La somministrazione in vivo di consorzi batterici intestinali replica i metabotipi A e B dell'urolitina in un modello di ratto non produttore di urolitinaⅡ

Risultati

Analisi della specificità e della sensibilità dei primer e della sonda progettati per Ellagibacter ed Enterocloster

La specificità dei primer e della sonda Ellagibacter ed Enterocloster è stata confermata caricando le relative sequenze sul programma di allineamento delle sequenze ProbeMatch.31 Sono mostrati i risultatinelle Tabelle 1S e 2S.† Successivamente, la specificità dei primer e della sonda è stata verificata mediante qPCR utilizzando le condizioni di reazione ottimizzate descritte nella sezione Materiali e metodi. Sono state testate specie batteriche rappresentative delle famiglie Eggerthellaceae e Lachnospiraceae con la maggiore somiglianza con Ellagibacter ed Enterocloster nella sequenza del gene rRNA 16S oltre ad altre specie strettamente correlate frequentemente rilevate nell'intestino umano (Tabelle 1S e 2S†). 2 mostra i grafici di amplificazione corrispondenti alle curve di quantificazione standard.

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I valori CT sono stati tracciati rispetto alla concentrazione batterica (Co) come equivalenti genomici/reazione log 10 (6,25 × 10−6 ng, per genoma aploide). La pendenza della curva di regressione lineare, calcolata utilizzando il DNA genomico, era -3,78 e il valore R2 era maggiore di 0,99. Per quanto riguarda la sensibilità del sistema qPCR, erano necessari 1,5 equivalenti genomici come minimo per una reazione positiva utilizzando la modalità TaqMan. I valori CT ottenuti con la curva di calibrazione di E. isourolithinifaciens ed E. imbullonati variavano da 15,5±0,7 a 37,8±0,7, mentre per gli altri ceppi testati non è stata rilevata alcuna amplificazione del DNA.

Con questo metodo (qPCR) è stata effettuata la quantificazione di Ellagibacter ed Enterocloster nei campioni fecali dei ratti, considerando la media di tre replicati. I risultati sono stati espressi come log 10 batteri per g di feci e confrontati con i valori di abbondanza relativa ottenuti mediante sequenziamento dell'rRNA 16S. Abbiamo osservato una correlazione positiva tra i risultati ottenuti con entrambi i metodi in Ellagibacter (r=0.660, p < 0,001) ed Enterocloster (r=0.459, p< 0.001) (data not shown).

Effetto dei consorzi batterici somministrati per via orale sulla produzione in vivo di urolitine

L'analisi dell'Uro nelle feci ha mostrato che inizialmente (T{{0}}), i ratti non producevano Uros dopo aver ingerito la polvere di EA (Fig. 3A–C). Tuttavia, dopo la somministrazione dei consorzi batterici A (Fig. 3A ) e B (Fig. 3B), i ratti sono diventati capaci di produrre Uros. Durante le prime tre settimane, quando i ratti dei gruppi A e B hanno ingerito solo polvere di EA, la concentrazione di Uro (intervallo:0–1,43 µg g− 1) e quello del loro precursore EA (intervallo: 0,07–4,54 µg g−1) nelle feci era basso. Tuttavia, dal giorno 21, quando è iniziato il consumo di noci come seconda fonte di EA, si è verificato un aumento molto significativo della produzione di EA fecale (Fig. 3A–C) e di Uro nei gruppi A (Fig. 3A) e B (Fig. 3B ).

Inoltre, sono state osservate differenze nel profilo dell'Uro tra i gruppi A e B. Nel gruppo A, Uro-C, Uro-M6, Uro-M7 fecali e il metabolita finale Uro-A erano predominanti. Al contrario, nel gruppo B, erano presenti i tre Uros finali (Uro-A, UroB e IsoUro-A), mentre gli intermedi erano scarsi. Tuttavia, nel gruppo B è stata rilevata una concentrazione fecale più elevata dell'Uro-G recentemente descritto rispetto al gruppo A. Inoltre, la concentrazione di Uro-B era inferiore a quella di Uro-A e IsoUro-A nel gruppo B. Inoltre, Uro-A e IsoUro-A, ma non Uro-B, sono stati prodotti in tutti i ratti del gruppo B (Fig. 3B). Quando le noci sono state aggiunte alla dieta dei ratti di controllo (gruppo C) il giorno 21, è stata osservata anche una maggiore concentrazione fecale di EA. rispetto a prima del consumo di noci, dove la concentrazione di EA fecale era molto bassa (Fig. 3C). Tuttavia, né l'assunzione di polvere di EA né il consumo di noci hanno promosso la produzione di Uros nell'intestino dei ratti di controllo (cioè senza consorzi batterici).

Colonizzazione intestinale di batteri somministrati per via orale Inizialmente, prima che i ratti dei gruppi A e B iniziassero a consumare i consorzi batterici, Gordonibacter o Ellagibacter erano sotto il limite di rilevamento nei campioni fecali quando l'analisi di sequenziamento metagenomico veniva eseguita utilizzando la piattaforma MiSeq-Illumina (Fig. 3D–F ). Quando è stata utilizzata la qPCR,I livelli di Gordonibacter nei ratti erano bassi (<5.8 log bacteria per g faeces), and Ellagibacter levels were under the limit of detection (data not shown). In contrast, Enterocloster was detected using the MiSeq-Illumina and qPCR in the faeces of rats from all groups (A, B, and C) at the baseline (Fig. 3D–F). 

L'abbondanza relativa (media ± DS) di Enterocloster nei gruppi A, B e C era {{0}}.03 ± 0.02, {{10 }},04 ± 0,06 e 0,13 ± 0,17%, rispettivamente, ma senza differenze significative (p=0,570). La somministrazione dei consorzi batterici A e B ha comportato la comparsa e il graduale aumento di Gordonibacter ed Ellagibacter rispettivamente nelle feci dei corrispondenti gruppi A e B (Fig. 3D ed E). Inoltre, i livelli fecali di Enterocloster sono aumentati durante lo studio nei gruppi A e B (Fig. 3D ed E).

Tuttavia, l'analisi LEfSe ha mostrato scarse differenze in altri gruppi batterici intestinali quando i dati di sequenziamento metagenomico dei gruppi A e B sono stati confrontati con quelli del gruppo di controllo (Fig. 4A e B). È interessante notare che nei gruppi A è stata osservata una riduzione del genere Streptococcus e della famiglia Streptococcaceae. e B rispetto al gruppo di controllo (Fig. 4A e B). Cinque giorni dopo l'interruzione della somministrazione orale dei consorzi batterici (data di fine dello studio), è stata rilevata una riduzione dell'abbondanza di Ellagibacter ed Enterocloster nel gruppo B, che ha comportato anche una significativa diminuzione della produzione di Uro (Fig. 3B ed E). Nel gruppo A è stata osservata anche una riduzione dell'abbondanza di Gordonibacter ma non di Enterocloster (Fig. 3A), che ha comportato una diminuzione della concentrazione di Uro ma è stata meno pronunciata rispetto al gruppo B (Fig. 3D ed E). Nel gruppo di controllo, l'Ellagibacter è rimasto sotto il limite di rilevamento durante tutto lo studio, mentre l'Enterocloster e il Gordonibacter sono rimasti a livelli molto bassi (Fig. 3F).

Studio della tossicità dei batteri intestinali somministrati per via orale

Sono stati studiati i potenziali effetti collaterali derivanti dall'ingestione dei consorzi batterici. Non sono stati osservati effetti avversi sulla crescita, sull'aumento di peso, sull'assunzione di cibo e sugli organi vitali dopo 4 settimane di somministrazione orale mediante sonda gastrica di consorzi batterici nei ratti dei gruppi A e B rispetto al gruppo di controllo. Tuttavia, i ratti maschi hanno guadagnato 107,4 ± 2,4 g, mentre le femmine hanno guadagnato menopeso (25,7 ± 5 g) alla fine dello studio senza differenze rispetto al gruppo di controllo. Il consumo di cibo per gabbia è stato di 63,1 ± 1,4 g per i ratti maschi e di 33,8 ± 1,8 g per i ratti femmine. Tuttavia, l'assunzione di acqua è stata di 136,1 ± 37,2 g e 76,0 ± 12,6 g, rispettivamente per i ratti maschi e femmine per gabbia .

Sono state osservate differenze ematologiche tra maschi e femmine in alcune variabili, come la distribuzione degli eritrociti (RDW, p {{0}}.005), i leucociti (p=0.005), l'ampiezza della distribuzione piastrinica (PDW, p =0.005) e contenuto di emoglobina dei reticolociti (CHr, p=0.013) (Tabella 2). Tuttavia, non è stata osservata alcuna differenza per nessuna variabile tra i gruppi che hanno consumato i consorzi batterici (gruppi A e B) e il gruppo di controllo (gruppo C). Sono stati analizzati anche i valori biochimici e sono state rilevate differenze solo tra maschi e femmine in alcune variabili quali l'indice della creatinina (p < 0,001), il fosforo (p=0,007), la fosfatasi alcalina (ALP) (p {{13 }}.003) e tiroxina (T4) (p=0.002)(Tabella 3). Tuttavia, non è stata osservata alcuna differenza per nessuna delle variabili tra i gruppi che hanno consumato i consorzi batterici (gruppi A e B) e il gruppo di controllo (gruppo C).

Medicina naturale a base di erbe per alleviare la stitichezza-cistanche

Cistanche è un genere di piante parassite che appartiene alla famiglia delle Orobanchaceae. Queste piante sono note per le loro proprietà medicinali e vengono utilizzate da secoli nella medicina tradizionale cinese (MTC). Le specie Cistanche si trovano prevalentemente nelle regioni aride e desertiche della Cina, della Mongolia e di altre parti dell'Asia centrale. Le piante di Cistanche sono caratterizzate dai loro steli carnosi e giallastri e sono molto apprezzate per i loro potenziali benefici per la salute. Nella MTC, si ritiene che la Cistanche abbia proprietà toniche ed è comunemente usata per nutrire i reni, aumentare la vitalità e supportare la funzione sessuale. Viene anche utilizzato per affrontare i problemi di invecchiamento, affaticamento e benessere generale. Sebbene la Cistanche abbia una lunga storia di utilizzo nella medicina tradizionale, la ricerca scientifica sulla sua efficacia e sicurezza è continua e limitata. Tuttavia, contiene vari composti bioattivi come glicosidi feniletanoidi, iridoidi, lignani e polisaccaridi, che possono contribuire ai suoi effetti medicinali.

Wecistanche'spolvere di cistanza, compresse di cistanza, capsule di cistanzae altri prodotti vengono sviluppati utilizzandodesertocistanocome materie prime, che hanno tutte un buon effetto sull'alleviare la stitichezza. Il meccanismo specifico è il seguente: si ritiene che la Cistanche abbia potenziali benefici per alleviare la stitichezza in base al suo uso tradizionale e ad alcuni composti che contiene. Sebbene la ricerca scientifica specifica sugli effetti della Cistanche sulla stitichezza sia limitata, si ritiene che abbia molteplici meccanismi che potrebbero contribuire al suo potenziale per alleviare la stitichezza. Effetto lassativo:Cistancheè stato a lungo utilizzato nella medicina tradizionale cinese come rimedio contro la stitichezza. Si ritiene che abbia un lieve effetto lassativo, che può aiutare a favorire i movimenti intestinali e indurre la stitichezza. Questo effetto può essere attribuito a vari composti presenti nelle Cistanche, come i glicosidi feniletanoidi e i polisaccaridi. Inumidire l'intestino: in base all'uso tradizionale, si ritiene che la Cistanche abbia proprietà idratanti, mirate specificamente all'intestino. Promuovere l'idratazione e la lubrificazione dell'intestino può aiutare ad ammorbidire gli organi e facilitare il passaggio, alleviando così la stitichezza. Effetto antinfiammatorio: la stitichezza può talvolta essere associata ad un'infiammazione del tratto digestivo. Cistanche contiene alcuni composti, tra cui glicosidi feniletanoidi e lignani, che si ritiene abbiano proprietà antinfiammatorie. Riducendo l’infiammazione nell’intestino, può aiutare a migliorare la regolarità del movimento intestinale e ad alleviare la stitichezza.