Coltura cellulare Le cellule RPTEC/TERT1 sono state ottenute dall'American Type Culture Collection (ATCC, Molsheim, Francia) e coltivate in un terreno privo di siero definito da ormoni, costituito da Modifed Eagle's Medium F12 (ATCC) di Dulbecco integrato con un kit di fattori di crescita (ATCC) e un 1% di miscela di antibiotici/antimicotici (penicillina-streptomicina, amfotericina B) a 37 gradi e 5% di CO 2. Per tutti gli esperimenti, le cellule sono state seminate in 96-piastre a pozzetti a una densità di 50,000 cellule per pozzetto e sono state utilizzate per crescere dopo 14 giorni di coltura. Il mezzo è stato rinnovato ogni 2 giorni e le cellule sono state utilizzate dal passaggio 27 al passaggio 34. Anche le cellule Caco-2 sono state acquistate dall'ATCC. Le cellule sono state mantenute in un mezzo di coltura costituito da Eagle's Minimal Essential Medium (Sigma–Aldrich, Missouri, USA) integrato con il 10% di FBS, l'1% di aminoacidi non essenziali e una miscela di antibiotici/antimicotici all'1% (penicillina-streptomicina, amfotericina B ) a 37 gradi e 5 percento di CO2. Le cellule di cacao-2 sono state seminate in 96-piastre a pozzetti a una densità di 5 × 10 3 cellule per pozzetto e sono state utilizzate per crescere dopo 14 giorni di coltura. Le cellule epiteliali tubulari prossimali umane (HPTEC) sono state ottenute da BIOPREDIC (Rennes, Francia) e coltivate in DMEM/F12 integrate con idrocortisone, EGF, insulina, transferrina e selenite di sodio. Le cellule sono state seminate in 96-piastre di coltura ben rivestite di collagene a una densità di 6600 cellule per pozzetto e sono state utilizzate per crescere dopo 11 giorni di coltura.
Saggio di screening dell'accumulo di rodamina 123 Il potenziale inibitorio della P-gp è stato determinato misurando l'accumulo intracellulare di rodamina 123 nelle cellule RPTEC/TERT1 in presenza e assenza di varie classi di farmaci. Tra i 14 farmaci testati, come inibitori della P-gp sono stati usati ciclosporina A (10 µM), ketoconazolo (50 µM), verapamil (100 µM) e amiodarone (50 µM). Apixaban, rivaroxaban e dabigatran etexilato, tre anticoagulanti orali diretti (DOAC), sono stati usati come substrati della P-gp (10 µM). Il warfarin (50 µM) è stato utilizzato come non inibitore e cinque farmaci antitumorali tra cui nilotinib, crizotinib, erlotinib e idelalisib sono stati usati senza conoscere i loro profili di inibizione a una concentrazione di 10 µM. Diverse condizioni sono state riprodotte con le cellule Caco-2, approvate dalla FDA per gli studi sul trasporto di farmaci. In questo modo è stata determinata la ritenzione intracellulare di rodamina 123 nelle cellule Caco-2 in presenza e assenza di verapamil (100 µM), ciclosporina A (10 µM), nilotinib (10 µM) e DOAC (10 µM ). In breve, dopo 14 giorni di coltura in 96-piastre a pozzetti, le cellule sono state pre-incubate per 10 minuti a 37 gradi con ciascun farmaco sciolto in HBSS con HEPES 10 mM (v/v). Quindi le cellule sono state incubate con 10 µM di rodamina 123 per 45 minuti a 37 gradi. Infine, dopo tre lavaggi in una soluzione fredda di HBSS/HEPES, le cellule sono state lisate a temperatura ambiente per 45 minuti in una soluzione di sodio dodecil solfato (SDS) contenente l'1% di borato di sodio. La quantità di rodamina intracellulare 123 è stata quantificata utilizzando un nanospettrofuorometro Infnite M (Life Sciences, TECAN, Svizzera), impostando le lunghezze d'onda a 485/535 nm. I dati sono stati espressi come percentuali dell'accumulo di rodamina 123 nelle cellule di controllo non esposte a potenziali inibitori della P-gp e fissate arbitrariamente al 100 percento di accumulo.
Dosaggio di accumulo intracellulare DOAC e determinazione IC50 Dal precedente test di screening della rodamina 123, quattro farmaci sono stati scelti per studiare i loro effetti dipendenti dalla concentrazione sull'accumulo intracellulare di apixaban e rivaroxaban (10 µM) nelle cellule RPTEC/TERT1. Ketoconazolo, crizotinib e nilotinib sono stati selezionati come inibitori della P-gp e il warfarin è stato scelto come non inibitore. La ciclosporina A (10 µM) è stata utilizzata come inibitore ad ampio spettro dei trasportatori. Gli studi sulle interazioni tra DOAC e nilotinib per determinare i valori di IC50 sono stati riprodotti in cellule Caco-2 per confrontare i due modelli cellulari. Tutti i composti sono stati diluiti da soli o con l'inibitore associato nel tampone di trasporto HBSS integrato con 1% HEPES (v/v) e 1% DMSO (v/v). Prima dell'incubazione, tutte le soluzioni sono state preriscaldate a 37 gradi e il pH è stato regolato a 7,4. Per i farmaci antitumorali crizotinib e nilotinib, a causa della loro scarsa solubilità e potenziale citotossico, le concentrazioni variavano da 0,1 a 25 µM. Per ketoconazolo e warfarin, le concentrazioni variavano da 0,1 a 100 µM. In breve, dopo 14 giorni di coltura, tutti i farmaci disciolti in HBSS con l'1% di HEPES (v/v) sono stati pre-incubati per 10 minuti a 37 gradi. Quindi, le cellule sono state incubate con 10 µM di apixaban o rivaroxaban per 60 minuti a 37 gradi. Infine, dopo tre lavaggi in una soluzione fredda di HBSS/HEPES, le cellule sono state lisate a temperatura ambiente per 45 minuti in una soluzione allo 0,2% di Triton X-100. La quantità di DOAC intracellulare è stata quindi quantificata mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS). I dati sono stati espressi come aumento percentuale dell'accumulo di DOAC e l'accumulo intracellulare di DOAC è stato arbitrariamente impostato al 100 percento nelle cellule di controllo. I valori IC50 per l'inibizione dell'attività P-gp, che corrispondono a valori di concentrazione semimassima efficace (EC50) per l'aumento dell'accumulo di DOAC, sono stati determinati da modelli di regressione dei minimi quadrati non lineari non ponderati dell'aumento dell'accumulo con la funzione 'nls()' in R software, secondo la seguente equazione (Eq. 1):
Cromatografia liquida – Analisi spettrometria di massaLa quantificazione di apixaban (m/z 460.19793) e rivaroxaban (m/z 436.07285) è stata eseguita utilizzando un Ultimate U300{{18 }} sistema di cromatografia liquida (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) accoppiato con uno spettrometro di massa Q-Exactive Plus (ThermoFisher, Brema, Germania). Le separazioni LC sono state ottenute utilizzando una colonna analitica Hypersil Gold C18 (3 µm, 50 × 2,1 mm) (ThermoFisher Scientifc, Waltham, MA, USA) e una velocità di flusso di 0,6 ml/min . La fase mobile A era acqua con 0,1 percento di acido formico (FA) e la fase mobile B era acetonitrile con 0,1 percento di FA. Per rivaroxaban, il gradiente era: 0–0,3 min, 10 percento B; 0,3–1 min, lineare dal 10 percento al 70 percento B; 1–1,5 min, 70 percento B; 1,51 min, ritorno alle condizioni di partenza fino a 3 min. Per apixaban, il gradiente era: 0–0,3 min, 10 percento B; 0,3–0,7 min, lineare dal 10 al 90 percento B; 0,7–1,5, 90 percento B; 1,51 min, ritorno alle condizioni di partenza fino a 3 min. Il rilevamento è stato eseguito in modalità di monitoraggio della reazione parallela (PRM) positiva per elettrospray con una risoluzione di 35,{53}} (a m/z 200). Gli standard interni (IS) erano [13C,2H7]-apixaban (m/z 468,2452) per apixaban e [13C6]-rivaroxaban (m/z 442,09297) per rivaroxaban. Per ciascun farmaco e il rispettivo IS, sono stati monitorati uno ione target (per la quantificazione) e uno ione di conferma. Per rivaroxaban e il suo IS, lo ione target era m/z 144,95125 e gli ioni di conferma erano rispettivamente m/z 231,11280 e m/z 237,13298. Per apixaban e il suo IS, lo ione target era m/z 199,08656 e gli ioni di conferma erano rispettivamente m/z 282,12387 e m/z 241,06062.
Risultati
Saggio di screening dell'accumulo di rodamina 123Il test di screening dell'accumulo di rodamina 123 è stato eseguito in cellule RPTEC/TERT1 con 14 farmaci con diversi profili di inibizione (Fig. 1). Come previsto, l'accumulo intracellulare di rodamina 123 in presenza di ciclosporina A, un inibitore ad ampio spettro, è stato tra i più elevati, con un aumento dell'accumulo del 75% rispetto alle cellule di controllo. La presenza di verapamil, uno specifico inibitore della P-gp, ha portato ad un aumento dell'accumulo di rodamina 123 del 57%, dimostrando il coinvolgimento della P-gp. Allo stesso modo, il ketoconazolo, descritto come un potente inibitore della P-gp, ha portato ad un aumento maggiore (66%) dell'accumulo intracellulare di rodamina 123 rispetto al verapamil, confermando il suo profilo di inibizione. Al contrario, l'aggiunta di amiodarone, caratterizzato come un moderato inibitore della P-gp, ha causato un aumento dell'accumulo del 59 percento, che è simile a quello causato dal verapamil. Sono stati osservati diversi profili di inibizione per gli agenti antitumorali nilotinib, axitinib, crizotinib, erlotinib e idelalisib. L'aggiunta di nilotinib ha causato un forte aumento dell'accumulo di rodamina 123 (71%), suggerendo un potenziale inibitorio significativo, seguito da axitinib, che ha causato un aumento della ritenzione del 57%. D'altra parte, crizotinib ed erlotinib hanno dimostrato potenziali inibitori da moderati a bassi, con aumenti dell'accumulo di rodamina 123 rispettivamente del 23% e del 16%. Idelalisib non ha alterato l'accumulo di rodamina 123; lo stesso valeva per il warfarin, che era
scelto come non inibitore. Tra i tre DOAC, apixaban e rivaroxaban hanno causato lievi aumenti nella ritenzione di rodamina 123: rispettivamente del 33% e del 12%. È interessante notare che dabigatran etexilato, un profarmaco di dabigatran e un noto substrato della P-gp, ha causato un aumento della ritenzione di rodamina 123 di circa il 50 percento, sebbene non sia descritto come un potenziale inibitore della P-gp. Infine, l'aggiunta di simvastatina ha causato solo un leggero aumento dell'accumulo del substrato fluorescente (32 percento). Sulla base di questo screening, sono stati selezionati quattro farmaci per valutare i loro effetti dipendenti dalla concentrazione sull'accumulo intracellulare di apixaban e rivaroxaban all'interno del modello RPTEC/TERT1. Il ketoconazolo è stato scelto come condizione di controllo positiva per l'inibizione della P-gp e il warfarin è stato selezionato come non inibitore della P-gp per la condizione di controllo negativo. Nilotinib e crizotinib sono stati selezionati rispettivamente come inibitori della P-gp forti e moderati. Diverse condizioni sono state riprodotte con il modello di riferimento, Caco-2. L'accumulo intracellulare di R123 nelle cellule è stato determinato dopo combinazione (o meno) con apixaban e rivaroxaban (10 µM), nilotinib (10 µM) e con ciclosporina A (10 µM) e verapamil (100 µM) per le condizioni di controllo per l'inibizione (Fig. 2A). Come previsto, verapamil e ciclosporina A hanno causato aumenti elevati nella ritenzione di R123 rispettivamente del 297% e del 275%. Allo stesso modo, nilotinib ha causato un forte aumento dell'accumulo intracellulare di R123 (229 percento), confermando il suo potenziale inibitorio. La combinazione di R123 con DOAC ha comportato un aumento minore dell'accumulo di R123 (40-44%) rispetto agli altri farmaci. Inoltre, l'accumulo intracellulare di rodamina 123 in assenza e presenza di ciclosporina A inrenalein questo studio sono state anche studiate cellule umane primarie per verificare l'affidabilità dei risultati ottenuti con cellule RPTEC/TERT1 (Fig. 2B). Queste analisi hanno mostrato che la presenza di ciclosporina A ha aumentato la ritenzione di R123 del 71%. Questo valore era vicino a quello ottenuto nelle stesse condizioni con le cellule RPTEC/TERT1 (un aumento del 75% con la ciclosporina A). Pertanto, l'attività della glicoproteina P era simile nel modello RPTEC/TERT1 e nelle cellule umane primarie.
Dosaggio di accumulo intracellulare DOAC: determinazione del rapporto IC50 e I1/IC50 Sono stati condotti studi sull'accumulo intracellulare per valutare il trasporto mediato dalla P-gp di apixaban e rivaroxaban a una concentrazione costante di 10 µM nelle cellule RPTEC/TERT1 in vitro e in presenza di concentrazioni crescenti di nilotinib, crizotinib, ketoconazolo , e warfarin (Figg. 2, 3). La modellizzazione dell'aumento della ritenzione di apixaban e rivaroxaban è stata valutata per determinare i valori di IC50. La combinazione di DOAC con nilotinib ha portato ai valori IC50 più bassi: 0,85 µM e 1,37 µM rispettivamente per rivaroxaban e apixaban (Figg. 4, 5). La combinazione con crizotinib ha prodotto valori IC50 di 10,1 µM e 12,2 µM rispettivamente per rivaroxaban e apixaban. Sorprendentemente, la combinazione di DOAC con chetoconazolo non ha prodotto i valori IC50 più bassi (rispettivamente 16,5 µM e 16,9 µM per rivaroxaban e apixaban). Infine, come previsto, combinazione con warfarin, che era
scelto come non inibitore, non ha alterato le ritenzioni intracellulari dei due DOAC. L'accumulo intracellulare di apixaban e rivaroxaban all'interno delle cellule Caco-2 in presenza di concentrazioni crescenti di nilotinib è stato quindi studiato per il confronto con i modelli cellulari. È interessante notare che, come osservato con il modello RPTEC/TERT1, il valore IC50 per rivaroxaban (4,16 µM) era inferiore a quello ottenuto per apixaban (9,35 µM). È anche interessante notare che i valori di IC50 osservati nelle cellule Caco-2 erano superiori a quelli ottenuti nelle cellule RPTEC/TERT1 per lo stesso inibitore. La rilevanza clinica delle DDI può essere prevista dai dati in vitro. Secondo le linee guida della FDA, i rapporti [I1]/IC50 sono stati calcolati per ciascuna combinazione di farmaci. Questo rapporto consente di confrontare le concentrazioni in vivo con quelle note per produrre un effetto rilevante in vitro. Per apixaban nelle cellule RPTEC/TERT1, i rapporti erano rispettivamente di 3,1, 0,06 e 17,4 con nilotinib, crizotinib e ketoconazolo (Tabella 1). Nelle cellule Caco-2, il rapporto [I1]/IC50 era 0,46 per l'interazione tra apixaban e nilotinib (Tabella 1). Per rivaroxaban, i rapporti erano leggermente superiori a quelli ottenuti per apixaban nelle cellule RPTEC/TERT1: 5,1, 0,08 e 17,7, rispettivamente, per nilotinib, crizotinib e ketoconazolo (Tabella 2). Allo stesso modo, il rapporto [I1]/IC50 osservato per l'interazione tra rivaroxaban e nilotinib nelle cellule Caco-2 era 1,03, che era superiore a quello ottenuto per apixaban (Tabella 2).
Discussione
Numerosi studi condotti negli ultimi decenni hanno riportato un ruolo notevole della P-gp nella farmacocinetica dei farmaci [17-19]. In considerazione del crescente interesse normativo per le interazioni farmacologiche mediate dalla P-gp, i saggi in vitro per studiare il potenziale inibitorio dei farmaci sono un aspetto importante dello sviluppo dei farmaci e della pratica clinica. A tal fine, sono stati condotti molti saggi in vitro e la maggior parte dei dati associati sull'assorbimento intestinale previsto sono stati generati dalle linee cellulari Caco-2 e MDCK-MDR1 [20–22]. Tuttavia, sono disponibili pochi dati sulla secrezione tubulare attiva dei farmaci, che svolge anche un ruolo chiave nella disposizione dei farmaci e dipende dalla presenza dei trasportatori ABC. Questa osservazione è chiaramente legata alla mancanza di caratterizzazionerenalelinee cellulari per la predizione del farmacorenaleefflusso. Questo obiettivo richiede un in vitrorenalemodello che imita da vicino la barriera fisiologica. La linea cellulare umana RPTEC/TERT1, che esprime diversi trasportatori ABC (in particolare P-gp), sembra essere una buona alternativa, come dimostrato in uno studio precedente [16]. In questo contesto, il presente lavoro ha studiato l'applicazione del modello RPTEC/TERT1 per valutare il potenziale inibitorio della P-gp. Per quanto ne sappiamo, questo lavoro è il primo a fornire dati da studi sull'inibizione della P-gp sull'uomorenalecellule.
I saggi in vitro per determinare il potenziale inibitorio della P-gp sono comunemente basati sull'uso di uno specifico substrato di riferimento della P-gp, come la digossina o la rodamina 123 [23–25]. Grazie alla loro facilità d'uso, le sonde fluorescenti sono vantaggiose per i test ad alta produttività. Inoltre, la rodamina 123 è stata ampiamente applicata al rilevamento dell'attività della P-gp in un'ampia gamma di studi [26-28]. In questo modo, in questo studio sono stati eseguiti saggi di accumulo di rodamina 123 nelle cellule RPTEC/TERT1 per identificare i profili di inibizione di 14 farmaci. Tra questi farmaci, la ciclosporina A, il ketoconazolo e il verapamil sono stati scelti come potenti inibitori della P-gp. Questi inibitori sono stati ampiamente caratterizzati per il loro significativo potenziale inibitorio della P-gp, che porta alla modulazione del trasporto sia della digossina che della rodamina 123 [27, 29, 30]. Come previsto, questi farmaci hanno causato la più alta ritenzione di rodamina 123 nelle cellule RPTEC/TERT1. Al contrario, non è stato osservato alcun aumento della ritenzione di R123 con warfarin, che è stato utilizzato come controllo negativo, confermando l'affidabilità del modello RPTEC/TERT1. È interessante notare che tra tutti i farmaci testati, i DOAC, inclusi dabigatran etexilato, apixaban e rivaroxaban, hanno causato un netto aumento della ritenzione di R123, anche se non erano stati precedentemente caratterizzati come inibitori, ma solo substrati della P-gp [31, 32]. Questa osservazione può essere dovuta all'esistenza della cosiddetta inibizione "competitiva", in cui i farmaci possono interagire con gli stessi siti di legame sulla P-gp. I siti più ben caratterizzati per la P-gp sono il sito H (per legare Hoechst 33342) e il sito R (per legare la rodamina 123). Tuttavia, molti altri siti di legame del farmaco sconosciuti potrebbero svolgere un ruolo in queste interazioni, il che potrebbe spiegare i diversi effetti dei DOAC sull'accumulo di R123 [33, 34]. L'inibizione della P-gp osservata per un dato farmaco dipende quindi dal substrato utilizzato durante gli studi in vitro [28, 35]. L'uso di diversi substrati della P-gp che interagiscono con diversi siti di legame dei farmaci dovrebbe quindi essere considerato per descrivere accuratamente le presunte potenze inibitorie della P-gp dei farmaci. È anche interessante notare che diverse condizioni dello screening della rodamina 123 sono state eseguite anche nelle cellule Caco-2 per confrontare le cellule RPTEC/TERT1 con un modello di riferimento negli studi sul trasporto di farmaci. Come previsto, ciclosporina A, verapamil e nilotinib hanno causato i maggiori aumenti della ritenzione di rodamina. Gli stessi profili di inibizione sono stati osservati con entrambe le cellule Caco-2 e RPTEC/TERT1. Tuttavia, gli aumenti della ritenzione di rodamina 123 generati dalle interazioni nel modello Caco-2 erano maggiori di quelli osservati nelle cellule RPTEC/TERT1, suggerendo una potenziale differenza nell'espressione della glicoproteina P tra i modelli Pertanto, al momento studio, un secondo metodo è stato utilizzato per valutare e confermare la potenziale inibizione della P-gp da parte dei farmaci.
CISTANCHE MIGLIORERA' LA DIALISI RENALE/RENALE
Sulla base del test di accumulo di rodamina 123, sono stati scelti quattro farmaci per determinare i loro effetti dipendenti dalla concentrazione sull'accumulo intracellulare di apixaban e rivaroxaban. È stato dimostrato che la P-gp svolge un ruolo principale nell'efflusso di apixaban e rivaroxaban [32, 36]. Sono stati quindi valutati i valori IC50 di nilotinib, crizotinib e ketoconazolo, con i DOAC selezionati come farmaci "vittima". Per quanto ne sappiamo, questo studio è il primo a eseguire studi sull'accumulo intracellulare con DOAC nell'uomorenalecellule. I valori di IC50 ottenuti per nilotinib e crizotinib erano in accordo con i loro profili di inibizione ottenuti dal saggio di accumulo della rodamina 123. Nilotinib, che ha causato un forte aumento della ritenzione di R123, ha presentato il valore di IC50 più basso per i due DOAC, confermando il suo alto potenziale di inibizione. Questo risultato è anche in accordo con uno studio precedente che ha mostrato un aumento dipendente dalla concentrazione dell'accumulo intracellulare di [3H]-paclitaxel nelle cellule trasfettate con MDR1-, suggerendo che ha un profilo inibitore [37]. Per crizotinib, il test R123 ha mostrato un potenziale inibitorio moderato, con un aumento minore della ritenzione di R123 rispetto a quello causato da nilotinib. Questa osservazione è supportata da uno studio precedente in cui crizotinib ha aumentato l'accumulo intracellulare di R123 e doxorubicina nelle cellule trasfettate con MDR1-[38]. Questo risultato è anche in accordo con i valori di IC50 determinati con DOAC, che erano superiori ai valori corrispondenti per nilotinib, confermando il suo profilo di inibizione moderata. Tuttavia, è interessante notare che una concentrazione di 10 µM di nilotinib o crizotinib non ha causato gli stessi aumenti nella ritenzione di rodamina 123 e DOAC. Nello screening della rodamina, nilotinib ha aumentato la ritenzione del substrato di circa il 71%, mentre era di circa il 40% per i DOAC. Al contrario, crizotinib ha causato un piccolo aumento della ritenzione di rodamina (23%) ma maggiori aumenti della ritenzione di DOAC (circa il 50%) alla stessa concentrazione. Come discusso in precedenza, questa osservazione potrebbe essere spiegata dalle differenze nei siti di legame su P-gp. È noto che molti farmaci interagiscono e competono con il sito di legame H piuttosto che con il sito di legame R (che è dove si lega la rodamina 123) e viceversa [39]. È interessante notare che il ketoconazolo, noto per essere un potente inibitore della P-gp, ha causato un aumento leggermente minore della ritenzione di rodamina 123 rispetto a nilotinib (rispettivamente 66% contro 71%). Tuttavia, un valore simile è stato osservato con le cellule Caco-2, dove la presenza di ketoconazolo ha causato un aumento del 60 percento nell'accumulo di R123 [40]. Anche l'accumulo intracellulare di DOAC per la determinazione dei valori di IC50 ha mostrato valori più elevati rispetto a nilotinib e crizotinib. È interessante notare che la maggior parte dei valori IC50 trovati nei modelli LLC-PK1 o Caco-2 che utilizzano la digossina come substrato della P-gp erano compresi tra 3 e 4 µM per il ketoconazolo [41, 42]. Questi valori sono abbastanza diversi da quelli trovati nel presente studio (16,5 µM e 16,9 µM con apixaban e rivaroxaban, rispettivamente). Questa osservazione conferma che le scelte del substrato e del modello utilizzato sono influenze cruciali nella determinazione del potenziale inibitorio della P-gp. Inoltre, uno studio recente ha riportato che i livelli di espressione dei trasportatori ABC in modelli cellulari in vitro hanno un impatto sui saggi di trasporto di farmaci e quindi sulla valutazione delle DDI relative alla P-gp [43]. Infatti, la determinazione dei valori di IC50 per verapamil utilizzando rivaroxaban come substrato della P-gp ha rivelato un'eterogeneità tra i modelli cellulari MDCKMDR1 e Caco{53}}, con valori di IC50 rispettivamente di 6,94 µM e 21,2 µM [43]. Inoltre, in questo studio è stato studiato l'effetto concentrazione-dipendente di nilotinib sull'accumulo intracellulare di apixaban e rivaroxaban nelle cellule Caco-2. È interessante notare che i valori di IC50 per nilotinib erano significativamente più alti nelle cellule Caco-2 rispetto alle cellule RPTEC/TERT1. Questa osservazione può essere spiegata dalla differenza nell'espressione di P-gp tra questi modelli. Inoltre, è noto che la distribuzione della P-gp dipende dal tessuto considerato. Fallon et al. dimostrato che il livello di P-gp era più alto inreneche nel tessuto epatico nell'uomo [45]. D'altra parte, il livello di espressione della P-gp sembra essere più alto nell'intestino che nell'intestinorenetessuto [46]. L'uso di cellule umane come il modello RPTEC/TERT1, che non sovraesprimono i trasportatori, potrebbe quindi fornire dati aggiuntivi. Questi dati potrebbero essere utilizzati e imputati nella modellazione farmacocinetica (PBPK) su base fisiologica integrando diversi parametri, come la quantità di P-gp in un tessuto o un modello in vitro o valori di IC50.
Sebbene i valori di IC50 rilevati per il ketoconazolo nel modello RPTEC/TERT1 fossero superiori a quelli osservati in letteratura, il rapporto [I1]/IC50, convalidato come predittore di potenziali DDI clinicamente rilevanti per i farmaci somministrati per via orale, ha mostrato valori elevati che erano al di sopra della soglia di 0,1 definita dalla FDA. Questo risultato è in accordo con uno studio clinico che ha mostrato un duplice aumento dell'esposizione ad apixaban con la co-somministrazione di ketoconazolo [44]. Presi insieme, tutti questi risultati dimostrano che il modello RPTEC/TERT1 è uno strumento promettente per valutare il potenziale inibitorio della P-gp.
CISTANCHE MIGLIORA IL DOLORE RENALE/RENALE
Conclusione
Il nostro studio ha dimostrato che l'applicazione del modello RPTEC/TERT1 è conveniente per valutare i potenziali inibitori della P-gp di varie classi di farmaci. I saggi di accumulo di rodamina 123 hanno consentito di eseguire uno screening iniziale del farmaco. Tuttavia, i potenziali inibitori della P-gp dei farmaci che non interagiscono con il sito R della P-gp devono essere studiati anche utilizzando substrati aggiuntivi per confermare le previsioni. I valori di IC50 determinati dall'accumulo intracellulare di apixaban e rivaroxaban sono in accordo con i profili di inibizione osservati con rodamina 123. Inoltre, l'uso di ketoconazolo e warfarin rispettivamente come forte inibitore e non inibitore della P-gp, ha confermato la affidabilità del modello RPTEC/TER1 quando viene utilizzato per ottenere dati in vitro sui potenziali inibitori dei farmaci verso la P-gp. Infine, un confronto dei risultati ottenuti utilizzando il modello RPTEC/TERT1 con quelli ottenuti utilizzando cellule Caco-2 ha evidenziato l'importanza di condurre studi in vitro in diversi modelli cellulari per confermare il profilo inibitorio per un determinato farmaco.